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1、细胞周期素E在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义 【摘要】 目的： 探讨细胞周期素E(cyclin E)在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义。 方法： 收集武汉大学人民医院及武汉大学中南医院存档甲状腺乳头状癌蜡块40例，另取5例瘤旁组织为对照组。将以上组织进行免疫组织化学实验,检测cyclin E在各组中的表达, 利用HPIAS2000图像分析系统测定cyclin E在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：cyclin E在甲状腺乳头状癌组织中呈高表达,而在瘤旁组织中呈低表达。图像分析结果显示，甲状腺乳头状癌组与瘤旁组织之间cyclin E的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P
2、0.05)。结论：cyclin E 在甲状腺乳头状癌的生物学行为中起了重要作用,cyclin E 的高表达可做为甲状腺乳头状癌的一个新的预后指标。 【关键词】 细胞周期素E(cyclin E) 甲状腺乳头状癌 免疫组织化学 甲状腺是人体重要的内分泌腺，它在机体新陈代谢方面具有重要地位，是内分泌系统中发病率最高的器官。甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤之一，约占全身恶性肿瘤的1.5%，男女比约为1:2.53。与一般恶性肿瘤好发于老年人不同，甲状腺癌多发于青壮年，平均年龄约40岁，统计显示近年来甲状腺癌的发病率呈增高趋势1，2。分化型甲状腺癌占所有甲状腺癌的90% , 包括乳头状甲状腺癌(PTC)
3、和滤泡状甲状腺癌( FTC)。甲状腺未分化癌较为少见, 但恶性程度高、预后差。 细胞周期素E (cyclin E) 是细胞周期重要的调节因子,cyclin E 与特定的细胞周期依赖性激酶( cyclin dependent kinases ,CDKs) 构成复合体,可以使底物磷酸化,启动DNA的合成3，4, CDK 抑制蛋白( cyclindependent kinase inhibitor proteins ,CKIs) 能够抑制cyclin E 的活性。不同的物质可以通过与CKIs 之间直接或间接的相互作用影响cyclin E 的表达,这些相互作用对阐明肿瘤发生的机制是非常重要的,而且可以
4、为大量常见的肿瘤提供预后的信息5。 但有关cyclin E在甲状腺乳头状癌的研究报道尚少。我们应用免疫组织化学方法观察了cyclin E在甲状腺乳头状癌组织中的表达,并采用图像分析系统测定cyclin E在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率，旨在探讨cyclin E 在甲状腺乳头状癌组织中的生物学行为及临床意义。 1 材料与方法 1.1 材料来源及分组 收集武汉大学人民医院及武汉大学中南医院存档甲状腺乳头状癌蜡块40例。其中，男12例, 女28例，年龄2368 岁。甲状腺癌组患者术前均未做放、化疗。另取5例瘤旁组织为对照组。 1.2 主要试剂 浓缩型鼠抗人Cyclin E单克隆抗体 (
5、北京中山生物技术有限公司) ；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(北京中山生物技术有限公司) ；显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。 1.3 主要仪器 YWY781型医用微波仪（250W，50 Hz），浙江临安电子器材厂生产；家用高压锅。 1.4 常规HE染色 4%多聚甲醛固定、包埋、石蜡切片、HE染色。 1.5 免疫组织化学SP法检测细胞周期素E相关抗原 主要步骤： 组织切片5m，常规脱蜡至水，蒸馏水洗； 3%过氧化氢，37孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗45min； 细胞周期素D1采用微波抗原修复（3档，10 min）， PBS洗45min； 正常羊血
6、清37孵育10 min以减少非特异性反应； 一抗37孵育1h，PBS洗45min； 生物素标记的二抗，37孵育10 min，PBS洗45min； 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37孵育10 min，PBS洗45min； DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应； 苏木精复染，脱水，透明，封片。 用PBS代替一抗作为阴性对照。 1.6 免疫组织化学结果判断 细胞周期素E以胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。 采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对细胞周期素E的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠
7、的高倍镜视野（400），测定每个视野下细胞周期素E的阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积100）。 1.7 统计学处理 对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准为0.05。 2 结果 2.1 HE染色 癌旁组织中可见甲状腺滤泡呈圆形或椭圆形，滤泡上皮为单层立方或单层柱状，滤泡腔内可见红色胶体，滤泡间可见较多的结缔组织和丰富的毛细血管，结构较清晰。甲状腺乳头状癌组织内可见分化良好的柱状上皮
8、呈乳头状突起呈分支状，中心有纤维血管轴心，表面被覆瘤细胞。瘤细胞核大，排列紊乱，极向消失，细胞核可见核重叠、核沟、核内假包涵体。乳头间质因水肿而显得粗大。 2.2 细胞周期素E的表达 癌旁组织中无棕黄色颗粒，细胞周期素E呈阴性表达；甲状腺乳头状癌组织内可见密集分布的棕黄色颗粒，细胞周期素E表达呈强阳性。图像分析结果显示：癌旁组织和甲状腺乳头状癌组织中的平均光密度分别为；0.05480.0120、0.24620.0376。癌旁组织和甲状腺乳头状癌癌组织中阳性面积率分别为0.10820.0132、0.32560.0258。癌旁组织和甲状腺乳头状癌组织中之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(
9、P0.05)。见表1。表1 癌旁组织与甲状腺乳头状癌组织中细胞周期素E表达的平均光密度和阳性面积率（略）注：* 癌旁组织与甲状腺癌比较，P0.05 。 3 讨论 甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的。主要组织学类型包括乳头状癌、滤泡性癌、未分化癌以及髓样癌。近年来，我国甲状腺癌的发病率呈明显上升的趋势。甲状腺癌仅占全身恶性肿瘤的1.5%左右，但却是最常见的内分泌系统恶性肿瘤6。统计显示近年来甲状腺癌的发病率呈增高趋势。大多数甲状腺癌恶性低，预后良好。早期诊断和及时正确的治疗是提高生存率的关键。 根据起源细胞的不同，可将甲状腺癌分为滤泡上皮细胞癌(乳头状癌、滤泡状癌及未分化癌)
10、和滤泡旁细胞癌(即髓样癌)两大类。乳头状癌和滤泡状癌临床上常见，预后较好，两者又合称分化型甲状腺癌(DTC) 7。未分化癌临床最少见，恶性程度高，患者5年生存率最低。髓样癌可分为家族型和散发型两种，因肿瘤结节可分泌降钙素、5轻色胺、前列腺素、肾素和血管活性肠肤等活性物质，临床上患者可出现腹泻、心悸、头晕等表现8。 肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程,涉及到多种因素。近年来,越来越多的学者注意到细胞生长周期的失调在肿瘤的发生中起重要作用,认为肿瘤的发生实质上是一种细胞周期调控上的失控,异常产生了多种生长因子,信号传导途径失常所导致的细胞失控样异常生长9，10。这个过程产生的生长因子、激素、各种蛋白
11、、遗传物质以及DNA 的代谢,都是通过细胞周期来实现和调控的。同正常细胞一样,肿瘤细胞生长也须经历细胞周期的各个时段,但生长中的癌细胞以极快的速度通过细胞周期,其中细胞周期素起了重要作用。近年来的研究表明,细胞周期素E与肿瘤的发生发展关系密切11，12。 细胞周期素E (cyclin E) 是细胞周期重要的调节因子,cyclin E 与特定的细胞周期依赖性激酶( cyclin dependent kinases ,CDKs) 构成复合体,可以使底物磷酸化,启动DNA的合成, CDK 抑制蛋白( cyclindependent kinase inhibitor proteins ,CKIs) 能
12、够抑制cyclin E 的活性。不同的物质可以通过与CKIs 之间直接或间接的相互作用影响cyclin E 的表达,这些相互作用对阐明肿瘤发生的机制是非常重要的,而且可以为大量常见的肿瘤提供预后的信息。 我们的实验结果显示: cyclin E在甲状腺乳头状癌组织中呈高表达,而在瘤旁组织中呈低表达。cyclin E 是细胞周期中重要的调节因子,它在甲状腺乳头状癌组织中呈高表达,而在瘤旁组织中呈低表达 ,表明cyclin E 在甲状腺乳头状癌的生物学行为中起了重要作用, 也能为大量常见的肿瘤提供预后信息。但它导致肿瘤的机制仍不十分清楚,尚有许多问题有待解决。鉴于cyclin E 在细胞周期R 点的
13、核心调控作用,它有望成为未来癌症治疗的靶蛋白及判断肿瘤预后的标志物。 【参考文献】 1 Hegedus L. Clinical practice:the thyroid nodule. N Engl J Med,2004,351: 17641771. 2 关海霞, 单忠艳, 米小轶, 等. 普通食盐碘化前后甲状腺癌发病变化的11 年病理资料分析. 中国医科大学学报,2006,35:284285. 3 Donnellan R ,Kleinschmidt I ,Chetty R.Cyclin E immunoexpression in breast ductal cancinoma : patho
14、logic correlations and prognostic implications1Hum Pathol.2001，32 (1) :8991. 4 Datta MW, Renshaw AA , Dutta A , et al.Evaluation of cyclin expression in testicular germ cell tumors : cyclin E correlates with tumor type , advanced clinical stage , and pulmonary metastasis1Mod Pathol.2000，13 (6) :6676
15、71. 5 Tamiya T , Mizumatsu S , Ono Y, et al1High cyclinE/ low p27kipl expression is associated with poor grognosis in astrocytomas1Acta Neuropathol.2001，101 (40) :334. 6 Vasko V, FerrandM, Di Cristofaro J, et al. Specific pattern of RAS oncogene mutations in follicular thyroid tumors. J Clin Endocri
16、nol Metab,2003,88:27452752. 7 彭年春, 郭晓蕙, 袁振芳,等.CD26及半乳糖凝集素3免疫组织化学染色在甲状腺癌诊断中的应用.中华内分泌代谢杂志, 2006, 22:178182. 8 江昌新, 王玲, 谭郁彬, 等. 免疫学标记在甲状腺细针抽吸细胞学诊断中的应用. 中华内分泌代谢杂志, 2005,21: 522526. 9 Goodwin EC ,Di Maio D. Repression of human papillomavirus oncogenes in HeLa cervical carcinoma cell causes the orderly reactivation of dormant tumor suppressor pathways . Proc Natl Acad Sci USA ,2000 ,97 (23) :1251312518. 10 Bae DS ,Cho SB ,Kim Y
