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1、选修1生物技术实践,第13单元 生物技术实践,第1讲 无菌操作技术实践,-4-,考点一,自主梳理,核心突破,典题试做,考点二,考点一微生物的培养和应用 1.培养基 (1)培养基的概念:为人工培养微生物而制备的,提供适合微生物 生长 、 繁殖 或积累 代谢产物 的营养基质。 (2)培养基的营养构成:一般都含有水、 碳源 (提供 碳 元素的物质)、 氮源 (提供 氮 元素的物质)和 无机物 等最基本的生命物质。,-5-,考点一,自主梳理,核心突破,典题试做,考点二,(3)培养基的分类,-6-,考点一,自主梳理,核心突破,典题试做,考点二,2.消毒和灭菌的比较,-7-,考点一,自主梳理,核心突破,典
2、题试做,考点二,3.细菌培养基的配制 (1) 牛肉膏蛋白胨培养基 是常用的细菌基础培养基。 (2)配制过程: 配制培养液调节pH分装包扎灭菌 搁置斜面。 (3)细菌培养基pH应调至 7.07.2 。分装时约为试管高度的 1/5 。 高压蒸汽灭菌 是常用的灭菌方法。温度为 121 ,气压为 100 kPa,灭菌 20 min。搁置斜面时,斜面长度不超过试管总长的 1/2 。,-8-,考点一,自主梳理,核心突破,典题试做,考点二,4.无菌操作和接种技术 (1)接种:通常把在 无菌 条件下将微生物接入培养基的操作过程叫做接种。 (2)接种工具:接种环用于 固体斜面培养基划线接种 ;接种针用于 穿刺接
3、种 ;玻璃刮铲用于 涂抹平板 。 (3)接种技术的关键:无菌操作。培养微生物用的 试管 、 培养皿 和微生物 培养基 等,在接种之前都需要灭菌 ,接种操作通常在 酒精灯火焰 附近进行。 (4)接种与培养大肠杆菌。,-9-,考点一,自主梳理,核心突破,典题试做,考点二,(5)大肠杆菌是进行微生物学、分子遗传学和基因工程研究的好材料,常存在于动物和人的 肠道 内,是肠道内的共生 菌群。大肠杆菌可以合成 维生素B 和 维生素K ,供机体吸收利用;一些菌株还能产生 大肠杆菌素 ,抑制肠道 致病菌和腐生菌 的滋生。中华人民共和国国家标准生活饮用水卫生标准规定生活饮用水中大肠菌群1 L不超过3个。,-10
4、-,考点一,自主梳理,核心突破,典题试做,考点二,5.微生物的分离和培养 (1)原理:在实验室中利用 选择 培养基可以筛选和分离出某种微生物,然后在高度稀释的条件下,在 固体 培养基上培养该微生物形成 单个菌落 ,即为纯培养物。 (2)方法 最常用的方法: 平板分离法 ,又包括涂抹平板法和 混合平板法 。 选择培养分离:科学家针对某种微生物的特性,设计一个特定的环境,使之特别适合这种微生物的生长,而抑制其他微生物的生长。这种通过 选择培养 进行微生物纯培养分离的技术,称为选择培养分离。,-11-,考点一,自主梳理,核心突破,典题试做,考点二,(3)土壤微生物的分离和计数 准备实验器材;采集土壤
5、,制备悬液;选择适于分离特定微生物的培养基;接种,从浓度最低的土壤悬液开始,用无菌移液管吸取1 mL加入到有相应标记的培养皿,再用不同的无菌移液管分别从不同浓度的悬液中吸取1 mL加入到有相应标记的培养皿中,每个浓度设置3个重复,采用 涂抹平板 法进行分离;培养与观察。,-12-,考点一,自主梳理,核心突破,典题试做,考点二,判一判(1)据物理状态的不同,培养基只有液体培养基和固体培养基两种类型。() (2)用平板划线法纯化大肠杆菌时不同阶段灼烧接种环的目的相同。(),提示:根据物理状态的不同,培养基可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基三种类型。,提示:第一次操作:杀死接种环上原有的微生
6、物;每次划线之前:杀死上次划线后接种环上残留的菌种,使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端;划线结束后:杀死接种环上残存的菌种,避免细菌污染环境和感染操作者。,-13-,考点一,自主梳理,核心突破,典题试做,考点二,(3)如果要分离土壤中能分解尿素的微生物,可采用唯一氮源为尿素的培养基。() (4)微生物对pH的要求不同的原因是不同微生物所含的酶的最适pH不同。(),提示:不同的微生物体内的酶所需的最适pH不同。,-14-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,典题试做,1.培养基的成分,-15-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,典题试做,-16-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,典题
7、试做,2.培养基的种类和用途,-17-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,典题试做,-18-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,典题试做,-19-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,典题试做,3.三种常用灭菌方法的比较,-20-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,典题试做,4.微生物的纯化培养技术 (1)原理:在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞,使其长成单个的菌落,这个菌落就是纯化的细菌菌落。 (2)微生物接种方法 平板划线法:平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中。在线的开始部分,微生物往往连在一起生长,随着线的延伸,菌数逐渐减少,最后可形成
8、纯种的单个菌落。,-21-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,典题试做,涂抹平板法:系列稀释操作。 a.将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌,并按10106的顺序编号。 b.用移液管吸取1 mL培养的菌液,注入10倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头,吹吸3次,使菌液与水充分混匀。 c.从10倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液,注入102倍稀释的试管中,重复b步的混匀操作。依次类推,直到完成最后1支试管的稀释。,-22-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,典题试做,例题根据所学生物学知识,完成下列问题。 (1)微生物所需的营养成分一般包括 、 、水和无机盐。 (2)培养微生物时,除考虑微
9、生物生长所需的营养外,还要考虑微生物生长所需的温度、 以及是否需要O2等。 (3)对培养基进行灭菌时,多采用 法,而对接种环或涂布器灭菌时则用 法。,-23-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,典题试做,(4)平板划线时,为保证每次划线都从上次划线末端的微生物浓度开始,所以每次划线前都要 ,平板划线结束后,最后一次划的线不能与第一次划的线 。 (5)脲酶可以将尿素分解为NH3,从而使尿素溶液pH升高,这可用 试剂来检验。用纤维素作唯一碳源的培养基培养微生物,得到的纤维素分解菌中可能还混有 。,-24-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,典题试做,答案:(1)碳源 氮源 (2)pH (3)高
10、压蒸汽灭菌 灼烧灭菌 (4)对接种环灼烧灭菌 相交(相接、相连、交叉等) (5)酚红 自养微生物(硝化细菌),解析:(1)(2)培养基中一般含有水、无机盐、碳源、氮源等物质;培养基中除含有营养物质外还需提供适宜的温度、pH、O2等。(3)培养基的灭菌常采用高压蒸汽灭菌法,玻璃器皿常采用干热灭菌,接种环等金属器具常采用灼烧灭菌。(4)考查平板划线法的操作方法,如果划线相重合则不能分离出纯种。(5)酚红可用以检验碱性溶液,用纤维素作唯一碳源的培养基培养微生物,能够得到纤维素分解菌,但由于自养微生物可以利用空气中的CO2作为碳源,也能在此培养基上生存。,-25-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,
11、典题试做,对应训练 微生物与人类关系密切。虽然有些微生物能使动植物患病,但大多数微生物对人类是有益的。请回答下列问题。 (1)培养微生物的培养基配方中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。从土壤中分离分解尿素的细菌时,培养基中加的唯一氮源为 ,这种培养基称为 培养基。 (2)在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的倒平板操作时,平板冷凝后,为什么要将平板倒置? 。 (3)微生物接种的方法很多,最常用的是平板划线法和 法。 在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗?为什么? 。,-26-,考点一,考点二,自主梳理,核心突破,典题试做,答案:(1)尿素 选择 (2)防止皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染,还可使培养
12、基表面的水分更好地挥发 (3)稀释涂布平板 需要,目的是防止菌种对环境造成污染和感染操作者,解析:要从土壤中分离出分解尿素的细菌,需用选择培养基,唯一的氮源是尿素。接种过程中,最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法两种方法。操作结束后灼烧接种环的目的是防止接种环上的菌种对环境造成污染和感染操作者。,-27-,考点一,考点二,自主梳理,典题试做,核心突破,考点二植物组织培养 1.概念:植物组织培养是指在 无菌 和 人工控制 的条件下,将 离体 的植物器官、组织或细胞,在适宜的培养条件下诱导其产生 愈伤组织 、 丛芽 和完整植株的技术。 2.植物组织培养的依据:植物细胞的 全能性 。植物细胞的全能性
13、是指植物体的每个细胞都携带着一套来自受精卵的完整 基因组 ,并具有发育成 完整植株 的潜在能力。 3.植物细胞全能性表达的条件: 无菌 、适宜的营养及其他外界条件。,-28-,考点一,考点二,自主梳理,典题试做,核心突破,4.取材:生产中广泛应用植物的 茎尖 或叶片进行组织培养,达到农作物品种的复壮、病毒感染的 脱除 和快速繁殖等目的。 5.天竺葵的组织培养 (1)准备:准备植物组织培养所需的实验器材及药品等。 (2)配制:配制MS基本培养基。分别向MS基本培养基中添加所需的 激素 ,配制诱导愈伤组织形成的培养基、分化芽的培养基、生根的培养基。将上述培养基调节pH后分装到若干个50 mL锥形瓶
14、中,塞上棉花塞,用牛皮纸包扎。 (3)灭菌:将培养基 121 湿热灭菌20 min,冷却后置于30 培养室中观察3 d,以检查是否灭菌彻底。灭菌彻底的培养基用于天竺葵的组织培养。,-29-,考点一,考点二,自主梳理,典题试做,核心突破,(4)取材与接种:在无菌室中或超净工作台上进行。取材后用10%的 漂白粉 或质量分数为2%的次氯酸钠溶液处理515 min,取出用 无菌水 冲洗,然后切成约0.5 cm2的小块,接种于配制好的诱导愈伤组织形成的培养基上。塞紧瓶口并用牛皮纸包扎。瓶上贴标签,注明材料名称、接种日期和接种人姓名或小组序号。在1520 、光照强度为1 0002 000 lx条件下,每天
15、光照10 h进行培养。 (5)观察与记录:观察 外植体 的生长情况,记录愈伤组织(一种具有 分生 能力的 薄壁 细胞)的大小、质地、颜色或根、芽分化等变化情况。 (6)转移培养:愈伤组织分化芽的培养基(1520 、光照强度为1 0002 000 lx)生根的培养基试管苗炼苗移栽于大田。,-30-,考点一,考点二,自主梳理,典题试做,核心突破,判一判植物组织培养的条件之一是材料必须是离体后的植物组织或器官。(),提示:离体的组织或器官发育成完整个体的过程才能体现全能性。,-31-,考点一,考点二,自主梳理,典题试做,核心突破,1.制备MS固体培养基 (1)配制各种母液:大量元素配制成10倍浓缩液
16、,微量元素配制成100倍浓缩液,微量有机物配制成1 mg/mL的母液。 (2)配制培养基:按配方称取琼脂、蔗糖以及各种母液,配制MS培养基。在菊花组织培养中,可以不添加植物激素,原因是菊花茎段组织培养比较容易。 (3)灭菌:采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法。,-32-,考点一,考点二,自主梳理,典题试做,核心突破,2.外植体消毒流程图,-33-,考点一,考点二,自主梳理,典题试做,核心突破,3.接种、培养、移栽和栽培 (1)前期准备:用70%的酒精消毒工作台,点燃酒精灯。所有工作都必须在酒精灯旁进行,器械使用前后都要用火焰灼烧灭菌。 (2)接种操作:插入外植体时形态学上端朝上,每个锥形瓶接种78个外植体。 (3)培养过程:应该放在
