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1、津市新型发酵有限责任公司 实习汇报,实习时间：2011年5月4日至5月14日 实习单位：津市新型发酵有限公司 实习专业：生命科学学院08级生物技术专业 汇报人：,汇报内容,实习基本情况 公司基本概况 发酵工艺 提取过程 化验,唐经理给我们讲注意事项,一、实习基本情况,实习目的 培养学生理论联系实际，从实际出发分析问题、研究问题和解决问题的能力 学习了解生物产品工业化的全过程以及生产组织管理等方面的知识 了解生物专业的发展的状况，准确自我定位，为今后走向社会，服务社会做好思想准备和业务准备,实习分组,第一组：胡文凯 施欧文 张安淼 叶 可 汤小芳 廖成玲 第二组：李 艳 匡 哲 吴 红 冷长龙
2、姚佳宁 第三组：赵淑玲 瞿雪勤 陈 黎 骆 意 蒋炜祎 第四组：赖少容 肖丹青 张小金 罗梓桓 俞孝纲,第一组,第二组,第三组,第四组,二、公司基本情况,津市新型发酵有限责任公司成立于1989年，是一家致力生物工程系列酶制剂产品生产及销售的公司，固定资产1500万，占地面积1万平方米，员工400人，年产7000t,年销售收入6000万，为国家贡献税收100万，在全国酶制剂行业排名第五。 该公司具有二十多年发酵专业生产经验，并获得ISO9001：2000及ISO14001：2004的两类认证，主要产品精制糖化酶与耐高温淀粉酶，中温淀粉酶的发酵水平、产品质量、酶活力的稳定性以及使用效果经有影响的用
3、户（如杰能科公司、安琪酵母公司）多年使用对比，其指标均达到国家同行业同类产品的先进水平。 2008年全年综合生产能力、实际生产能力及实际生产量均突破60000标吨，是中国酶制剂行业重点生产企业，华南地区生产水平最高、生产规模最大的酶制剂生产专业化工厂之一。,三、生产产品,（1）糖化酶（固、液两种） 作用：淀粉转化为葡萄糖 用途:酒精、淀粉 （2）耐高温淀粉酶（100110） 龙腾牌耐高温淀粉酶具有极好的耐热性，在高温下液化具有明显的优点，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、味精、饴糖、葡萄糖等工业中液化淀粉和纺织业高温退浆。 （3）中温淀粉酶（6080 ） 用途：纺织、印染 （4）淀粉酶,四、总工艺流
4、程,菌种,发酵车间,蒸 汽,无菌空气,电 力,原 材 料,车检化验,絮 凝,压 滤,超 滤,浓 缩,调 配,灌 装,入 库,盐 析,压 滤,绞 条,干 燥,混 粉,包 装,入 库,助凝剂等,化验,化验,防腐剂等,Na2SO4,菌种选育,接种,一级种子罐,发酵罐,二级种子罐,三级种子罐,扩大培养,接种,发酵过程,一级种子罐加料,打开人孔 清洗 一袋麦芽糊精 一定 量的玉米浆 一定量的硫酸铵溶液 取样侧pH 因pH值较低，加入NaOH溶液，调pH，再次测定 将CaCl2和消泡剂一起加到罐中 关闭人孔 盖，开始高温灭菌（121 ，压力0.1MP, 45min）,下面以二级种子罐为例简述一下津市新型发
5、酵有限公司的发酵过程的一些重要参数,二级种子罐 津市新型发酵有限公司的发酵的车间的一些工艺参数如下：容量：3t ；料液加入量一般为种子罐的体积的3/5；通气量一般为150m3/L； 发酵时间：70-80h；初始pH值为4.8-5.0。,二级种子罐发酵过程,发酵过程：将经调配和液化好的培养基注入二级种子罐，进行实罐灭菌，灭菌后冷却至34，将已成熟的一级种子压入二级种子罐，在34，pH4.8-5.0的条件下发酵培养，随着发酵的进行，pH逐渐下降，这时需要补加氨气来提高pH，使之恒定在4.8。发酵过程中，DE值也会不断地低因此需要补加培养基，补加的原料一般是C源：液化好的玉米淀粉。成熟的标志：酶活力
6、达到5000u/g；镜检菌丝正常、健壮，做无菌平板培养无杂菌；气味无异常，带淡淡的香味。,发酵模式,津市新型发酵有限公司所采用的发酵模式是补料分批发酵，也称为半连续式发酵或流加分批发酵，是指在发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。可以使发酵过程最佳化。 分批发酵有以下几个作用：(1)可控制抑制性底物的浓度，可以减弱分解代谢物的阻遏。 (2)和连续发酵比、不需要严格的无菌条件；不会产生菌种老化和变异等问题。 与分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。,接种的全过程,装有菌种的钢瓶,将酒精火圈放在接种口，数秒后打开阀门,在火焰中供钢钳去掉塞子,将钢瓶瓶口在酒精火焰中烧一会儿
7、,把钢瓶瓶口插入接种口,用酒精冷却钢瓶颈部,用沾有酒精的纱布冷却，并确定是否可以接种,五、发酵过程控制,1、温度控制 2、pH的控制 3、通气控制 4、泡沫控制 5、补料控制,取样,温度与发酵,温度的升降与生物反应，搅拌，散热等有关 （1）温度影响各种酶的反应速率和蛋白质性质 （2）温度影响发酵液的物理性质 （3）温度影响生物合成的方向,发酵罐的温度一般控制在 34左右。 发酵罐内的温度一般用蛇形管冷却系统来维持，温度过高则增大冷却水流量，温度过低则将热蒸汽通入蛇形管来升温。 如果温度过高，可以以自来水喷淋来辅助降温。,发酵罐内部结构,蛇管,螺旋桨,消泡耙,人梯,引起pH改变的因素,（1）碳源
8、过量 （2）消泡油添加过量 （3）生理酸性物质的存在 （4）氮源过多 （5）生理碱性物质的存在 （6）中间补料，碱性物质添加过多,pH值控制,一级种子罐的pH只监测，不调控 其余的发酵罐的pH控制在4.8左右。 随着发酵时间的延长，pH不断降低，需要补充氨气来提高pH值。,通气控制,溶氧是需氧发酵控制最重要的参数之一。由于氧在水、发酵液的溶解度都很小，因此，需要不断的通气和搅拌，才能满足不同发酵过程对氧的需求。溶氧的大小对菌体生长和产物的形成都会产生不同的影响。 津市新型发酵有限公司的供气量一般控制为一级种子罐80m3/L，二级罐为150m3/L，三级罐300m3/L ，四级发酵罐则根据罐体积
9、而定。,供气流程：,高空采气,空气压缩,空气贮藏罐,冷却器,旋风分离器 （除油、水）,丝网分离器 （除灰尘）,加热器,总过滤器 （棉花、膜）,粗滤（孔径0.3-0.5um）,精滤（孔径0.1-0.3um）,入罐,高空采集,空气压缩机,空气贮 藏罐,冷却器,加热器,粗精空气过滤器,空气贮藏罐的作用,由于空气经过空气压缩机后，产生不稳定的气流波，利用空气贮藏罐可以使气流平稳。,冷却的目的 加热的目的,空气经过压缩，升温的70-80，在突然降温，水分凝集，再用旋风分离器去除。,气流经过丝网分离器后，经加热器升温到50左右，是空气的湿度降低，有助于过滤。,泡沫控制,泡沫是气体在液体中的粗分散体。属于气
10、液非均相体系，在这个体系中，分散相是（气体），连续相（液体）。产生的原因有：（1）由外界引进的气流被机械地分散形成；（2）发酵过程中产生的气体聚结生成；气液接触：搅拌液体时混入气体；气体从液体内部产生；含助泡；起泡速度高于破泡速。 泡沫对发酵的不利影响有：（1）降低发酵设备的利用率；（2）增加了菌群的非均一性；（3）增加了染菌的机会；（4）导致产物的损失。 一般采用化学消泡法即在发酵液中加如食用油使泡沫破碎,补料控制,下面以发酵罐为例来说明补 料控制的原理及目的 原理 刚灭菌的发酵液的DE 值11010，当 发酵液的DE值降至10时开 始补料，由于补料速率低于消耗速率DE值 一直下降，最终使D
11、E值保持在10-15左右。 目的 保持发酵正常快速进行，保持产酶速率,补料罐,六、糖化酶提取工艺,放 罐,絮凝,盐析,一滤,二滤,超滤,精滤,压滤,绞条,成品配制,旋风分离,沸腾干燥,筛选,粉碎,混粉,贮存,成品,液酶提取,固酶提取,循环浓缩,分为一、二级旋风分离,混液重 新压滤,粗粉进行粉碎,絮 凝,添加2的粗硅藻土和H2SO4,清 夜,压滤,混液,混液,清夜,卸滤饼,液酶的渣子进行盐析作为固酶的填料，用固酶压滤时的滤液（废水）进行盐析，因为滤液中含有Na2SO4,将二级压滤的滤液通入过滤罐中，待罐内滤液的体积达到一定时开始通入超滤器进行超滤。透过液直接排除，而浓缩液经过冷却返回超滤罐，再进
12、行超滤，如此循环超滤达到浓缩过滤的作用。当浓缩液的浓度、密度达到要求之后抽提到成品配制罐进行下一流程提纯。,超 滤,超滤器,超滤灌,超滤之后，贮存在超滤罐中，在再输送到精滤室进行精滤,精 滤,精滤室在不工作的时候要开紫外灯灭菌，工作人员进去前要把紫外灯关掉。精滤是除杂质杂菌，精滤的时候加硅藻土助滤剂，用以除杂除菌。精滤后的滤液加防腐剂3苯甲酸钠和3的山梨酸钠，PH值调到4.3-4.6，然后灌装成成品。,灌装,成品,固酶提取,盐析的时候加38的Na2SO4,温度控制在38，搅拌4小时，然后静置10-12小时。Na2SO4是用来吸附酶，而温度控制在38 是因为在此温度下Na2SO4的溶解度最大。,
13、盐 析,压 滤,温度控制在38，此温度下Na2SO4的溶解度最大，Na2SO4就会溶解在滤液中，在此温度下压滤滤饼的含水量不会很高，有利于后面的干燥，并且在此温度下酶活不会受到影响。滤液用来盐析液态糖化酶的滤饼，这样就可以回收利用Na2SO4。,绞 条,旋风分离,条形的固体酶输送到旋风机中，里面通有蒸汽（100以上，但是由于条形固酶原来含有较多水分，温度不会马上上升，不会使酶失活）。在旋风分离机中通蒸汽起到干燥的作用，并且在此过程中条形固酶被粉碎。,沸腾干燥床,分筛和粉碎,分筛,细 粉,粗 粉,粉碎,细粉,混 粉 机,从粉碎机出来的固体酶如果酶活过高就与液酶的滤饼制成的粉末混合，达到所要求的酶
14、活，然后制成成品。,成 品,七、发酵液主要检测的方面,发酵液pH值，DE值的测定：（车间化验室） 糖化酶的活力测定：（中心化验室） 高、中温淀粉酶活力测定： （车间化验室：目测法;中心化验室：比色法）,车间化验室及其主要试验设备,DE值测定,DE值的基本概念：糖液中的还原糖含量占干物质的百分率表示DE值(Dextrose Eguivalent)用公示表示：还原糖含量/干物质含量100,DE的测定过程,反应终止,DE的测定步骤,1、取25ml水至三角瓶中（15瓶）； 2、先后分别加A液、B液各1ml至三角瓶； 3、各取2ml滤液加至三角瓶中，加热煮沸反应2min; 4、先后分别加3%10mlKI
15、溶液、26%10ml H2SO4溶液、2ml淀粉指示剂至三角瓶中； 5、用0.1%硫代硫酸钠溶液滴定至紫色，记录所用硫代硫酸钠的量,糖化酶酶活力测定,酶活力定义：1g酶粉/1ml酶液于400.2，pH4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个活力单位，以u/g(u/ml)表示。 原理：糖化酶能从淀粉分子非还原性末端开始，分解-1, 4葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，由此可计算酶活力。,糖化酶酶活力测定的步骤,1、先后加25ml淀粉稀释液、5ml醋酸缓冲液至比色管甲、乙中；40 恒温水箱中反应5min； 2、取样品； 3、用纱布过滤样品，取滤液； 4、取2ml样品稀释液于比色管甲中，40 恒温水箱中反应30min；比色管乙于40 恒温水箱中反应30min；,测定中,5、先加4滴NaOH溶液、加2ml样品稀释液至乙比色管中；加4滴NaOH溶液至甲比色管中；放入冷水中冷却 6、吸取5ml比色管中反应液至已有少量蒸馏水的带玻璃塞的锥形瓶中；加入10ml 0.1%碘液； 7、加入15ml 0
