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1、第二章 电离辐射的分子生物学效应,核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。 核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。,核酸概述,核酸的种类和分布,核酸分为两大类： 脱氧核糖核酸 （Deoxyribonucleic acid ，DNA） 核糖核酸 （Ribonucleic acid，RNA）,98核中（染色体中） 真核 线粒体（mDNA） 核外 叶绿体（ctDNA） DNA 拟核 原核 核外：质粒（plasmid） 病毒：DNA病毒,DNA的分布：,RNA主要存在于细胞质中,tRNA rRNA mRNA 其它 RNA病毒：SARS,分子生物学的中心
2、法则,核酸的基本化学组成,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 -D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,一、戊糖,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,三、核苷（nucleoside）,核苷： 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,五、多聚核苷酸（核酸）,多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH 与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示） 多聚核苷酸链具有
3、方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,DNA RNA,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,第一节 辐射所致DNA损伤及其 生物学意义,Nucleic Acid chemistry,DNA的结构,DNA的一级结构 脱氧核糖核酸的排列顺序 可以用碱基排列顺序表示 连接键：3，5-磷酸二酯键 磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架 碱基形成侧链 多核苷酸链均有5-末端和3-末端,DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓
4、于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,基因与基因组 基因（gene） 编码有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（DNA序列） 一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位（交换单位）。 一个基因不仅包括编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列，还包括保证转录所需的调控序列，位于编码上游5端的非编码序列、内含子和位于编码下游3端的非编码序列。,基因组（genome） 某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。 包括：核基因组（拟核/核DNA）及核外（质粒/质体DNA）,各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小,DNA的二级结构 DNA的双螺旋模型,1953年，
5、J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。 在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,稳定双螺旋的力 氢键 碱基堆积力（疏水相互作用及范德华力） 离子键等 DNA变性剂（热、pH、脲/酰胺、有机溶剂）,DNA的存在形式,真核 双链线性DNA（dsDNA）,DNA双螺旋缠绕在组蛋白珠外形成核小体，核小体自身堆积成纤维，纤维折叠起来并卷曲成不规则的螺旋状，形成染色体。,一、电离辐射致DNA的损伤,电离辐射损伤DNA途径: 直接作用 指射线直接作用于D
6、NA分子，通过电离和激发使DNA受到损伤。 间接作用 指射线与DNA周围其它原子或分子特别是水分子作用，产生具有很高活性的自由基（如OH，H和eaq-）进而损伤DNA。,DNA链断裂单链断裂（SSB） 双链断裂（DSB） DNA交联 DNA链交联 DNA-蛋白质交联 DNA二级和三级结构的变化 其中DSB是辐射所致生物学效应中最重要的原初损伤，而非重接性的DSB则被认为是细胞杀伤效应的最重要的损伤。,二、电离辐射致DNA分子的变化,一、DNA链断裂（DNA strand break) 单链断裂（single strand break，SSB)：DNA双螺旋结构中一条链断裂 双链断裂（doubl
7、e strand break，DSB)：DNA双螺旋结构中两条互补链于同一对应处或相邻处同时断裂,单链断裂,双链断裂,一）、DNA链断裂的分子机制,（1）脱氧戊糖和磷酸二酯键的破坏（直接） 三种自由基：eaq-，.OH，H. DNA链断裂主要与.OH作用有关，从脱氧戊糖抽氢，形成了5中不同的反应产物。,.OH从脱氧戊糖中抽氢，主要作用于C(3，5），C（3)上磷酸二酯键断裂多余C（5）端。 .OH攻击糖基C(1、2、4)形成碱不稳定性位点（alkali labile sites, ALS），这些位点在碱处理后发生链断裂。,碱不稳定性位点（ ALS） .OH对C（1）， C（2 ）， C（3），
8、 C（4）攻击后的产物，在与六氢吡啶供热后都能导致DNA链的断裂。所以，在DNA链上含有损失后经碱处理后导致DNA链断裂的位点，这些位点称为碱不稳定性位点（ ALS）,（2）碱基损伤 (base damage),1、充氧溶液中碱基损伤 嘧啶碱：羟自由基攻击5、6位 腺嘌呤：羟自由基攻击8位 鸟嘌呤：羟自由基攻击4、5、8位 2、细胞中碱基损伤 进展不大，用电子自旋共振仪,酶敏感位点(enzyme sensitive sites，ESS）：碱基损伤可引起DNA双螺旋的局部变性，特异的核酸内切酶能识别和切除这种损伤，并通过酶的作用，产生链断裂。这种特异性酶敏感位点称为ESS。 无嘌呤或无嘧啶位点
9、（apurinic/apyrimidinic sites ， APS）：DNA链上损伤的碱基可被特异的DNA糖基化酶除去或由于N糖基键的化学水解而丢失，形成APS。形成APS在内切酶的作用下形成链断裂。,二）、不同条件下辐射所致的DNA链断裂,1、充氧溶液中 DNA双链上引起SSB的概率均等，产额与放置时间、溶液PH有关。 2、固态下照射DNA 产生SSB与 PH有关。 以上两种情况均可产生ALS。 3、细胞中DNA受照射：与周围介质有关,三）、辐射引起DNA链断裂的主要特点,1、SSB与DSB的比值：1020 2、LET对链断裂的影响：随LET增加，SSB降低，DSB增加。 3、氧效应对链断
10、裂的影响：断裂增加，SSB增加明显。 4、DNA链断裂的部位：有争议。与ALS与碱基本身有关。,碱基位置发生断裂的顺序：GATC（低剂量），TGAC 5、DNA链断裂与细胞辐射敏感性的关系 无明显关系 损伤后修复与敏感性有关。,二、DNA交联（DNA cross-linking),交联种类 1、链间交联：DNA双螺旋结构中，一条链上的碱基与其互补链上的碱基以共价键结合。 2、链内交联：DNA分子同一条链上的两个碱基相互以共价键结合 3、DNA蛋白质交联（DNA-protein cross-linking ，DPC）：DNA与蛋白质以共价键结合,一）、DNA-Protein cross-link
11、ing （DPC),1DPC存在的证据 小牛胸腺脱氧核糖核蛋白(DNP)在UV或射线照射后，其中DNA的不能被提取的部分随着照射剂量的增加而增多，但如果用胰蛋白酶处理，则观察到这部分DNA 。这是因为UV和射线照射导致了DNA与核蛋白的交联，影响了DNP中DNA的提出，胰蛋白酶能够裂解DNA与蛋白质之间的共价键，消化DNP中的蛋白质部分所以全部DNA都能被提取出来.,2、DPC形成的分子机制 羟自由基有关（OH) DNA与蛋白质之间形成共价键的分子机制 1）辐射后蛋白质中的含硫氨基酸形成了自由基。 2）蛋白质中的芳香族氨基酸形成酚型或酚氧型自由基，这类自由基在DPC中起着主要作用。,3、影响D
12、PC形成的因素,氧效应：如：紫外线O2DPC 射线O2DPC 温度： 孵育（45）照射DPC 特别是肿瘤细胞，已用于临床 染色质的状态：染色质结构愈紧，愈容易交联。 细胞的不同周期，DPC不同。S期交联最多，G1,G2期很少,4、体内DPC形成时DNA和蛋白质的选择性,DNA的选择性：具有转录活性的DNA。此处易发生SSB,单修复也快。 蛋白质的选择性：组蛋白、非组蛋白、调节蛋白、拓扑异构酶以及与复制转录有关的核基质蛋白。 组蛋白中H3H4H2AH2B,二）、DNA-DNA链间交联,DAN 链间交联多见于化学损伤，如氮芥、硫芥等；放射损伤时较少见到。 放射损伤时，DNA链间交联与链断裂相互竞争
13、。,氮芥引起DNA分子两条链在鸟嘌呤上的交联 (a)交联附近的总图；(b)交联部分结构图,三）、DNA链内交联,多见于紫外线照射，电离辐射较少 在DNA 接近其最大吸收波长260nm 相邻的嘧啶碱基共价交联形成环丁烷四元环嘧啶二聚体 此反应是可逆的。 分布是非随机性的，相邻的两个T、或两个C、或C与T间都连成二聚体，其中最容易形成的是TT二聚体,环丁烷型嘧啶二聚体,三、DNA 二级和三级结构的变化,DNA变性：DNA双螺旋结构解开，氢键断裂，克原子磷消光系数显著升高，出现了增色效应，比旋光性和粘度降低，浮力密度升高，酸碱滴定曲线改变，同时失去生物活性。,增色效应和Tm值 Tm ：将DNA克原子
14、磷消光系数（P）值达到最高值1/2时的温度称之为熔解温度（Tm) 增色效应：随DNA变性程度的增加，其克原子磷消光系数值增大，这种现象称增色效应。 r射线照射后的特点： 1、Tm值 2、增色效应有限，与链间交联有关,旋光色散（optical rotatory dispersion,ORD)：DNA的ORD光谱在228和229nm波段有高峰，在257nm有低谷。 照射后，228和257nm发生与剂量呈线性的变化 粘度：随剂量的增加，粘度降低。,2.5,5.0,7.5,20,40,60,80,100,剩余比粘度,剂量，kGy,0.1%的鲑鱼精子DNA水溶液在不同温度照射下的粘度变化,四、DNA损伤
15、的生物学意义,1、点突变（point mutation) 1）碱基置换： 转换（transition):相同碱基间互换 颠换（transversion):不同碱基间互换 2）碱基缺失（base deletion),3）移码突变（frame-shift mutation) 4）碱基插入（base insertion) 转录和翻译后形成功能异常的蛋白质和酶，引起细胞突变或癌变。,2、DNA链断裂（DNA strand break) SSB,原核生物：致死性的,真核生物：修复,DSB：细胞可通过重组修复，但染色体畸变率高，可导致细胞死亡。,3、DNA交联 妨碍DNA半保留复制时复制叉的形成及复制的进
16、行，干扰转录时RNA聚合酶的结合和正常mRNA的生成，对基因的正常表达和调控带来严重的后果。 DNA修复 无错修复（error-free repair):有利于细胞恢复正常机能。 易错修复（error-prone repair)：导致基因突变。,第二节 辐射引起DNA功能与代谢变化,一、辐射对噬菌体DNA感染性的灭活作用,1、噬菌体 （Bacteriophage） 1）噬菌体是能感染细菌、放线菌、真菌、螺旋体的病毒（DNA病毒） 。 2）有严格的宿主特异性，只寄居于易感宿主菌体内。 3）电镜下噬菌体有三种外形，蝌蚪形、微球形和线形 。以蝌蚪形居多。,以蝌蚪形噬菌体为例： 头部和尾部两部分组成。 头部
