白桦脂酸对鼻咽癌细胞系CNE1增殖凋亡和Bcl2表达的影响

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1、华中科技大学 硕士学位论文 白桦脂酸对鼻咽癌细胞系CNE-1增殖，凋亡和Bcl-2表达的影响 姓名：向芳 申请学位级别：硕士 专业：耳鼻咽喉科学 指导教师：孔维佳 20080501 独创性声明 本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名：向芳 日期：2008 年 05 月 15 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学

2、校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密 。 学位论文作者签名：向芳 指导教师签名：孔维佳 日期： 2008 年 05 月 15 日 日期：2008 年 05 月 15 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 前 言 鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一，具有鲜明流行病学、组织病理学、临床和治 疗学特征。目前鼻咽癌的

3、治疗多采取以放射治疗为主的综合疗法。由于其解剖结构处 于头部中央, 且易转移, 故放射范围相对较大。因此在放射过程中, 难免出现全身和局 部的急、慢性放射反应, 使放疗不能顺利进行。自2 0 世纪9 0 年代初以来, 一些新辅助 化疗或同步化疗的期研究报告显示综合治疗改善了N P C 患者的局部控制率和生存 率。而放疗辅以传统化疗药物如顺铂等在治疗肿瘤时由于缺乏靶向性，在杀伤肿瘤细 胞的同时殃及正常组织器官细胞及有免疫力的T 细胞。导致机体免疫力下降，机体免 疫力下降为肿瘤的复发埋下了种子，严重影响了生存率。基因治疗肿瘤是目前国内外 研究的热点，虽在实验研究上取得了一些进展，但仍存在靶向性不高

4、、转染率低、表 达不稳定及潜在不可控制性等缺点， 限制了其临床应用。 从植物药中研发抗肿瘤新药， 是一条既经济又有效的途径。目前很多研究小组和医药公司正致力于从抗癌植物药中 开发有效的抗癌药物。我国的传统中药由于所含物成分复杂和提纯制备条件上难以克 服的困难，限制了中药的推广和应用。因此，寻找一种有效的, 毒副作用小的新型化 疗药物成为我们目前亟待解决的问题。 1 9 9 5 年，P i s h a 等 1 报道了白桦酯酸可以选择性地抑制黑色素瘤细胞的生长。其 后，更多的文献显示，白桦脂酸体外具有抑制人成神经细胞瘤， 小细胞肺癌，乳腺癌， 卵巢癌，宫颈癌，结肠癌，前列腺癌，白血病等肿瘤细胞的生

5、长，具有广谱的抗癌作 用，而对正常分化的细胞毒性很低 1 , 4 7 , 4 8 , 4 9 , 5 0 ，因此引起了广大肿瘤研究者的 关注。 白桦脂酸 3 - H y d r o x y - l u p - 2 0 ( 2 9 ) - e n - 2 8 - o i c a c i d 又名桦木酸，是羽扇豆烷 型五环三萜类物质。其大量存在于桦木属植物及许多其它属植物中。可以直接从植物 中提取，也可以利用白桦脂醇通过半合成的方式获得。它们具有化学结构简单，相对 分子质量较小, 药理活性强，非F a s / F a s L 依赖介导细胞凋亡的作用机制等特点成为一 种新药的开发来源。研究表明白桦脂

6、酸对多种肿瘤细胞都有杀伤作用，而对正常分化 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 的细胞损伤小。其杀伤肿瘤细胞的具体作用机制并未完全清楚。有关于白桦脂酸对头 颈部肿瘤的影响的报道较少，而其对鼻咽癌作用的研究，迄今国内外尚无文献报道。 综合国内外研究认为白桦脂酸的抗肿瘤机制有以下几个方面：. 诱导细胞凋亡，. 调节细胞周期蛋白，抑制细胞增殖；. 抑制新血管的生成，减少肿瘤的侵袭力；. 减少肿瘤耐药性的产生。 众所周知，凋亡是细胞死亡的主要方式之一，细胞凋亡是受一系列基因控制的程 序化细胞死亡方式, 它是通过外源性或内源性的凋亡信号, 激活细胞内编码的自杀程 序而促发的。B c l

7、- 2 基因家族在细胞凋亡中发挥重要的调节作用，包含抑制和促进细 胞凋亡两类功能相反的基因。相关文献显示：白桦脂酸能够上调有些组织来源的细胞 中促凋亡基因B a x 的m R N A 和蛋白水平的表达，而且上调的水平和白桦脂酸的作用浓度 成正相关；同时能够下调B c l - 2 基因的m R N A 和蛋白的表达，表达的水平与白桦脂酸作 用的浓度成负相关，B c l - 2 抑制细胞凋亡的部分原因是阻断了细胞色素C 从线粒体释 放; B a x 促进线粒体通透性转换孔( M i t o c h o n d r i a l P e r m e a b i l i t y T r a n s i

8、t i o n p o r e , P T P ) 开放, 导致线粒体结构和功能的紊乱, 线粒体外基质内流, 渗透压失衡, 细胞器肿胀, 线粒体的内、外膜依次裂解, 激活c a s p a s e 系统, 作用底物( 聚腺苷二磷酸核糖) 聚合酶 p o l y ( A D P - r i b o s e ) p o l y m e r a s e , P A R P , 又称多聚( A D P - 核糖) 合成酶, 诱导细胞凋亡 9 。提示白桦脂酸可以通过上调B a x 与B c l - 2 的比例，诱导肿瘤细胞凋亡。 本实验为了初步探讨白桦脂酸对鼻咽癌的影响，在体外培养C N E - 1 细

9、胞的基础上， 采用M T T 技术，流式细胞术，细胞集落刺激实验，形态学观察技术以及聚合酶链式反 应（P C R ）多种分子生物学技术观察了白桦脂酸对C N E - 1 细胞增殖，凋亡以及对B c l - 2 基因表达的影响并初步探讨其杀伤肿瘤细胞的机制，为药物治疗鼻咽癌拓展新的思路 和方法，为白桦脂酸的开发应用提供有价值的实验依据。实验分为以下几个部分： 1 M T T 及细胞集落刺激实验检测白桦脂酸对鼻咽癌细胞系C N E - 1 增殖的影响。 2 流式细胞术，透射电镜观察白桦脂酸对细胞凋亡的影响。 3 逆转录聚合酶链式反应（R T - P C R ）检测白桦脂酸对B c l - 2 基因

10、表达的影响。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 摘 要 目的： 恶性肿瘤的治疗仍然是医学的一大难题。目前，对肿瘤治疗的方法有很多，主要 有手术治疗，化学治疗和放疗。对于有些不适合行手术治疗的肿瘤，化疗取得了不错 的治疗效果。白桦脂酸是一种新近发现的具有广泛抑瘤作用小分子化疗药物。本实验 通过研究白桦脂酸对鼻咽癌细胞系 C N E - 1 增殖和凋亡的影响。 方法： 体外培养鼻咽癌细胞系 C N E - 1 , 加入不同浓度的白桦脂酸（5 - 1 6 0 u g / m l ） , 作用不 同时间（2 4 h , 4 8 h , 7 2 h ）后 M T T 法计算抑制率。不同

11、浓度白桦脂酸（1 0 ，2 0 ，4 0 u g / m l ） 作用 C N E - 1 细胞 2 4 小时后，低密度（5 1 0 2 / 空）接种于 6 孔板，静置培养 1 5 天，计 算细胞克隆数。1 0 ，2 0 ，4 0 u g / m l 白桦脂酸作用 C N E - 1 细胞 7 2 小时后，倒置显微镜和 透射电子显微镜下分别观察白桦脂酸作用 C N E - 1 细胞后的形态学变化，流式细胞仪检 测其对 C N E - 1 细胞周期和凋亡的影响. 提取浓度为 2 0 u g / m l 和 4 0 u g / m l 白桦脂酸作用 7 2 h 后肿瘤细胞的R N A ， 计算R

12、N A 的浓度及纯度， 设计并合成b c l - 2 和内参照 a c t i n 的上游引物和下游引物，以提取的 m R N A为模板，按照试剂盒说明在 P C R 仪中进行 R T - P C R 反应，产物经琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪下显示结果，运用 l a b w o r k 3 0 . 软件分析结果，检测试验组和对照组 b c l - 2 m R N A 表达水平的差异。 结果： 1 . 白桦脂酸对 C N E - 1 细胞体外增殖的影响 M T T试验显示不同浓度白桦脂酸对 C N E - 1细胞增殖有抑制作用，抑制效果有时间 和剂量依赖趋势， 随时间延长和浓度增加， 抑制效果

13、逐渐增强。 2 4 h , 4 8 h 和 7 2 h 的 I C 5 0 分别为 3 7 . 4 6 u g / m l , 2 4 . 2 8 u g / m l , 2 1 . 1 5 u g / m l 。细胞集落形成试验显示白桦酯酸处理 组克隆形成率与未处理的对照组比较明显减少（p 0 . 0 1 ）. 流式细胞术结果显示白桦 脂酸作用后的 C N E - 1细胞出现 G0/ G1期的阻滞，而且阻滞程度随作用药物浓度增加而 明显， 1 0 ，2 0 ，4 0 u g / m l白桦脂酸处理组与空白对照组比较 G0/ G1期比例分别为 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4

14、 5 9 . 2 1 % , 7 2 . 2 0 % , 7 7 . 1 3 % v s 4 2 . 9 4 % 2 . 白桦脂酸对 C N E - 1 细胞凋亡的影响 白桦脂酸作用 C N E - 1细胞 7 2小时后，发现细胞变圆，胞浆内溶酶体增多，线粒 体肿胀，胞核皱缩，凋亡小体形成等典型的凋亡形态学变化；1 0 , 2 0 , 4 0 u g / m l白桦脂 酸处理 C N E - 1细胞 7 2 h 后与空白组比较凋亡比例分别为（1 3 . 9 5 % , 1 4 . 7 1 % , 2 1 . 9 9 % v s 4 . 0 2 % , P 0 . 0 5 ）；R T - P C

15、 R 显示白桦脂酸能够下调抑凋亡基因 b c l - 2 的表达。 结论： 白桦脂酸在体外能够抑制鼻咽癌细胞系 C N E - 1 的增殖，且抑制效果呈时间和剂量 依赖性。 其抑制鼻咽癌细胞C N E - 1 的增殖可能主要通过周期阻滞和诱导细胞凋亡介导。 而且白桦脂酸具有诱导 C N E - 1 凋亡的作用，其诱导细胞凋亡与下调抑凋亡 B c l - 2 表达 有关。 关键词：白桦脂酸；鼻咽癌；凋亡；B c l - 2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 ABSTRACT Objective The therapeutics of malignant tumor still

16、a big problem. At present,the major methods of tumor therapy are operation,chemotherapeutics and radiotherapy. Chemotherapeutics has gained a not bad effects for some inoperable tumors. Betulinic acid is a newly- discovered small molecular organic compound ，which was reported had widely anti- tumor effect.This study was designed to elucidate the effect of betulinic acid on proliferation and apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma