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1、中南民族大学 硕士学位论文 红曲霉As 3.782与海洋细菌00856的发酵优化及产物研究 姓名：程鹏飞 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：熊海容 2011-05 中南民族大学硕士学位论文 I 摘 要 微生物次生代谢产物有着丰富的结构多样性和功能多样性。对微生物次生代 谢产物进行研究，有着重要的意义。本论文主要对红曲霉菌株和海洋细菌次生代 谢物的条件优化及其产物进行研究。 红曲霉以能产生大量红曲色素而著称，具有重要的工业、药用等价值。本文 应用红曲霉Monascus anka As 3.782（CCTCC编号:AF93208）菌株，探索其固态发 酵产红曲色素的最佳基质初
2、始含水量，结果表明：含水量为约30%最好；通过正交 试验优化其液态发酵产红曲色素的培养基，大米粉9%、NaNO3 3%、 KH2PO4 0.3%、 MgSO4 0.1%，黄豆粉0.5%，pH 4.0时的培养基配方产红曲色价最高，达77.3 U/mL； 在紫外诱变距离20 cm诱导3 min的条件下筛选优良菌株， 其固态发酵产红曲色价可 达1156.667 U/mL，是原始出发株360.667 U/mL的3倍多，其液态发酵产红曲色价比 原始出发株提高了2倍。 海洋细菌具有产生多种新颖独特的生物抑菌物质的潜力，有良好的研究开发 前景。 本文同时对从海南三亚湾海域分离到的一株南海柳珊瑚共附生微生物菌
3、株 （中 科院南海海洋研究所菌种编号 00856）进行了分类，并对其产抑菌物质的特性进行 了初步研究。依据形态及 16S rDNA基因序列分析，将海洋细菌 00856 归于芽孢杆 菌属(Bacillus sp.SCSIO 00856)。 利用所选择的细菌培养基， 在一定培养条件 （28， pH 7.0）下，该菌株的次生代谢产物对酿酒酵母、金黄色葡萄球菌均有一定程度的 抑制活性。同时，该菌的生长曲线和产抑菌物质的培养时间在本文中也得到了阐 述。利用滤纸片法测定产物活性，以抑菌物质高产为目标，利用正交试验的方法 优化了培养基的配比。结果表明，以酿酒酵母作为指示菌，在发酵培养 6 d，海盐 素 26
4、.25 g/L，葡萄糖 12 g/L，酵母浸粉 3 g/L，磷酸二氢钾 3 g/L，麦芽浸粉 5 g/L 的条件下，海洋细菌 00856 产抑菌物质最多。 关键词：红曲霉；红曲色素；海洋细菌 00856；抑菌物质 红曲霉 As 3.782 与海洋细菌 00856 的发酵优化及产物研究 II ABSTRACT Microbial secondary metabolites from microbial organisms have a wealth of structural and functional diversity, so it is of significance to conduc
5、t the study about secondary metabolites. This thesis focuses on the research of the optimal conditions to produce the secondary metabolites from Monascus strains and marine bacteria and their product. Monascus is well known for its largely monascus pigments，the industrial and medical value and so on
6、 from the metabolites are much important. Initial water content of solid- state media was firstly optimized to improve the monascus pigment porduction in Monascus anka As 3.782 strain. The result indicated that the optimum water ratio was 30% approximately. Further orthogonal experiment design showe
7、d that the optimum liquid media with the components of 9% rice powder, 3% NaNO3, 0.3% KH2PO4, 0.1% MgSO4 and 0.5% soybean powder at pH 4.0 will produce high level of monascus pigment color value, which could reach 77.3 U/mL. The good mutated strain was screened at the distanece of 20 cm ultraviolet（
8、UV）light irradiation in 3 min duration. The results indicated that the production of monascus pigment in solid- state fermentation could reach 1156.667 U/mL, with over three times of the pigment produciton of original strain. In the liquid fermentation, color value in the mutated strains increased t
9、wo times of their parent strain pigment production. Marine bacteria are capable of producing a lot of unique bioactive substances, which have bright prospect in research and development. At the same time, a marine gorgonian- symbiotic bacterium (SCSIO No. 00856) was taxonomically identified by morph
10、ological analysis and 16S rDNA gene sequencing, and the bioactive metabolites production was further studied. This strain was classified as Bacillus sp., and its bioactive metabolites could inhibit the growth of Saccharomyces cerevisias and Staphylococcus aureus when cultured in the selected cultiva
11、tion medium (pH 7.0) at 28. The growth curve of this strain and the fermentation time for antibacterial metabolites was also investigated. With the filter paper diffusion method and orthogonal experiment, the culture medium was optimized for producing the highest bioactive metabolites. Taking Saccha
12、romyces cerevisias as indicator bacteria, the optimum medium was: sea salt 26.25 g/L, glucose 12 g/L, yeast extract 3 g/L, monopotassium phosphate 3 g/L, malt extract 5 g/L, and the best fermentation time was 6 days. Key Words: Monascus； monascus pigment； marine bacterium 00856； antibacterial substa
13、nce 中南民族大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。 本人授权中南民族大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检
14、索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 1、保密?，在_年解密后适用本授权书。 2、不保密?。 （请在以上相应方框内打“ v” ） 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 中南民族大学硕士学位论文 1 第 1 章 绪论 微生物的代谢物是微生物进入生长稳定期后的产品，而微生物的次生代谢物 则是以初生代谢物作为前体，通过次生代谢途径合成的结构复杂的各类化合物。 它们种类繁多、分子结构复杂、代谢途径独特、生理功能不很明确，与人类的保 健工作和医药生产等有密切关系。同时，微生物次生代谢产物还具有生理活性显 著、成药潜力大等特性，其关键代谢
15、过程和主要功能基因是组合生物合成技术的 重要基础。对一些包括红曲霉真菌或海洋细菌等在内的微生物进行次生代谢物的 产条件及其特性研究，是一项基础性而又极为重要的工作。 1.1 红曲霉和红曲色素 1.1.1 红曲霉及其分类 红曲霉又称红曲，以能产生大量天然红曲色素而备受关注，属于真菌界，腐 生真菌门，红曲科，红曲霉属1,2。该属在我国报道的有 17 种，日本有 40 多种3。 Hawskworth和 Pitt4通过对红曲霉的深入研究，并按照其不同培养形态、菌丝生长 速度及子囊孢子形态大小等特征，将红曲霉分为以下三类：Monascus rubber、 Monascus pilosus和 Monasc
16、us purpureus。目前已有关于通过基因组分析技术对红 曲霉菌种进行分类的报道5。 红曲霉主要分布于土壤、树木等处。红曲菌落初期主要呈白色，成熟后逐渐 变为淡红色、紫色或黑色。红曲霉是腐生菌，嗜酸，尤其是乳酸，耐高温，其菌 落结构呈绒毡状或皮膜状6。应用于食品工业生产的主要种类有红曲霉（M.anka） 、 紫红曲霉（M.purpureus） 、烟色红曲霉（M.fuliginosus）和红色红曲霉（M.ruber） 等7,8。 1.1.2 红曲色素 红曲色素主要以红曲米为原料，采用现代生物技术方法发酵而成的天然着色 剂，为暗红色或红色粉末。其成份主要有红斑素、红曲素、红曲红素、红曲 黄素、红斑胺、红曲红胺这六种9- 11。红曲色素在有机溶剂如乙醇、丙二醇及其 水溶液中易于溶解，当介质的 pH 低于 4.0 时，红曲色素不易溶解。红曲色素在 pH 红曲霉 As 3.782 与海洋细菌 00856 的发酵优化及产物研究 2 3- 11 的介质中稳定性较好；而当 pH 大于 12 时，红曲色素不稳定，易于溶解
