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1、,食品中转基因成分的检验,掌握： 转基因食品的定义及其特征 定性、定量PCR原理 基因芯片技术的定义及原理 熟悉： PCR技术检测转基因食品中外源性DNA 的方法种类、样品前处理及优缺点 转基因食品中外源基因表达产物的检测 方法及其局限性 了解： 基因芯片技术在转基因食品检验中的应用,“转基因”是指利用分子生物学手段将外源性基因转移到某种特定生物体中，使其生物性状或机能发生部分改变。 转基因食品就是以转基因生物体直接作为食品或以其为原料加工生产的食品 。,转基因食品（GMF）的定义,Genetically Modified Foods,转基因技术的基本步骤,1. 辨认能体现所期望特征的目的基因
2、代码，才可能从具有该基因的天然活体中分离。,2.DNA的分离。利用特殊的剪切酶。在特定位点上将供体的DNA分裂成含有目的基因的片段，然后分离、纯化。,3.利用载体将目的基因转移，而其中典型的载体是由细菌或病毒的DNA环型片段组成的 4.目的基因的扩大培养及嫁入寄主细胞 5.选择性的标记基因,6.为控制基因表达而必需的DNA序列（启动子、终止子的DNA序列必须结合其中）,7.筛选和繁殖。经过转基因的寄主细胞必须经过严格筛选、测试才能用于食品生产。,目前上市的转基因食品, 抗除草剂基因大豆 抗虫基因玉米 抗病毒基因油菜 抗病毒土豆 抗软化基因西红柿 转抗虫基因棉花,BT（苏云金芽胞杆菌）玉米,苏云
3、金芽胞杆菌 产生毒害剂的基因 除害剂基因与质粒结合,BT 玉米 含转基因的幼苗 植物细胞与重组基因 重组基因在细菌中 细菌共同培养 培养扩增细菌,基因重组,质粒,细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，存在于细胞质中 能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。,转基因食品的优势,增加作物单位面积产量 降低生产成本 增强作物抗虫害、抗病毒能力 提高农产品的耐贮性，延长保鲜期 摆脱季节、气候的影响，四季低成本供应 食品的品质和营养价值提高,富含胡萝卜素的转基因“金色水稻”,
4、转基因食品安全性争论,赞同的人：认为该项技术及其产品能大大提高人们的生活水平 怀疑的人：认为它走得“太快”了，在现实生活中可能会产生副作用 目前对转基因植物的安全性评价主要集中在两个方面，一个是环境安全性，另一个是食品安全性。,英国“普兹台事件”：1998年，英国罗伊特研究所普兹台教授说他的实验证明，幼鼠食用转基因土豆会使内脏和免疫系统受损。,转基因安全事件,美国的“斑蝶事件”：1999年美国康乃尔大学副教授约翰罗西在自然上发表文章说，一种转基因玉米可产生杀死害虫的花粉，而身为益虫的一种美州大蝴蝶食用了这种转基因玉米花粉后有44死亡。,转基因安全事件,过敏反应问题：对于一种食物过敏的人有时还会
5、对一种以前他们不过敏的食物产生过敏 比如：科学家将玉米的某一段基因加入到核桃、小麦和贝类动物的基因中，蛋白质也随基因加了进去，那么，以前吃玉米过敏的人就可能对这些核桃、小麦和贝类食品过敏。,营养问题：科学家们认为外来基因会以一种人们目 前还不甚了解的方式破坏食物中的营养成分。,对抗生素的抵抗作用：当科学家把一个外来基因加入到植物或细菌中去，这个基因会与别的基因连接在一起。人们在服用了这种改良食物后，产生抗药性,对环境的威胁：不在改良范围之内的其它物种有可能成为改良物种的受害者,技术特征 利用载体系统（细菌质粒、病毒的环形基因）的重组DNA技术 利用物理、化学和生物学等方法将重组DNA导入有机体
6、的技术,转基因食品的特征,显微注射、基因枪等,农杆菌介导转化法,转基因食品的特征,产品特征 具有食品或食品添加剂的特征 产品的基因组构成发生了改变，并存在外源DNA（基因重组体构成元件） 产品中存在外源DNA表达产物及其生物活性 产品具有基因工程所设计的性状和功能,基因重组体构成元件,载体 目的基因（定义P184） 病毒衣壳蛋白基因 病毒卫星RNA 病毒复制酶基因 苏云金杆菌杀虫蛋白基因 蛋白酶抑制剂基因 植物凝集素基因等,调控元件 启动子（花椰菜花叶病毒的35S启动子等） 终止子（花椰菜花叶病毒的35S终止子等） 标记基因和报告基因 标记基因：已知效应的基因，能够使个体具备特定的特征并且通过
7、生理学、形态学、生物化学或分子生物学检测能够发现其存在的基因。,基因重组体构成元件,标记基因的作用,是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用 重组DNA载体的重要标记，用来检验目的基因转化成功与否 检测目的基因在细胞中的定位 抗生素抗性基因、除草剂抗性基因,目的基因是需要表达的基因，标记基因是有一定特点的基因,标记基因与目的基因的区别,大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与目的基因组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。,然后，选择含有青霉素的培养基来培养受体细胞，能够在培养基中存活下来的受体细胞
8、就可以认为是成功的导入了外源DNA，标记基因就起作用了,报告基因与标记基因的异同,作用与标记基因相同 标记基因的缺陷： 检测慢（蛋白酶作用需要时间） 依赖外界筛选压力（如抗生素、除草剂） 而报告基因则是指其编码产物能够被快速测定、且不依赖于外界压力的一类基因。,理想的报告基因具备如下要求,受体细胞中不存在相应内源等位基因的活性 它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞 具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性 常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、荧光素酶基因（luc）、-葡萄糖苷酸酶基因（gus）等,氯霉素乙酰基转移酶(CAT)：,可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使
9、氯霉素解毒 用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测其活性，也可进行蛋白质印迹(Westernblotting)和免疫组织化学分析,荧光素酶,催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。 最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶。 用荧光比色计即可检测酶活性。,半乳糖苷酶,由大肠杆菌基因编码，可催化半乳糖苷水解 最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一 以邻硝基苯D半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶活性,优势: 除蛋白芯片法外。快速,具有一定的灵敏度,也能进行半定量 尤其是试纸条法,不需特殊仪器设备,适用于
10、现场检验或初筛,外源蛋白质检测方法,局限性: 1.由于抗原抗体反应的专一性,每种转基因产品都要开发和建立专门的检测试剂和方法,而转基因产品种类繁多,要建立所有转基因产品的蛋白质检测法工作量很大。 2.只能定性和半定量检测,外源蛋白质检测方法,3.对于加工过的转基因食品,其蛋白质很容易被破坏,从而影响检测结果的准确性。 4.有些插入基因根本不表达或表达量很低，无法检测。,外源蛋白质检测方法,载体 目的基因 调控元件（启动子、终止子、增强子） 标记基因 报告基因,PCR检测外源DNA,外源DNA,根据检测目的和检测结果特异性水平的不同，外源DNA的检测方法有： 初筛试验：对通用元件的检测 局限性：
11、只能鉴别产品是否含有基因重组体，不能鉴定转基因产品的种类 基因特异性试验 能检测不同的目的基因、标记基因或报告基因，区别不同的植物品系,PCR检测外源DNA,组成结构特异性试验 检测目的基因与调控基因连接处的核苷酸序列区段 区别某类植物的各种转基因株系,插入位点构成特异性试验 区别同一插入序列在基因组中的不同重组状态,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。 步骤 DNA的提取 DNA纯化 设计并合成引物 探针制备 PCR检测,P
12、CR检测外源DNA,定性、定量,植物细胞中DNA主要存在于细胞核内 细胞质中的DNA主要存在于线粒体和叶绿体中 细胞内各种DNA总称为总DNA 进行转基因检测需要提取的是总DNA 95%以上的DNA是与蛋白质结合的,DNA的提取和纯化,基本原理是：从样品中释放DNA，去除其他杂质： 去污剂或有机试剂破坏细胞膜，释放游离DNA 蛋白质：蛋白酶或有机试剂去除； 多糖（如果胶、纤维素、淀粉等），以相应的酶或有机溶剂（CTAB/氯仿等）去除 脂类：酶或溶剂（如正己烷）去除 RNA：RNA酶去除 盐类（提取/裂解缓冲液或沉淀液的残留物）,DNA的提取和纯化,沉淀法：乙醇和异丙醇等沉淀DNA 固体介质吸附
13、法：采用阴离子交换树脂、硅石或玻璃珠、硅藻土、膜等吸附DNA。,DNA的提取和纯化方法,植物总DNA的提取方法,苯酚氯仿法 CTAB法 SDS法 二氧化硅法 胍盐,DNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂 CTAB溶解细胞膜，使蛋白质变性，与DNA形成复合物 CTAB与DNA的复合物在高盐溶液中可溶，而蛋白质、多糖、多酚溶解性降低会沉淀,CTAB法提取和纯化DNA原理,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),CTAB与DNA的复合物低盐溶液中沉淀；而多糖、色素等不沉淀 使沉淀物溶于高盐溶液，加入乙醇和异丙醇沉淀DNA,CTAB法提取和纯化DNA原理,两个关键试剂： CTAB缓冲液高盐溶液 CTAB沉
14、淀液低盐溶液,适合糖类和酚类含量较高的样品,CTAB法提取和纯化DNA步骤,CTAB法提取和纯化DNA步骤,加入高浓度NaCl溶液 加入氯仿,离心、取上清液,加入异丙醇,离心、取沉淀,反复加入乙醇,离心、取沉淀,自然晾干 去离子水或TE缓冲液溶解,提纯DNA质量的检测,电泳原理： DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。其迁移速度与相对分子质量的对数成反比 。,260nm、280nm处测定吸光度 A260nm/ A280nm在1.61.9：纯度高，可用 A260nm/ A280nm1.6：蛋白质或溶剂污染 A260nm/ A280nm1.9：RNA污染,提纯DNA纯度的
15、检测,用RNA酶或苯酚氯仿法进一步纯化,PCR技术的原理 PCR技术类似于DNA的天然复制过程。 在适宜的条件下，人工合成寡核苷酸引物与模板DNA单链互补结合，在DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸(dNTP) 为底物，不断延伸，使被扩增的基因片断以几何倍数增长。,定性PCR的检测方法,变性退火延伸 模板DNA的变性：加热至93-95，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA离解成为单链； 模板DNA与引物的退火（复性）：温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCR过程的基本步骤, 引物的延伸：温度升至72左右，在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，
16、合成一条与模板DNA单链互补链。 重复变性退火延伸三个过程，目的基因被扩增放大几百万倍。每个循环需2-4min，整个PCR反应需要2-3h。,PCR原理示意图,模板、引物、酶、dNTP和Mg2+是PCR反应的五个重要因素，决定了PCR反应的成败。 模板DNA：抽提的DNA溶液中含有氯仿、乙醇等有机溶剂、Taq酶抑制剂和杂蛋白等会影响PCR扩增，产生假阴性。,PCR反应的主要因素, 引物：PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度，引物的设计和合成对PCR结果起着决定性作用。 引物的设计方法： 参考文献报道常用的效果最佳的引物 采用计算机软件，例如Permier Primer、Oligo等。在软件的基础上辅以人工分析，以达到最佳效果。, Taq DNA聚合酶： 是一种耐热的DNA聚合酶，由于发现于水生栖热菌（Thermus aquaticus）内，故命
