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1、米诺环素对衰老痴呆大鼠脑组织eNOS、iNOS表达的影响 作者：赵宇 蔡志友 晏勇 余昌胤 张骏 黄良国 晏宁 承欧梅 李洁颖 蒋萍【摘要】 目的 观察米诺环素(minocycline)对衰老痴呆大鼠学习记忆和脑组织eNOS、iNOS表达的影响，探讨米诺环素对衰老痴呆脑保护作用机制。方法 Wistar大鼠随机分组：假手术组(S组)、痴呆模型组(M组)、米诺环素治疗组(MT组)。酶联免疫吸附法和免疫组织化学法检测大鼠脑组织eNOS、iNOS的含量，行为学检测大鼠记忆学习改变。结果 MT、M组与S组大鼠前后两次跳台实验、水迷宫实验的结果有显著性差异(P0.01)，MT组与M组大鼠前后两次跳台实验、
2、水迷宫实验的检测结果有显著性差异(P0.01)。MT组iNOS表达较M组降低(P0.01),MT组eNOS表达较M组增高(P0.01)；MT组eNOS、iNOS表达较S组增高(P0.01)；M组eNOS、iNOS表达较S组显著增高(P0.01)。结论 米诺环素能降低衰老痴呆大鼠脑组织iNOS、增强eNOS表达抑制氧化应激反应发挥脑保护作用。 【关键词】 痴呆；米诺环素；一氧化氮合酶 【Abstract】Objective To investigate the effect of minocycline on the expressions of eNOS and iNOS in brain o
3、f aged dementia rat，and study its neuroprotection mechanism for aged dementia. Methods Wistar rats were randomly divided into sham, aged dementia model and minocycline treatment groups. eNOS and iNOS were measured by immunohistochemistry and ELISA. Learning memory was measured by praxiology. Results
4、 Shuttle box and morris water maze tests in minocycline treatment and aged model groups were more significantly different than those of sham group (P0.01). Shuttle box and morris water maze tests in minocycline treatment group were more significantly different than those of sham groups (P0.01). The
5、expression of iNOS in minocycline treatment group was lower and the expression of eNOS was higher than that of model group (P0.05). The expressions of eNOS, iNOS in minocycline treatment and model groups were higher than those of sham group (all P0.01). Conclusions Minocycline can decrease the expre
6、ssion of iNOS and increase the expression of eNOS in aged dementia. Minocycline can play such a neuroprotection role in aged dementia rats by restraining oxidative stress action. 【Key words】Dementia; Minocycline; Nitricoxide synthas一氧化氮合酶(NOS)是催化一氧化氮(NO)生物合成的酶，广泛存在于各种类型的细胞中。内皮源性一氧化氮合酶(eNOS) 可以激活血管平滑
7、肌细胞中的可溶性鸟苷酸环化酶，使胞内cAMP浓度升高，从而起到扩张血管、抑制血小板和白细胞黏附、聚集的作用，发挥神经保护功能1。诱导性一氧化氮合酶(iNOS) 主要分布于巨噬细胞、炎性中性粒细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、小胶质细胞和星型细胞等，一旦合成就不断地产生NO，直至底物耗尽，过量产生的NO可通过活性氮、氧化应激效应对脑组织造成损害2。米诺环素作为四环素类药物中一种有效的神经细胞保护剂，在抑制神经炎症3、抑制小胶质细胞激活4、抑制基质金属蛋白酶表达5，6、抑制活性氧产物和氧化应激的发生7，8、抑制细胞调亡9过程等发挥脑保护作用。本研究通过观察衰老痴呆大鼠动物模型脑组织eNOS和iNOS
8、的表达，探索NOS在衰老痴呆中的发病机制，并采用米诺环素对衰老痴呆大鼠进行干预，探讨米诺环素对衰老痴呆脑保护作用的机制。1 材料与方法1.1 材料10 w龄Wistar大鼠48只(雌性，体质量200250 mg，第三军医大学野战外科研究所提供,动物中心许可证号：渝实动设施准第260号)。米诺环素胶囊(100 mg/粒)：中国惠式制药有限公司，生产日期：2006年6月8日，生产批号：06060874。eNOS、iNOS化学检测试剂盒：福建迈新生物技术有限公司；D半乳糖(Dgal)：上海试剂二厂；大鼠跳台和大鼠穿梭箱程序自动控制仪均由重庆市神经病学重点实验室提供。1.2 方法1.2.1 衰老痴呆模
9、型制备和分组参照文献10，11颈后皮下注射Dgal 120 mgkg1d1连续6 w制作衰老痴呆动物模型，分别选取造模2、4、8 w作为观察点(造模成功后大鼠平均生存时间为8 w)。随机原则分为：假手术组(S组，等量生理盐水颈部皮下注射)，2 w(M2)、4 w(M4)、8 w(M8)、米诺环素治疗2 w(MT2)、4 w(MT4)、8 w(MT8)，每组6只。1.2.2 给药方法将米诺环素用生理盐水稀释成0.5 mg/ml浓度备用。正常组、M组每天给予等量生理盐水处理；在M组的基础上， MT组于缺血后给予米诺环素50 mgkg1d1灌胃。美满霉素的剂量选择参考Stirling等12和Hewl
10、ett13的米诺环素神经保护作用机制研究。1.2.3 行为学检查1.2.3.1 穿梭箱实验穿梭箱底部铺以不锈钢电栅，大小为60 cm16 cm25 cm，箱顶部装有蜂鸣器。训练时，将大鼠放在箱内任一侧，20 s后出现蜂鸣音，持续15 s，蜂呜5 s后由底部电栅给以电刺激(电流强度1.5 mA)，大鼠受到电刺激后逃到另一端，电击蜂鸣自动停止。记录动物在单独蜂鸣期间逃避的时间(主动逃避时间)和遭受电刺激的时间以及电击的次数。全部动物每天测试1次，每次20个循环，全程训练。1.2.3.2 水迷宫实验Morris水迷宫作为检测实验动物学习记忆水平的重要工具，其测试程序主要包括定位航行实验和空间探索实验
11、两个部分。(1) 定位航行实验：用于测量大鼠获取经验(学习)的能力。实验前1 d下午将大鼠放入水中自由游泳2 min，观察其游泳姿势并使其熟悉实验环境。实验历时4 d，每天上、下午两个时间段，每个时间段训练4次，每次训练随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水池，同一次训练所有大鼠入水点相同。记录大鼠找到平台的时间，即潜伏期。(2) 空间探索实验：用于测量大鼠保存经验(记忆)的能力，即大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的能力。在训练的最后时段撤除平台，然后在B象限任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，观测其在120 s内在各象限的游泳距离及其占总距离的百分比，以及120 s内穿越各象限平台
12、相应位置(即平台在D象限所在的位置)的次数。记录大鼠找到平台的时间(学习潜伏期)，及120s内穿越各象限平台相应位置的次数(记忆潜伏期)，比较各组潜伏期，评价大鼠学习记忆功能。1.2.4 酶联免疫吸附法(ELISA法)大鼠麻醉后固定于手术台上，快速心脏抽血约5 ml注入试管中，室温下静置2 h后，4离心，3 000 r/min，10 min，取血清。在冰台上迅速分离大鼠一侧的海马，按2.5 ml/g脑质量加入相当体积的冰生理盐水，用匀浆器将组织研磨，然后冰浴下超声波粉碎制成匀浆，4，10 000 r/min离心10 min，取上清液。实验严格按照eNOS、iNOS酶联免疫吸附法说明书步骤进行。
13、1.2.5 免疫组织化学染色法用水合氯醛麻醉大鼠，打开胸腔，右心室内取血，分离血清保存，待检备用。取血后立即经升主动脉快速灌注生理盐水，直至右心房流出液清亮为止。然后用4多聚甲醛灌注固定，断头取脑。冠状切取海马及其周围部位脑组织，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片脱蜡、水化，3H2O2室温10 min灭活内源性酶，蒸馏水洗涤3次；滴加正常血清封闭液，室温20 min，甩去余液；不同的切片分别适量加入即用型羊抗大鼠eNOS、iNOS抗体，4湿盒内过夜。滴加生物素化山羊抗鼠IgG，37 20 min；然后滴加链霉亲合素生物素过氧化氢酶复合物37 20 min。除加入正常血清封闭液外，以上
14、各步间均用0.01 mol PBS(pH7.4)充分洗涤。最后用DAB显色，常规脱水、透明、封片。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS替代一抗作为阴性对照。实验严格按照eNOS、iNOS说明书步骤进行。1.3 统计学处理所有数据以xs表示，全部数据采用SPSS11.0软件包进行统计学处理，同一组内不同时相点的比较采用方差分析，两组之间同一时相点的比较采用t检验。2 结果2.1 水迷宫、穿梭箱实验结果穿梭箱实验检测显示M组大鼠的电击次数与S组比较显著增加(P0.01)，主动逃避次数显著降低(P0.01)；M组大鼠的学习潜伏期和记忆潜伏期时间显著延长(P0.01)；MT组与M组同时相点比较电击次数显
15、著降低(P0.01)，主动逃避次数显著增高(P0.01)，MT组大鼠的学习潜伏期和记忆潜伏期时间显著延长(P0.01)，M组各组间大鼠行为学的检测结果间差异无显著性(P0.05)，MT组各组间大鼠行为学的检测结果差异也无显著性(P0.05) (表1)。表1 水迷宫、穿梭箱实验结果(略)2.2 iNOS的表达与分析ELISA法检测iNOS显示M组脑组织内iNOS水平明显增高 (P0.01),经过米诺环素治疗后，iNOS水平显著降低 (P0.01) (表2)。免疫组织化学法OD值与ELISA值具有一致性，模型鼠脑组织内iNOS水平显著增高(P0.01)，经过米诺环素治疗后，iNOS水平显著降低(P0.01)；MT组与M组同时相点比较iNOS表达显著降低(P0.01)；M组各组间结果差异无显著性(P0.05)，MT组各组间检测结果差异无显著性(P0.05)。经过米诺环素治疗后iNOS脑内表达水平显著降低。2.3 各组大鼠脑组织eNOS的表达ELISA法检测eNOS显示M组脑组织内eNOS水平明显增高 (P0.01)。和iNOS相反，经过米诺环素治疗后，eNOS水平显著增高 (P0.01)(表2)。免疫组织化学法OD值与ELISA值具有一致性，模型鼠脑组织内eNOS水平显著增高 (P
