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1、第二章 电离辐射的分子生物学效应,核酸是一类重要的生物大分子,担负着生命信息的储存与传递。 核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域,是基因工程操作的核心分子。,核酸概述,核酸的种类和分布,核酸分为两大类: 脱氧核糖核酸 (Deoxyribonucleic acid ,DNA) 核糖核酸 (Ribonucleic acid,RNA),98核中(染色体中) 真核 线粒体(mDNA) 核外 叶绿体(ctDNA) DNA 拟核 原核 核外:质粒(plasmid) 病毒:DNA病毒,DNA的分布:,RNA主要存在于细胞质中,tRNA rRNA mRNA 其它 RNA病毒:SARS,分子生物学的中心
2、法则,核酸的基本化学组成,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 -D-2-脱氧核糖;RNA所含的糖则为-D-核糖。,一、戊糖,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多,大部分是上述碱基的甲基化产物。,三、核苷(nucleoside),核苷: 戊糖+碱基 糖与碱基之间的C-N键,称为C-N糖苷键,四、核苷酸(nucleotide) 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+碱基+磷酸,五、多聚核苷酸(核酸),多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3-OH 与另一分子核苷酸的5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,5-磷酸端(常用5-P表示);3-羟基端(常用3-OH表示) 多聚核苷酸链具有
3、方向性,当表示一个多聚核苷酸链时,必须注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,DNA RNA,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,第一节 辐射所致DNA损伤及其 生物学意义,Nucleic Acid chemistry,DNA的结构,DNA的一级结构 脱氧核糖核酸的排列顺序 可以用碱基排列顺序表示 连接键:3,5-磷酸二酯键 磷酸与戊糖顺序相连形成主链骨架 碱基形成侧链 多核苷酸链均有5-末端和3-末端,DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓
4、于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,基因与基因组 基因(gene) 编码有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列(DNA序列) 一段有功能的DNA片段,生物细胞中DNA分子的最小功能单位(交换单位)。 一个基因不仅包括编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列,还包括保证转录所需的调控序列,位于编码上游5端的非编码序列、内含子和位于编码下游3端的非编码序列。,基因组(genome) 某生物体(完整单倍体)所含全部遗传物质的总和。 包括:核基因组(拟核/核DNA)及核外(质粒/质体DNA),各种细胞、病毒和细菌质粒中基因组的大小,DNA的二级结构 DNA的双螺旋模型,1953年,
5、J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基础上,根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型,提出了著名的DNA双螺旋结构模型,并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。 在DNA分子中,嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,稳定双螺旋的力 氢键 碱基堆积力(疏水相互作用及范德华力) 离子键等 DNA变性剂(热、pH、脲/酰胺、有机溶剂),DNA的存在形式,真核 双链线性DNA(dsDNA),DNA双螺旋缠绕在组蛋白珠外形成核小体,核小体自身堆积成纤维,纤维折叠起来并卷曲成不规则的螺旋状,形成染色体。,一、电离辐射致DNA的损伤,电离辐射损伤DNA途径: 直接作用 指射线直接作用于D
6、NA分子,通过电离和激发使DNA受到损伤。 间接作用 指射线与DNA周围其它原子或分子特别是水分子作用,产生具有很高活性的自由基(如OH,H和eaq-)进而损伤DNA。,DNA链断裂单链断裂(SSB) 双链断裂(DSB) DNA交联 DNA链交联 DNA-蛋白质交联 DNA二级和三级结构的变化 其中DSB是辐射所致生物学效应中最重要的原初损伤,而非重接性的DSB则被认为是细胞杀伤效应的最重要的损伤。,二、电离辐射致DNA分子的变化,一、DNA链断裂(DNA strand break) 单链断裂(single strand break,SSB):DNA双螺旋结构中一条链断裂 双链断裂(doubl
7、e strand break,DSB):DNA双螺旋结构中两条互补链于同一对应处或相邻处同时断裂,单链断裂,双链断裂,一)、DNA链断裂的分子机制,(1)脱氧戊糖和磷酸二酯键的破坏(直接) 三种自由基:eaq-,.OH,H. DNA链断裂主要与.OH作用有关,从脱氧戊糖抽氢,形成了5中不同的反应产物。,.OH从脱氧戊糖中抽氢,主要作用于C(3,5),C(3)上磷酸二酯键断裂多余C(5)端。 .OH攻击糖基C(1、2、4)形成碱不稳定性位点(alkali labile sites, ALS),这些位点在碱处理后发生链断裂。,碱不稳定性位点( ALS) .OH对C(1), C(2 ), C(3),
8、 C(4)攻击后的产物,在与六氢吡啶供热后都能导致DNA链的断裂。所以,在DNA链上含有损失后经碱处理后导致DNA链断裂的位点,这些位点称为碱不稳定性位点( ALS),(2)碱基损伤 (base damage),1、充氧溶液中碱基损伤 嘧啶碱:羟自由基攻击5、6位 腺嘌呤:羟自由基攻击8位 鸟嘌呤:羟自由基攻击4、5、8位 2、细胞中碱基损伤 进展不大,用电子自旋共振仪,酶敏感位点(enzyme sensitive sites,ESS):碱基损伤可引起DNA双螺旋的局部变性,特异的核酸内切酶能识别和切除这种损伤,并通过酶的作用,产生链断裂。这种特异性酶敏感位点称为ESS。 无嘌呤或无嘧啶位点
9、(apurinic/apyrimidinic sites , APS):DNA链上损伤的碱基可被特异的DNA糖基化酶除去或由于N糖基键的化学水解而丢失,形成APS。形成APS在内切酶的作用下形成链断裂。,二)、不同条件下辐射所致的DNA链断裂,1、充氧溶液中 DNA双链上引起SSB的概率均等,产额与放置时间、溶液PH有关。 2、固态下照射DNA 产生SSB与 PH有关。 以上两种情况均可产生ALS。 3、细胞中DNA受照射:与周围介质有关,三)、辐射引起DNA链断裂的主要特点,1、SSB与DSB的比值:1020 2、LET对链断裂的影响:随LET增加,SSB降低,DSB增加。 3、氧效应对链断
10、裂的影响:断裂增加,SSB增加明显。 4、DNA链断裂的部位:有争议。与ALS与碱基本身有关。,碱基位置发生断裂的顺序:GATC(低剂量),TGAC 5、DNA链断裂与细胞辐射敏感性的关系 无明显关系 损伤后修复与敏感性有关。,二、DNA交联(DNA cross-linking),交联种类 1、链间交联:DNA双螺旋结构中,一条链上的碱基与其互补链上的碱基以共价键结合。 2、链内交联:DNA分子同一条链上的两个碱基相互以共价键结合 3、DNA蛋白质交联(DNA-protein cross-linking ,DPC):DNA与蛋白质以共价键结合,一)、DNA-Protein cross-link
11、ing (DPC),1DPC存在的证据 小牛胸腺脱氧核糖核蛋白(DNP)在UV或射线照射后,其中DNA的不能被提取的部分随着照射剂量的增加而增多,但如果用胰蛋白酶处理,则观察到这部分DNA 。这是因为UV和射线照射导致了DNA与核蛋白的交联,影响了DNP中DNA的提出,胰蛋白酶能够裂解DNA与蛋白质之间的共价键,消化DNP中的蛋白质部分所以全部DNA都能被提取出来.,2、DPC形成的分子机制 羟自由基有关(OH) DNA与蛋白质之间形成共价键的分子机制 1)辐射后蛋白质中的含硫氨基酸形成了自由基。 2)蛋白质中的芳香族氨基酸形成酚型或酚氧型自由基,这类自由基在DPC中起着主要作用。,3、影响D
12、PC形成的因素,氧效应:如:紫外线O2DPC 射线O2DPC 温度: 孵育(45)照射DPC 特别是肿瘤细胞,已用于临床 染色质的状态:染色质结构愈紧,愈容易交联。 细胞的不同周期,DPC不同。S期交联最多,G1,G2期很少,4、体内DPC形成时DNA和蛋白质的选择性,DNA的选择性:具有转录活性的DNA。此处易发生SSB,单修复也快。 蛋白质的选择性:组蛋白、非组蛋白、调节蛋白、拓扑异构酶以及与复制转录有关的核基质蛋白。 组蛋白中H3H4H2AH2B,二)、DNA-DNA链间交联,DAN 链间交联多见于化学损伤,如氮芥、硫芥等;放射损伤时较少见到。 放射损伤时,DNA链间交联与链断裂相互竞争
13、。,氮芥引起DNA分子两条链在鸟嘌呤上的交联 (a)交联附近的总图;(b)交联部分结构图,三)、DNA链内交联,多见于紫外线照射,电离辐射较少 在DNA 接近其最大吸收波长260nm 相邻的嘧啶碱基共价交联形成环丁烷四元环嘧啶二聚体 此反应是可逆的。 分布是非随机性的,相邻的两个T、或两个C、或C与T间都连成二聚体,其中最容易形成的是TT二聚体,环丁烷型嘧啶二聚体,三、DNA 二级和三级结构的变化,DNA变性:DNA双螺旋结构解开,氢键断裂,克原子磷消光系数显著升高,出现了增色效应,比旋光性和粘度降低,浮力密度升高,酸碱滴定曲线改变,同时失去生物活性。,增色效应和Tm值 Tm :将DNA克原子
14、磷消光系数(P)值达到最高值1/2时的温度称之为熔解温度(Tm) 增色效应:随DNA变性程度的增加,其克原子磷消光系数值增大,这种现象称增色效应。 r射线照射后的特点: 1、Tm值 2、增色效应有限,与链间交联有关,旋光色散(optical rotatory dispersion,ORD):DNA的ORD光谱在228和229nm波段有高峰,在257nm有低谷。 照射后,228和257nm发生与剂量呈线性的变化 粘度:随剂量的增加,粘度降低。,2.5,5.0,7.5,20,40,60,80,100,剩余比粘度,剂量,kGy,0.1%的鲑鱼精子DNA水溶液在不同温度照射下的粘度变化,四、DNA损伤
15、的生物学意义,1、点突变(point mutation) 1)碱基置换: 转换(transition):相同碱基间互换 颠换(transversion):不同碱基间互换 2)碱基缺失(base deletion),3)移码突变(frame-shift mutation) 4)碱基插入(base insertion) 转录和翻译后形成功能异常的蛋白质和酶,引起细胞突变或癌变。,2、DNA链断裂(DNA strand break) SSB,原核生物:致死性的,真核生物:修复,DSB:细胞可通过重组修复,但染色体畸变率高,可导致细胞死亡。,3、DNA交联 妨碍DNA半保留复制时复制叉的形成及复制的进
16、行,干扰转录时RNA聚合酶的结合和正常mRNA的生成,对基因的正常表达和调控带来严重的后果。 DNA修复 无错修复(error-free repair):有利于细胞恢复正常机能。 易错修复(error-prone repair):导致基因突变。,第二节 辐射引起DNA功能与代谢变化,一、辐射对噬菌体DNA感染性的灭活作用,1、噬菌体 (Bacteriophage) 1)噬菌体是能感染细菌、放线菌、真菌、螺旋体的病毒(DNA病毒) 。 2)有严格的宿主特异性,只寄居于易感宿主菌体内。 3)电镜下噬菌体有三种外形,蝌蚪形、微球形和线形 。以蝌蚪形居多。,以蝌蚪形噬菌体为例: 头部和尾部两部分组成。 头部