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1、电针治疗对大鼠脊髓损伤后Nogo_A蛋白表达的影响 作者：李振鹏，孔抗美，陈育春，郭天明，陈泽锋，刘加贝 【摘要】 目的：探讨电针治疗对大鼠脊髓损伤(SCI后Nogo_A蛋白表达的影响。方法：以96只2月龄Wistar大鼠为受试对象，SCI组于T9处行脊髓全横断，治疗组予电针治疗，采用Western blot测定各时间点及各组脊髓Nogo_A表达及变化,并以苏木精_伊红和免疫组化染色对受损脊髓进行形态学观察。结果：SCI后Nogo_A蛋白表达呈递增趋势，于14d后最强；经电针治疗，Nogo_A表达减少。结论：Nogo_A是SCI后脊髓神经纤维再生的主要抑制因子，电针治疗对Nogo_A表达具有明
2、显的抑制作用。 【关键词】 电针；脊髓损伤；Nogo_A蛋白 AbstractObjective: To study the effect of electroacupuncture on the expression of Nogo_A protein in rats with spinal cord injury(SCI. Methods: Ninety_six adult Wistar rats were randomly assigned into control group(A, SCI group(B, sham_treatment group(Cand electroacupun
3、cture treatment group(D. Group B, C and D were received transect SCI at the T9 vertebrae level while group A was just opened the vertebra and their spinal cords were not wounded. Group D was treated with electroacupuncture. All the spinal cords of the trauma section were taken out at different time
4、points after o_peration. Western blot and immunohistochemical methods were used to examine the change of the expression of Nogo_A in these tissue. Results： Just minim Nogo_A was found in the control group, while the manifold expression of Nogo_A was found after operation，especially at the end of the
5、 second week, the expression was inhibited by electroacupuncture. Conclusion: Nogo_A is a major suppressor factor of spinal cord nerve fiber regeneration after SCI, and the electroacupuncture can obviously inhibit the expression of Nogo_A protein. Key Wordselectroacupuncture，spinal cord injury，Nogo_
6、A protein 脊髓损伤(SCI临床常见，致瘫率较高。电针是治疗SCI的重要方法,其疗效已获得临床实践和动物实验1_2的证实，但其作用机制尚未完全明确。本实验通过电针治疗SCI大鼠，于不同时间点采集大鼠受伤脊髓段，以Western blot测定其Nogo_A蛋白表达，探讨电针治疗SCI的机制。 1 材料与方法 1.1 动物模型制作 Wistar大鼠(广东省实验动物中心提供96只(2月龄，体质量220270，雌雄各半，随机分为对照组(A组。24只和SCI组(72只。SCI组于T9处行脊髓全横断，然后再随机分为损伤组(B组，硬膜外腔不留置电极、治疗对照组(C组，留置电极但不通电和电流刺激治疗组
7、(D组，损伤部位上下端的椎间隙硬膜外腔留置电极，予G6805_2型多用治疗仪治疗，强度以大鼠有轻微肌肉抽动和无明显不安嘶叫为适，每天治疗30min，疗程至处死动物取标本前为止，各组24只。各组分别于术后1、7、14和28d取各损伤部位的脊髓组织(每组3只置_70冰箱保存备用。 1.2 Western blot测定Nogo_A蛋白 取各组脊髓样本40mg，加入细胞裂解液30L，冰浴下研磨匀浆，煮沸后7500r/min离心取上清液，再加入等体积的2SDS上样缓冲液，提取总蛋白，电泳，结束后按常规转膜。在膜封闭液内封闭，4保存6h，加一抗，与封闭液混匀后4冰箱过夜。TBS液清洗3次，加入封闭液后滴加
8、二抗(1400稀释，室温振荡混匀1h，TBS清洗膜3次，加化学发光剂，在暗室条件下显影和定影制成X光片。将各组X光片扫描后采用C_IMAGING SYSTEMS软件进行灰度分析，以Nogo_A蛋白和内标蛋白(actin灰度的比值作为Nogo_A蛋白的相对表达量。 1.3 病理标本制备 术后1、7、14和28d时,随机取大鼠每组3只，质量浓度20g/L戊巴比妥钠(40mg/kg腹腔注射麻醉后开胸，自左心室插管至主动脉，剪开右心耳，先灌注PBS 150mL，再灌注质量浓度40g/L多聚甲醛250mL，固定。2后取出以伤段为中心的长约20mm(810脊髓组织，放入相同固定液继续固定，24后常规石蜡包
9、埋，连续切片(厚约4m，分别进行苏木精_伊红及Nogo_A抗体免疫组化染色，观察受损节段组织学改变。 1.4 免疫组化染色 免疫组化染色采用ABC法，切片脱蜡至水，微波修复抗原，滴加封闭液，及抗Nogo_A工作液，室温37 1d，PBS冲洗，DAB显色，苏木精轻度对比染色，脱水、封固。实验中设立严格的正常血清对照和阴性对照。 1.5 统计学处理 结果以s表示，分别比较A、B、C组各时间点Nogo_A表达，采用t检验，0.05，SPSS10.0统计软件分析。 第3期 李振鹏等.电针治疗对大鼠脊髓损伤后Nogo_A蛋白表达的影响 2 结果 2.1 苏木精_伊红染色 光镜下见B、C组脊髓组织有较多片
10、状出血及出血坏死后形成的囊腔,组织疏松水肿,神经细胞变性,部分神经纤维溶解消失,炎症细胞浸润明显。D组脊髓组织点灶状出血、坏死,范围局限,组织轻度水肿。A组脊髓组织未见出血、坏死及组织水肿、变性等。 2.2 Western blot检测结果 Western blot结果显示各组脊髓均有Nogo_A蛋白表达。B、C组Nogo_A蛋白表达呈递增趋势，损伤14d后表达最强，以后逐渐降低(图1，封2。B、C组表达明显高于A、D组(图2，封2。 2.3 Nogo_A免疫组化染色结果 阳性判断标准：阳性信号位于胞浆,呈棕黄色，胞核不着色。A组有少量Nogo_A免疫阳性细胞，免疫阳性反应产物主要分布于胞质和
11、突起中(图3，封2。B、C组脊髓横断区域灰质和白质Nogo_A表达与正常对照的脊髓相同，但染色呈强阳性(图4，封2。阳性表达在伤后7d开始升高，以伤后14d时最为显著,伤后28d一直维持较高的表达水平，表达较正常组显著升高。D组脊髓组织中有散在分布的阳性细胞,细胞近似圆形，部分细胞可见突起(图5，封2，阳性表达在治疗后7d开始较B、C组降低，治疗后28d一直维持在较低水平。各组不同时间点阳性细胞平均灰度值见表1。表1 大鼠脊髓Nogo_A阳性细胞平均灰度值 3 讨论 近年来对中枢神经系统(CNS纤维再生的认识已发生了改变3_4。认为成年CNS神经元再生能力弱，其原因是CNS的微环境不利于神经再
12、生,存在着抑制轴突再生的分子。在众多不利因素中，尤以Nogo最为突出5。Nogo是重要的神经突起生长抑制因子，对神经突起的生长具有很强的抑制作用，它有3种主要异构体(Nogo_A,Nogo_B和Nogo_C，其中Nogo_A与神经再生的关系最为密切5_6，不但具有和Nogo受体作用的Nogo_66序列，而且具有额外的独特抑制区域，离体和活体实验均已证实它与动物CNS神经轴索的再生关系密切。Nogo_A对神经元轴索的外生也具有极强的抑制作用,鞘内注入单克隆抗体IN_1或Nogo_66受体拮抗肽NEP1_40能显著促进SCI大鼠皮质脊髓束纤维的再生及感觉和运动功能的改善7。Nogo_A广泛表达于C
13、NS中，分布特点与CNS再生能力低下的特征相符合。所有这些都表明Nogo_A在哺乳动物CNS神经纤维的再生修复中起重要作用。 SCI后，神经细胞能否再生修复，如何最大限度恢复脊髓功能，减少或预防继发性损伤，以及SCI恢复机理，一直是基础研究的热点，也是国际脊髓信托基金会制定的SCI研究方向。自1920年发现电场能够促进神经生长至今，已有大量的动物实验和临床试验发现电针能促进SCI后神经功能的恢复810。 本实验组前期工作1_2也发现电针治疗能调控损伤脊髓组织中凋亡基因的表达，是治疗SCI的重要方法。本研究结果发现，正常脊髓组织可见少量Nogo_A表达，说明Nogo_A的作用不一定完全与神经突起
14、的生长有关，或者正常脊髓组织处在一个复杂的平衡环境中；SCI后Nogo_A表达逐步上升，在神经胶质瘢痕周围的脊髓组织中呈强阳性表达,但在瘢痕中几乎无表达,在损伤后14d表达最强，随后下降，但仍保持在较高水平，说明SCI后14d内为修复损伤的一个时间窗口，提示越早治疗效果越好。SCI后，影响CNS神经纤维再生的因素是多方面的，Nogo_A并不是惟一因素。采用电针刺激治疗，电流直接跨越脊髓横断处病灶，刺激上下行神经纤维,使上位神经元与下位神经元形成假性信息沟通,反馈刺激了大量神经细胞及上下行神经纤维的生长,Nogo_A表达也被抑制，从而促进神经元功能的恢复，可能有助SCI的修复。 但是，电针刺激通
15、过什么样的信息传导通路对Nogo_A表达进行调控，以及是否还有其它调控因素和适宜的电针刺激参数，还未清楚。【参考文献】 1李振鹏, 孔抗美, 齐伟力. 针刺对大鼠慢性脊髓损伤后Bax和Bcl_2表达的影响J. 昆明医学院学报, 2004, (1: 45-48.2李振鹏, 孔抗美, 郑钦洪, 林晓琪, 齐伟力. 针刺治疗大鼠慢性脊髓损伤的疗效观察和机理研究J. 海南医学, 2007, 18(8： 129-130.3CHONG M S, WOOLF C J, TURMAINE M, et al. Intrinsic versus extrinsic factors in determining t
16、he regeneration of the central processes of rat dorsal root ganglion neurons:the influence of a peripheral nerve graftJ. J Comp Neurol, 1996, 370(1: 97-104.4FOUAD K, DIETZ V, SCHWAB M E. Improving axonal growth and functional recovery after experimental spinal cord injury by neutralizing myelin associated inhibito
