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1、浙江大学医学院 博士学位论文 白细胞介素-2对离子型谷氨酸受体功能以及培养海马神经元树 突发育、突触发生的影响 姓名：沈逸 申请学位级别：博士 专业：生理学 指导教师：陈宜张;罗建红 20080401 浙江火学博士学位论文 中文摘要 白细胞介素2 ( I n t e r l e u k i n 2 ，I L 2 ) 是目前研究比较广泛的细胞因子之一，I L 广2 不仅具有与T 细胞相关的多种免疫调节功能，同时也是一种具有多种生物学特性的 细胞因子。除了I L 广2 的免疫活性之外，神经生物学和神经内分泌学的研究数据表 明I L 广2 在中枢神经系统( c e n t r a ln e n r
2、o u ss y s t e m s ，C N S ) 中发挥重要的作用。除了 外周I L ，2 和它的特异性受体I L 2 受体( I L 2 R ) 外，I L 2 I L 2 R 蛋白分子还广泛存 在于额叶皮层、纹状体、海马、下丘脑、蓝斑、小脑、垂体、胼胝体等脑区，也即 在C N S 中存在着I I 广2 作用的结构基础，推测可能来源于内源性神经元和胶质细胞 的合成和分泌。脑源性的I L 2 很可能在其介导的神经调节功能或者C N S 紊乱等方 面发挥重要的作用；同时，外周的I L 广2 也能通过转运机制穿过血脑屏障( b 1 0 0 d - b r a i n b a r r i e
3、r ，B B B ) 进入一些脑区发挥作用，提示该细胞因子为免疫、内分泌和C N S 之 间的相互作用提供了体液调节的可能性。 然而I L 2 的临床应用也引起了许多C N S 的副作用，例如I 【广2 用于抗肿瘤的免 疫治疗过程中经常会伴有毒性并发症以及中度或严重的神经精神紊乱，且有认知功 能的损伤；在啮齿类动物中，I L 2 能引起生物和行为上的变化，并且与一些神经退 行性疾病的病理异常相关，例如帕金森病和阿尔茨海默病；I L 2 能有效地抑制海马 长时程增强( 1 0 n gt e 加p o t e n t i a t i o n ，L 1 曙) 的诱导以及维持，提示I L 广2 可能与
4、学习 记忆功能相关。海马是一个富含脑源性I L 2 以及I L ，2 R 的脑区并且与学习记忆功能 密切相关，因此I L 2 在神经精神方面的副作用认知缺损和记忆丧失等极有可 能是I L 2 直接作用于该脑区引起的。 u P 与长时程抑制( 1 0 n gt e 珊d e p r e s s i o n ，L 1 m ) 是突触可塑性的两种表现形式 ( 方向相反) ，二者的协调表达是学习与记忆能够正常进行的基础。谷氨酸是海马 内主要的兴奋性神经递质，它通过与突触后谷氨酸受体结合，激活受体，引发突触 兴奋传递。离子型谷氨酸受体作为主要的兴奋性受体参与了神经系统重要功能的调 节作用，尤其在突触可塑
5、性的研究中非常关键。离子型谷氨酸受体包括- 甲基D 天( 门) 冬氨酸( - m e t h y l D a s p a r t a t e ，N M D A ) 受体，o 【氨基3 羟5 甲基一异恶 唑丙酸( a 锄i I l o - 3 - h y d r o x y - 5 m e t h y l - 禾i s o x a z o l e p r o p i o n a t e ，舢订P A ) 受体以及海藻 酸( k i n a t e ，K A ) 受体，前两者主要分布在突触后，而K A 受体在突触前与突触后 1 浙江大学博士学位论文 均有分布。A M P A 和N M D A 受体
6、在海马的突触可塑性的研究中有关键作用。已经 证实N M D A 受体参与了多种神经系统疾病的病理过程，包括癫痫症，缺血性脑损 伤，可能在神经退行性疾病包括帕金森病和阿尔茨海默病中发挥作用，并且N M D A 受体掌控着海马L 1 曙和L 1 r D 的发生，因此提示我们N M D A 受体可能会介入I L 2 对突触可塑性的调节作用。有研究发现I L 2 能双向调节中脑神经元N M D A 受体介 导的电流，证实I L 2 与中脑神经元N M D A 受体之间有着密切的联系。此外，另一 种离子型谷氨酸受体一一A M P A 受体则被认为是突触可塑性变化的重要调节蛋白， 通过其反应实现了突触活性
7、的改变。既然离子型谷氨酸受体对海马突触可塑性是非 常重要的，而I L 2 又介入了海马脑区突触可塑性的调节，因此我们认为I L 2 、离 子型谷氨酸受体和海马突触可塑性这三者之间很可能存在着某种联系。I L 2 是否对 海马N M D A 受体有作用，或是对于海马的A M P A 受体也有作用还不清楚，目前还 没有关于I I 广2 对海马谷氨酸受体作用的相关研究报道。 已往关于I L ，2 与C N S 功能的研究主要都是倾向于I L 广2 是通过与其特异性受体 I L 广2 R 结合来发挥生物学效应，但是也有例外。1 9 9 6 年W a l l g 等研究报道I 【广2 能够 直接与阿片受
8、体结合而引起相应的信号转导，说明I L 2 并不只是与I L 2 R 结合后才 起作用的。如果I L 广2 对海马离子型谷氨酸受体有作用，那么是通过什么途径来实 现的? 是通过与其受体I L 2 R 结合后引起一系列信号转导起作用或是直接作用于这 些受体? 这些受体是否具有对I L 广2 敏感的亚型或靶结构? 这些具体的作用机制尚 不清楚。 此外，研究发现I L 广2 对多种神经元的生长及存活都有重要的促进作用。I 【广2 可为大鼠多个脑区包括海马等的原代培养神经元提供营养支持，能促进神经元的形 态发育，如神经突的生长等。I L 2 在空间学习和记忆相关的脑神经元发育和调节中 起到重要的作用。
9、神经元树突是神经元之间信息交换的场所，其长度、直径和分支 等各项指标均可反映细胞的功能状态。这些提示我们I L 2 对海马神经元树突发育 和突触形成可能存在着一定的影响。 本学位论文主要通过分子构建、原代神经元培养、电生理技术、活细胞荧光成 像及其它相关技术，研究I L 广2 对离子型谷氨酸受体功能以及培养海马神经元树突 发育、突触发生的影响，阐明I L 广2 的调节作用及其可能机制。 2 浙江大学博士学位论文 第一部分：白细胞介素一2 对N M D A 受体功能的影响 目的：研究I L 2 对培养大鼠海马神经元和表达重组N M D A 受体的H E K ( h u m 柚 e m b r y
10、 o n i cl 【i d n e y ) 2 9 3 细胞中N M D A 受体功能的影响以及初步作用机制。方法： 本实验利用全细胞膜片钳技术在体外培养第1 2 天( d a y s 协，f 们，D 1 2 ) 到D I V l 4 的原代海马神经元以及表达重组N M D A 受体的H E 勉9 3 细胞中通过Y 管系统给 予N M D A 受体激动剂记录N M D A 受体介导的全细胞电流( I N M D A ) ，并用Y 管系 统给予不同浓度的I L 2 处理；同时用逆转录聚合酶链式反应( r c v e r s e t r a I l s c r i p t i o n p o l
11、 y m e m s ec h a i nr e a c t i o n ，R T - P C R ) 检测了H E K 2 9 3 细胞中I L 2 R p 亚 基的表达情况。结果：我们发现1 ) 在D I V l 2 的神经元中，I L 2 与N M D A 受体激 动剂同时作用时，0 0 1 1n g m l I I 广2 能剂量依赖性快速地抑制I N M D A 峰值，0 1n g m l I L 2 引起的抑制程度为4 7 3 ( P 0 0 5 ) ( 图1 9A ，B ，C ) 。 讨论 本实验通过活细胞成像和定量分析研究树突发育的方法，观察了慢性I L 2 处理 对培养海马神经
12、元树突发育的影响。我们发现I L 广2 能显著地促进神经元树突的分支 和伸长，增强作用在D I V 7 的神经元中最明显；I L 2 还能增加D I V 7 神经元树突丝的 运动性；发育早期( D I V ：5 D 7 ) 的I L 广2 处理能有效增加D 1 4 神经元的树突棘密 度。 文献报道I L 2 可为大鼠海马的原代培养神经元提供营养支持，促进其生长及存 活( A w a t s u j ie ta 1 ，1 9 9 3 ；S a r d c re ta 1 ，1 9 9 3 ) ，并且能显著促进正常和损伤的海马神经 元的神经突的延长和分支( S a r d e re ta 1 ，1
13、 9 9 6 ；S a r d e re ta 1 ，1 9 9 3 ) 。海马是成熟大脑中 可塑性最高的一部分( B r e e d l o v ea l l dJ o r d 柚，2 0 0 1 ；M c E w e n ，1 9 9 9 ) ，海马神经元的各 种变化，包括树突树复杂性、树突棘密度、细胞胞体大小等都可能与学习记忆相关 ( W r o o l l e y 1 9 9 8 ) ，而这些因素又是相互影响的。锥体神经元的树突树在神经元发育 过程中逐渐复杂并发育成熟。发育早期的神经元( 约D I V 7 ) 具有众多树突树突丝， 它们伸缩运动活跃并不断与轴突相接触，启动突触的形成(
14、N i n ge ta 1 ，2 0 0 7 ；V a u g l l n ， 1 9 8 9 ；S o 玎aa n dH a r r i s ，2 0 0 0 ) 。 我们发现I L 广2 能剂量依赖性促进D 7 、D I V l 0 和D 1 4 的海马神经元树突树的 分支和生长，这个结果与以往发现的大多数细胞内和细胞外因子会同时影响神经元 5 3 浙江大学博士学位论文 树突树的生长和分支的研究结果一致( R a j a n a J l dC l i n e ，1 9 9 8 ；R o s s oe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。树突 树的复杂性和高度分支的结构是决定一个神经元如何接触
15、、接收、整合和传递来自 另一神经元的信号的重要因素。树突分支和总长度的增加可能会增加神经元之间信 号传递以及神经局部环路的功能，从而进一步促进不同脑区间的联系模式( N i n ge t a 1 ，2 0 0 7 ；M i l l e r 锄dJ a c o b s ，1 9 8 4 ) 。I L 2 基因敲除小鼠表现出的海马神经元中与学习 记忆密切相关的结构的异常也提示内源性I L 2 的缺失会导致发育和行为的异常，从 此可以看出I L 广2 对海马神经元发育的重要性。此外，我们观察到I L ，2 对树突树分支 数目和生长的作用在D I V 7 的神经元中最为明显。目前认为培养神经元第7 到
16、1 4 天是 神经元树突发育的关键时期，提示I L 2 对海马神经元树突树发育的促进作用具有发 育阶段的差异，尤其能促进神经元早期阶段的发育。 我们在D I V 5 到D 7 的海马神经元中用1 0n g m l I L 2 处理4 8 小时后发现I L 2 会引起培养海马神经元树突丝运动性的增加，但不影响其密度和长度。树突丝是出 现在C N S 发育早期的树突上细而长的分支。目前认为树突丝在发育晚期会成树突 棘( D a j l e y 锄dS m i t h ，1 9 9 6 ；F i s c h e re ta L l ，1 9 9 8 ；z i v 觚dS m i t l l ，1 9 9 6 ) 。我们实验室以前 的工作也显示树突丝在D I V 7 到D I V 8 运动最活跃，D I V 9 开始趋于稳定，并于D 1 4 左右大部分形成树突棘( N i n ge ta 1 ，2 0 0 7 ) 。树突丝伸长、缩短、摆动等运动是神经 元在发育早期寻找新的接触位点，随后形成新的
