《ⅠALDH1a2基因影响膀胱癌细胞株生物学行为的实验研究Ⅱ腹腔镜前列腺癌根治术膀胱尿道吻合单针连续吻合法的临床研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ⅠALDH1a2基因影响膀胱癌细胞株生物学行为的实验研究Ⅱ腹腔镜前列腺癌根治术膀胱尿道吻合单针连续吻合法的临床研究（113页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中科技大学 博士学位论文 ALDH1a2基因影响膀胱癌细胞株生物学行为的实验研究腹腔 镜前列腺癌根治术膀胱尿道吻合单针连续吻合法的临床研究 姓名：居正华 申请学位级别：博士 专业：外科学（泌尿外科） 指导教师：张旭 20090501 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 ALDH1a2 基因影响膀胱癌细胞株生物学行为的实验研究基因影响膀胱癌细胞株生物学行为的实验研究 华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科 导 师 张 旭 教 授 博士研究生 居正华 中文摘要中文摘要 尿路上皮癌(urothelial carcinoma UC)
2、是最常见的泌尿系肿瘤，最新的流行病学报 告显示 UC 分别占男性和女性恶性肿瘤发病的第五位和第十位。UC 是一个多因素和 多阶段的逐渐发展过程，涉及到抑癌基因的失活、癌基因的活化、细胞周期的调控失 常、基因启动子的转录活化异常等遗传学或表遗传学异常等诸多方面。人类基因组有 两类遗传信息，一类是提供生命必需的蛋白质模板信息，称遗传学的信息；而另一类 称表遗传学的信息，是指在何时、何地、以何种方式应用上述蛋白质模板信息的指令 信息。表遗传学信息状态的确定可为肿瘤的早期诊断及基因治疗提供依据。有研究结 果表明，表遗传学改变多发生在肿瘤发生的早期，此时肿瘤细胞还未对人体造成实质 性损害，如能在此时进行
3、人工干预，即有可能将肿瘤扼杀在摇篮中。启动子甲基化和 组蛋白乙酰化是表遗传学修饰最重要的二种机制。 5-氮杂脱氧胞苷(5-aza-dC)是现今最 重要的 DNA 甲基化转移酶(DNMT)抑制剂之一，而曲古抑菌素 A（TSA）则是研究最 多的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，二者的联合使用可以促使肿瘤细胞的分化并 诱导肿瘤的凋亡。已有研究表明维甲酸（RA）浓度过低参与了膀胱癌的发生，使用 维甲酸在治疗膀胱癌中也取得一定进展。而 ALDH1a2 是催化视黄醛的氧化成维甲酸 关键酶之一。有研究证明人类醛脱氢酶家族中 ALDH1a2 基因启动子区域高甲基化可 导致前列腺癌发病率升高，但在膀胱癌细胞株
4、中仍无相关研究。我们首先对 5 株膀胱 癌细胞株及 11 例正常膀胱上皮组织的 ALDH1a2 启动子甲基化状态与 mRNA，蛋白 表达进行相关性研究后，再采用 5-aza-dC、TSA 处理膀胱癌细胞株逆转其甲基化状态 后，探讨对其影响进而诱导膀胱癌细胞凋亡的机制。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 4 目目 的的 探讨ALDH1a2基因在膀胱癌细胞株的甲基化状态和表达及5-aza-dC、TSA对其影 响进而诱导膀胱癌细胞凋亡的机制。 方方 法法 1. 5-aza-dC 及 TSA 处理膀胱癌细胞。 2. 采 用 甲 基 化 特
5、异 性 聚 合 酶 链 反 应 (MSP) 检 测 五 株 膀 胱 癌 细 胞 株 （BIU-87,RT-4,253J,5637,T24）及正常膀胱上皮组织经 5-aza-dC、TSA 处理 前后的 ALDH1a2 启动子甲基化。 3. 采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 分析正常膀胱上皮组织及五株膀胱癌 细胞株经 5-aza-dC、TSA 处理前后 ALDH1a2 基因 mRNA 的表达。 4. 采用 Western blot 检测经 5-aza-dC、TSA 处理前后五株膀胱癌细胞株及正常 膀胱上皮组织 ALDH1a2 基因蛋白的表达。 5. 采用 Annexin/PI 双标记法，检
6、测经 5-aza-dC、TSA 处理前后的五株膀胱癌 细胞株的凋亡及坏死。 结结 果果 1. 在正常膀胱上皮组织中，ALDH1a2 基因启动子区 CpG 岛表现为低甲基化。 在五株膀胱癌细胞中，ALDH1a2 基因启动子区 CpG 岛均表现为较高的甲基 化；TSA 不影响 ALDH1a2 基因 DNA 甲基化水平；应用 5-Aza-dC 能使 ALDH1a2 基因启动子区 CpG 岛发生去甲基化；联合给予 5-Aza-dC 及 TSA 的作用和单独给予 5-Aza-dC 相似。五株膀胱癌细胞中，RT-4、253J 和 5637 细胞与 BIU-87,T24 细胞不尽相同，后者启动子区 CpG
7、岛甲基化程度更高并 且更容易去甲基化。 2. ALDH1a2 基因在正常膀胱上皮组织有表达。在五株膀胱癌细胞中均无表达； 经 TSA 作用后也无表达；5-Aza-dC 作用后，RT-4、253J 和 5637 细胞中有较 弱表达：吸光度相对值为 0.168，0.146，0.153，均来源于低分化高度恶性的 BIU-87，T24 细胞中有稍强表达：相对值为 0.342，0.402；联合作用后五株 细胞均有较强表达：相对值为 0.293，0.324，0.421，0.658，0.753，与对照组 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 5 比较
8、差异有统计学意义(P0.05） 。 可见 TSA 不影响 ALDH1a2 基因 DNA 甲基化水平，与 5-Aza-dC 组和联合组相比，差异有显著性意义（p0.01）。五株膀 胱癌细胞中，RT-4、253J和5637细胞与BIU-87，T24细胞也不尽相同，后者启动子区 CpG 岛甲基化程度更高并且似乎更容易被去甲基化。 图2-1：五株膀胱癌细胞经处理前后的 ALDH1a2 基因启动子甲基化表达情况， 1，2，3，4，5分别代表RT-4，253J，5637，BIU-87，T24细胞。 膀胱癌细胞株处理前后相对甲基化率柱状图 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 12345 细胞种类 相对甲
9、基化率 对照组 TSA组 5-Aza-dC组 联合组 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 51 图2-2为5637细胞经各组处理前后的ALDH1a2基因启动子甲基化表达情况。 图2-3为 T24 细胞经各组处理前后的 ALDH1a2 基因启动子甲基化表达情况。 2. TSA 与与 5-aza-dC 对膀胱癌细胞株对膀胱癌细胞株ALDH1a2基因基因mRNA表达的影响表达的影响 ALDH1a2 基因在RT-4，253J，5637，BIU-87，T24细胞中均无表达；经 TSA 作 用后也无表达；5-Aza-dC 作用后，RT-4、253
10、J 和5637细胞中有较弱表达(吸光度相对 值为0.168，0.146，0.153)；均来源于低分化高度恶性的BIU-87，T24细胞中有稍强表 达(相对值为0.342， 0.402)； 联合作用后五株细胞均有较强表达(相对值为0.293， 0.324， 0.421，0.658，0.753)，与对照组比较，差异有统计学意义（p0.05）。 图2-4：T24细胞中ALDH1a2基因mRNA在对照组和各实验组的表达，T：TSA处 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 52 理组， A： 5-aza-dC处理组， A+T： 5-aza-dC与
11、TSA联合处理组 （ALDH1a2 318bp, GAPDH 152bp）。 图2-5：五株膀胱癌细胞经 TSA+5-Aza-dC 联合作用后，ALDH1a2 基因 mRNA 的表达。 3. TSA 与与 5-aza-dC 对膀胱癌细胞株对膀胱癌细胞株ALDH1a2基因蛋白表达的影响基因蛋白表达的影响 ALDH1a2 基因蛋白在 BIU-87,RT-4,253J,5637,T24 细胞中均无表达。 经 TSA 作用后，T24 细胞中有少量表达，其他四株细胞无表达；5-Aza-dC 作用后，五株细 胞均有表达，在 T24 细胞中表达增强；联合作用后五株细胞中均有较强表达。总之 5-Aza-dC
12、能使膀胱癌细胞中 ALDH1a2 基因重新表达蛋白，TSA对蛋白表达无 5-AzadC 明显， 5-Aza-dC及TSA 联合应用极大地促进 ALDH1a2 基因重新表达蛋白。 图2-6：T24 细胞中各组的蛋白的表达，T：TSA处理组，A：5-aza-dC处理组，T + A：5-aza-dC与TSA联合处理组。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 53 4. 倒置显微镜细胞形态学观察结果倒置显微镜细胞形态学观察结果 图2-7：药物处理前膀胱癌5637细胞株形态图。呈铺路石状镶嵌，紧密排列，细胞 呈多边形，椭圆形等多种形态，生长状态良
13、好 (400)。 A B C D 图 2-8-A,B,C,D 分别为空白对照组， TSA 组， 5-aza-dc 组及 TSA+5-aza-dc 联合组。 空白对照组以活细胞为主，仅有少量的凋亡细胞，几乎不见坏死细胞，基本符合正常 的细胞代谢动力学特征，这可能与培养瓶中肿瘤细胞增殖、培养液营养消耗有关；经 TSA 组处理后， 可见少量细胞收缩变圆， 浮起于细胞表面， 凋亡细胞稍增多； 经 5-aza-dc 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 54 0% 20% 40% 60% 80% 100% 1234 机械损伤细胞 晚期凋亡及坏死细
14、胞 早期凋亡细胞 活细胞 组处理后，出现体积缩小，收缩变圆，部分细胞浮起于细胞表面，少量细胞脱离，悬 浮于培养液中，凋亡细胞较多；经 TSA+5-aza-dc 联合组处理后，细胞更多地悬浮于 培养液中，部分细胞碎裂成片，细胞染色质固缩于核的一侧，浓染，或核碎裂形成凋 亡小体，凋亡和坏死细胞满视野(400)。 5. Annexin / PI 双标记检测膀胱癌双标记检测膀胱癌 T24 细胞凋亡细胞结果：细胞凋亡细胞结果： 膀胱癌 T24 细胞株经三次实验后空白对照组， TSA 组， 5-aza-dc 组及 TSA+5-aza-dc 联合组四组的正常活细胞，早期凋亡，晚期凋亡及坏死，机械破损细胞所占
15、的百分比 分别为（94.70%, 1.40%, 3.30%, 0.60%） ； （88.90%, 2.80%, 7.20%, 1.10%） ； （67.60%, 20.20%, 10.50%, 1.70%） ； （51.40%, 33.80%, 12.40%, 2.40%） 。在空白对照组中，大部 分细胞多位于左下象限，凋亡细胞极少；经 TSA 组，5-aza-dc 组处理后，早期凋亡和 晚期凋亡或坏死细胞均增多，以早期凋亡为主；TSA+5-aza-dc 联合组处理后，由于早 期凋亡细胞逐渐过渡到晚期凋亡细胞，此时早期凋亡细胞反而相对减少，晚期凋亡或 坏死细胞增多。三个实验组的细胞凋亡率分别与
16、对照组比较，差异均有统计学意义 (P0.05)。在实验浓度下，TSA 组和 5-aza-dC 组诱导凋亡的效果以后者稍强。相互比 较有统计学意义(P0.05)。使用 5-aza-dC 后另加 TSA，细胞凋亡明显增加，与 TSA 组 和 5-aza-dc 组相比较差异有显著性意义(P0.01)。 图 2-9：1，2，3，4 分别是空白对照组，TSA 组，5-aza-dC 组，TSA+5-aza-dC 组。 五株膀胱癌细胞早期凋亡与晚期凋亡及坏死的变化趋势稍有不同，前者上升趋势明 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 55 显， 可见早期凋亡是膀胱癌细胞株死亡的主要方式， 而晚期凋亡坏死的细胞相对较弱。 图2-10：T24细胞双变量 FCM 的散点图。A,B,C,D 分别为经空白对照组，TSA 组，5-aza-dc组及TSA+5-aza-dc联合组。左下象限代表正常活细胞，为Annexin -/ PI-；左上象限为机械破损细胞
