《基因工程-1-工具酶》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程-1-工具酶（38页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生化与分子生物学技术和原理,欢 迎 学 习 本 课 程，请 多 提 宝 贵 意 见！,主讲：蒋德明 实验B楼309 54341957 dmjiang,基因克隆与表达部分,供体细胞,载体分子,外源DNA,外源基因,分离,酶切,酶切,连接,转化 扩增,DNA重组分子,受体细胞,鉴定与表达,重组转化子,工程菌 或细胞蛋白产物,工程菌或细胞培养,重组产物分离纯化,基因克隆与表达,基因克隆的基本元件 PCR及文库克隆法 DNA重组及转化技术 转化子的筛选与鉴定 原核生物表达系统,一 基因工程的基本元件 -工具酶,限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 逆转录酶 DNA修饰酶,第一节 限制性内切酶 定义
2、:能够识别和切割双链DNA(dsDNA)分子内特异核苷酸 顺序的核酸内切酶,叫做限制性核酸内切酶.,三种类型核酸内切酶特性差异,一、II型限制性内切酶切割类型,1、平齐末端（Blunt end）,Hind II 切割反应,Sma I 切割反应,2.1 产生5粘性末端,5-G A-A-T-T-C-3 3 C-T-T-A-A-G-5,5-G-3 5-A-A-T-T-C-3 3-C-T-T-A-A-5 3-G-5,2.2产生3粘性末端,5-C-T-G-C-A-G-3 3-G A-C-G-T-C-5,5-C-T-G-C-A-3 5-G-3 3-G-5 3-A-C-G-T-C-5,EcoRI,PstI,
3、2、粘性末端（Sticky end）,同尾酶 这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。,G-G-A-T-C-C C-C-T-A-G-G,BamH I,T-G-A-T-C-A A-C-T-A-G-T,Bcl I,A-G-A-T-C-T T-C-T-A-G-A,Bgl II,G-A-T-C C-T-A-G,Sau 3A I,U-G-A-T-C-Y Y-C-T-A-G-U,Xho II,U表示嘌呤（A或G） Y表示嘧啶（T或C）,5-G-A-T-C 3-,-3 C-T-A-G-5,+,二、II型限制性内切酶重要概念,酶的星号活性 当酶切条件改变时，酶的专一性可能会降低，以
4、至于同一种酶可识别和切割多个的位点。,低盐（50mM）、高pH（8）、高甘油浓度,EcoR I*,EcoR I,G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G,G-A-A-T-T-A C-T-T-A-A-T,A-A-A-T-T-C T-T-T-A-A-G,G-A-G-T-T-C C-T-C-A-A-G,双酶切方法,同步双酶切 分步双酶切,三、限制性内切酶分析方法,DNA连接酶,定义：能够催化双链分子中相邻的3-OH和5-P末端之间形成磷酸二酯键,使DNA分子连接起来的酶.,一、种类,1.1 T4-DNA连接酶 从T4噬菌体感染的大肠杆菌提取 1.2 大肠杆菌DNA连接酶,二、DNA连接酶的连接
5、范围,1.粘性末端DNA连接 2.缺口的填补 3.平末端DNA连接,5 3,3 5,P,P,OH,OH,5 3,3 5,P,OH,RNA,DNA,5 3,3 5,OH,OH,P,P,Mg2+,ATP,Mg2+,ATP,Mg2+,ATP,T4-DNA 连接酶,T4-DNA 连接酶,T4-DNA 连接酶,T4-DNA 连接酶各种催化反应活性,三、DNA连接酶的连接条件,1.双链DNA分子 2.具有3-OH和5-P 3.缺口处不缺核苷酸,缺失核苷酸的裂口,丢失磷酸二酯键的缺口,3,5,连接酶封闭缺口,连接酶无法封闭缺口,无活性,（a）,（b）,五、T4 DNA连接酶的反应条件,10T4 DNA Li
6、gase Buffer 2.5 l DNA片段* 约0.3 pmol 载体DNA* 约0.03 pmol T4 DNA Ligase 1 l ddH2O up to 25 l 反应温度16度，连接过夜。 * DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的310倍。,DNA聚合酶的特点： 1.以四种脱氧核糖核苷酸为底物 2.需模板DNA； 3.需引物； 4.新链的合成方向为5-3,DNA聚合酶,三、DNA聚合酶的活性,1. 53聚合酶活性,2. 53外切酶活性,3. 35外切酶活性,裂口,缺口,四、Klenow酶,1.来源：,DNA聚合酶,枯草杆菌蛋白酶,C端(67kd) + N端（35kd）,K
7、lenow 5 3聚合 3 5外切,5 3外切,2.Klenow酶的三维结构,5 3,3 5,5 3,3 5,*,*,*,*,*,*,*,*,(a),(b),(c),(d),(e),(a)DNaseI处理双链的DNA分子,(b)带有3-OH末端的单链缺口,(c) pol从5-P移去一个核 苷酸,(d) pol将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸,(e)重复(c)(d)的步骤，缺口沿5-3方向移动，形成32P标记的核苷酸合成的DNA链,五、DNA聚合酶的应用,1.制备DNA分子杂交探针(缺口平移Nick translation),五、DNA聚合酶的应用,2.制备DNA分子杂交探针(随机引物
8、法),五、DNA聚合酶的应用,4.测序（T7 DNA聚合酶）(Sanger双脱氧链终止法）,53聚合，持续反应时间最长 35外切，是DNA 聚合酶的 1000倍。,2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP),5.1 来源： 水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1 5.2 活性： 聚合最适温度为75-80， 不具35外切酶活性， 具53外切活性 。,五、DNA聚合酶的应用,5.PCR反应（Taq DNA聚合酶）,反转录酶（reverse transcriptase）,一、来源：商品反转录酶有两种 来自禽类成髓细胞瘤病毒
9、(AMV)。 来自Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶,二、结构和活性：,依赖RNA的DNA聚合酶活性,T T T T-OH,T T T TAGACAG,AAAAUCUGUC,AAAAUCUGUC,逆转录酶,Mg+ 4dNTP,依赖于DNA的DNA聚合酶活性,5,3,ssDNA,5,3,逆转录酶,Mg 4dNTP,外切RNA酶活性 (RNA酶H),+寡聚RNA片段,逆转录酶,RNA/DNA,ssDNA,RNA,OH,三、用途,一、单链核酸酶（S1/ Bal31 Nuclease),带切口的双链DNA,DNA修饰酶,2.Bal31单链核酸酶的用途,2.1 DNA的缺失突变(Bal31)
10、 Bal31单链核酸酶具有单链核酸内切酶和双链DNA的3、5末端同时降解的活性。,末端转移酶,1.来源： 又称脱氧核苷酸转移酶，自牛胸腺中分离。 2.活性： 催化dNTP掺入DNA 3-OH末端，形成同聚物末端；反应不需模板DNA，需Co2+。,ssDNA 3-OH加尾,dsDNA 3-OH加尾(包括平末端加尾),5 AACC-OH,5 AACCTTTT,转移酶,Mg +、dTTP,5 AACC-OH,3 TTGG,5 AACCTTTT,3 TTGG,转移酶,Co 、dTTP,3.用途:,载体和DNA加上同聚“尾巴”以形成粘性末端 DNA 3-OH端同位素标记,三、碱性磷酸酶与磷酸激酶,T4 DNA连接酶,碱性磷酸酶,内切酶,外源基因,磷酸激酶加磷酸基,P,OH,OH,OH,OH,OH,OH,OH,OH,P,P,P,Vector,OH,OH,OH,OH,牛小肠碱性磷酸酶（CIAP） Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal T4多聚核苷酸激酶 T4 Polynucleotide Kinase,OH,OH,OH,OH,OH,OH,P,P,+,OH,OH,P,P,2Pi,T4-DNA连接酶,外源DNA片段,自身无反应,缺口,缺口,T4-DNA连接酶,转化 修复,用碱性磷酸酶防止载体自身环化,碱性磷酸酶,磷酸激酶,
