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1、细胞因子表达与NF-B活化在溃疡性结肠炎发病中的意义 作者：刘元山，陈剑群，朱炳喜【摘要】 溃疡性结肠炎( ulcerative colitis, UC)目前认为是由多因素共同作用所致,主要包括环境、遗传、感染和免疫等因素。其中活化的免疫细胞产生的细胞因子介导的异常免疫反应在UC发病机制中的作用及其与核因子-B(NF-B)的密切关系,越来越引起人们的关注。本文对常见的细胞因子及NF-B在UC发病中的作用进行综述。 【关键词】 细胞因子;NF-B;溃疡性结肠炎溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因及发病机制尚不十分清楚的慢性非特异性结肠炎症。目前认为UC是环境、遗传
2、、感染及免疫等多因素共同作用的结果,其中免疫学因素是UC研究中的热点。国内外许多研究已经证实细胞因子介导的异常免疫反应在UC的发生发展中起重要作用，并且发现NF-B与细胞因子在UC中的作用关系密切。因此充分认识细胞因子表达与NF-B活化在UC发病中的作用具有重要意义。1 细胞因子与UC1.1 白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1) IL-1主要由单核/巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞分泌，是一种能激活多种免疫和炎症细胞的前炎性细胞因子。根据等电点不同, IL-1可分为IL-1和IL-1,前者为分泌型,而后者是其主要的活性形式。IL-1可活化T细胞,通过B细胞与IL-4连接而增加抗
3、体分泌,促进血管内皮-白细胞黏附分子的表达,趋化中性粒细胞等炎性细胞进入肠道病变部位,从而引起一系列肠道炎症反应和组织破坏,其细胞因子mRNA的表达与UC的炎症程度成正相关,可作为临床上判断疾病严重程度和疗效的指标1。IL-1尚能通过自分泌或旁分泌刺激其他细胞因子和炎症介质如IL-6、IL-8 等产生。Manida等2报道从UC患者结肠黏膜分离的单核巨噬细胞产生大量的IL-1，在UC活动期明显升高。一组UC患者的ELISA检测结果显示急性期UC黏膜分泌的IL-1水平较缓解期和正常对照组高3。Casellas 等4的双盲实验也证明UC急性期IL-1分泌水平增高,缓解期则否。丁伟群等5采用成组t检
4、验分析UC组不同病变程度、病变肠黏膜的IL表达,并与正常组、肿瘤组比较,结果发现IL-1在受累黏膜显著升高。近年来,随着细胞因子在UC发病中作用的深入研究,生物治疗成为研究的热点,如使用重组IL-1受体拮抗剂治疗UC取得了很好的疗效6。以上均说明IL-1确实参与了UC的发生、发展过程。1.2 白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2) IL-2主要由T细胞产生，是国内外研究最为活跃、最为广泛的一种淋巴因子。研究表明IL-2参与了UC的发病，IL-2基因敲除小鼠会发生与人类UC高度相似的慢性炎症7。可溶性IL-2受体(sIL-2R)作为一种封闭因子,可与膜IL-2R竞争结合IL-2,
5、降低IL-2水平,影响细胞免疫功能。血清sIL-2R水平是反映机体细胞免疫功能的重要指标。sIL-2R的升高说明IL-2水平下降,导致细胞免疫功能障碍,同时sIL-2R又与B细胞结合, 产生更多的异常抗体,发生抗原-抗体反应,进而激活补体导致肠黏膜炎性损伤。研究证实sIL-2R可作为UC患者病情和判断预后的指标。邹阳等8实验观察发现溃疡性结肠炎模型大鼠血清IL-2水平比正常大鼠显著降低,而通过穴位埋线治疗后随着症状体征的好转,IL-2水平显著升高。说明随着治疗的进行增强了T细胞介导的细胞免疫和体液免疫功能, 减弱自身免疫反应, 从而减轻组织损伤而趋向愈合。陈垦等9经临床研究发现活动组UC患者血
6、清sIL-2R水平明显升高,且与病情轻重程度及病变累及的部位有关,提示UC患者存在着细胞免疫功能的障碍,免疫系统处于激活状态。1.3 白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6) IL-6主要由活化的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞分泌,是一种广泛的促炎性细胞因子,其生物学效应类似于IL-1。一系列研究发现UC患者血清IL-6浓度明显升高,且与病变范围和病变严重程度成正相关5。利用免疫荧光技术可以检测到UC中炎症细胞质内的IL-6阳性颗粒。用生物素标记的IL-6 mRNA探针检测UC中IL-6 mRNA，阳性信号主要分布在巨噬细胞胞浆内，并且其表达的程度和分布随病变的严重性而增强10。1
7、.4 白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8) IL-8主要由巨噬细胞和树突状细胞产生，是一种强有力的中性粒细胞趋化因子和活化因子11, 主要生物学作用为趋化并激活中性粒细胞,促进中性粒细胞的溶酶体活性和吞噬作用，在中性粒细胞介导的组织损伤中起重要作用;IL-8对嗜碱性粒细胞和T细胞也有一定的趋化作用,这些生物学活性与UC的发生密切相关。目前认为肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-，TNF-)、IL-1、IL-6诱发的炎症反应在很大程度上是通过诱导以IL-8为代表的趋化因子的产生而实现的。IL-8是UC发生过程中必不可少的炎症介质,无论是在血清、粪便还是组
8、织中,UC患者的IL-8含量均明显增高12，IL-8亦与UC炎症反应的持续与放大密切相关,UC患者外周血和结肠黏膜的IL-8浓度依炎症程度显著改变13。Daig等14研究发现UC病变肠黏膜的IL-8水平明显高于正常组织,且与黏膜的中性粒细胞数、病灶的大体炎症程度成正相关。陈垦等9则发现UC患者血清IL-8浓度高于正常者,并随病情缓解呈下降趋势。上述研究表明IL-8直接参与了UC的病理过程,且与炎症程度呈正相关,因此可作为临床上判断疾病严重程度和疗效的指标之一。1.5 白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12) IL-12是细胞免疫中重要的致炎细胞因子，激活形式的IL-12是由
9、p35蛋白和p40蛋白组成的异二聚体,其作用的靶细胞主要是T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)，主要作用为促进Th1细胞分化和激活NK细胞，刺激T细胞和NK细胞分泌干扰素-(Interferon-，IFN-)、IL-2、IL-8等，然后再通过这些因子发挥作用。Ehrhardt等15研究发现三硝基苯磺酸(TNBS)诱发的UC模型与IL-12产生增加有关,用抗IL-12抗体可以缓解TNBS诱发的结肠炎。Nielsen等16发现急性期UC患者结肠活检标本IL-12mRNA表达增加，缓解期则与对照组无差异，提示IL-12与UC活动度密切相关。1.6 肿瘤坏死因子-(tumor necrosis facto
10、r,TNF-) TNF是由Carswell等17于1975年发现并命名的。1985年学者们根据细胞来源和分子结构的不同,将其分为型和型，目前研究较多的是TNF-。TNF-a是一种重要的促炎因子和免疫调节因子，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞所产生,具有广泛的生物学活性。TNF-被公认为介导UC的细胞因子, 主要作用是使中性粒细胞聚集、内皮细胞黏附分子上调、凝血酶原效应等。在UC活动期,TNF-在血浆和粪便中的水平均升高,其在肠道中能介导肠黏膜损伤作用。诸多报道18-19均显示UC中TNF-分泌水平及其mRNA 表达高于正常组或未受累结肠黏膜。Guimband等20采用酶联免疫吸附试验(ELISA
11、)法测定19例中重症UC结肠灌洗液,发现UC患者的结肠灌洗液中有大量TNF-、IL-1,两者有显著相关性且细胞因子的量与疾病的活动程度有关。宋瑛等21采用PCR、限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术对我国汉族人群中131例炎症性肠病患者的TNF-和TNF-基因多态性进行分析，结果发现UC患者TNF-308位点基因型频率(15.5%)及等位基因频率(8.7%)显著高于正常人群的4.1%和2.0%(P<0.01),认为TNF-308等位基因与UC发病的易患性相关。另外,TNF-还可诱导结肠上皮细胞凋亡,促进UC的发生。2 NF-B与UC2.1 NF-B的结构 NF-B是一类能与多种基因启
12、动子或增强子部位B 位点发生特异性结合并促进其转录的蛋白质,1986年首先由Sen和Baltimore应用凝胶电泳迁移率的实验方法,从B细胞核提取物中检测到22。NF-B是NF-B/ Rel 蛋白质家族成员。NF-B/ Rel蛋白根据其结构、功能和合成形式可分为2组:第1组包括NF-B1(p50)和NF-B2(p52),分别由其前体蛋白p105和p100蛋白裂解而来;第2组包括RelA(p65) 、RelB 和c-Rel,它们没有前体。NF-B/ Rel蛋白共同含有1个高保守的约300 bp的N-末端节段,即Rel同源结构域(Rel-homology domain,RHD),RHD内含有DNA
13、结合区、二聚体化区、核定位和与抑制蛋白(inhibitoryB,IB)相互作用区,其中p65含有转录活化区域。上述2组NF-B/ Rel蛋白成员间可形成同源二聚体或异源二聚体,其中发挥主要生理功能的是p50/RelA组成的异源二聚体，几乎存在于所有细胞中。2.2 NF-B的活化途径 静息状态下,NF-B二聚体与一种被称为IB 的抑制蛋白结合形成三聚体,以无活性的形式被“囚禁”于细胞质中，阻止NF-B由细胞质进入细胞核。当肿瘤坏死因子(TNF-)、细菌脂多糖(LPS)等细胞外刺激信号作用于NF-B信号通路后,IB氨基末端的丝氨酸在上游激酶的作用下发生磷酸化。磷酸化的IB氨基末端21和22位赖氨酸
14、在E3泛素连接酶的作用下与泛素分子共价结合,被泛素化。泛素化使IB空间构象改变,从而使其可以被26S蛋白酶体复合物降解。IB的降解,使得NF-B从NF-B-IB复合物上解离释放,获得“自由”的NF-B迅速从细胞质易位到细胞核,与相应基因启动子上的特定序列(B位点)发生特异性结合,从而启动靶基因转录23。2.3 NF-B在UC中的异常活化及促炎作用 细胞因子在UC发病中的作用已经得到公认,但其释放和调控的机制尚不明确。UC中存在着上皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的异常激活和细胞因子(促炎细胞因子与抗炎细胞因子)网络的失衡24-25,这一过程与NF-B的诱导及激活有关。研究表明,UC患者核内NF -B
15、 DNA结合活性明显升高26-27,NF -B被活化并进入核内后具有很强的与基因B位点相结合的能力,是细胞因子转录及释放的前提和关键。而且绝大多数细胞因子基因启动子或增强子部位均有NF-B结合位点,活化入核的NF - B 即可与之结合并促进这些细胞因子的转录。Schrieiber等28在UC患者肠道细胞核提取物中发现NF-Bp65水平明显升高。甘华田等26发现UC患者肠道上皮细胞、巨噬细胞及固有层细胞中p65的表达增加。在UC组织中,p65在细胞质中的表达是炎症状态的反映。UC中存在p65 mRNA的持续合成,也提供了胞质中游离p65的来源,新合成的p65移位至核,使NF-B持续激活,从而使炎症慢性化。NF-B可以调控任何含有B 位点的基因转录29,对UC起主要致病作用的细胞因子,如TNF-、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等在转录水平由NF-B调控30。有研究证实，NF-B的激活导致TNF-、IL-1的转录增加,而TNF-、IL-1的释放又进一步激活NF-B。后者通过正反馈进一步增加TNF-、IL-1的分泌，同时使其他细胞因子如IL-6、IL-8等的表达也增加。由此产生级联反应,使炎症不断放大形成“瀑布效应”，这可以解释TNF-、IL-1的促炎作用。病理实验也证实,在炎症部位的黏膜中存在NF-B的高表达。抑制N
