第02章色谱法分离原理

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1、1,第二章 气相色谱分析,第一节 色谱法概述 第二节 气相色谱分析理论基础 第三节 色谱分离条件的选择 第四节 固定相及其选择 第五节 气相色谱检测器 第六节 气相色谱定性和定量分析 第七节 毛细管柱气相色谱法,2,第一节 色谱法概述,一、色谱法简介 色谱法是1901年由俄国植物学家茨维特（Tsweet）提出，最初的认识是在于它的分离价值，用于分离植物中的色素等有色物质。现代的发展，不再局限于有色物质，而且大量用于分离无色物质。,3,俄国植物学家Tswett（茨威特）首先认识到这种层析现象在分离分析方面有重大价值，他一生从事植物色素的提纯与分离工作。 1901年开始色谱分离方法研究 1903年

2、3月21日在华沙自然科学学会生物会议上提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法。（论文：一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用） W. S. Tswett, Tr. Protok, Varshav. Estesvoispyt. Otd. Biol., 1903, 14.,4,20年后，即1923年以后，Kuhn和Lederer为了证实蛋黄内的叶黄素系植物叶黄素与玉米黄质的混合物，参考了茨威特的文章后，采用了色谱法，他们采用CaCO3填充柱成功的从蛋黄中分离出了植物叶黄素。他们的工作证实了茨威特的方法可以用来进行制备分离。 从此以后，色谱法被广泛的用于各种天然有机化合物的分析与分离。,5,1940

3、1943年，瑞典科学家Tiselius（蒂西利斯）和英国科学家Synge（辛吉）创立了液相色谱的迎头法与顶替法。并由于在吸附色谱、电泳等方面做出了重要贡献，使Tiselius获得了1948年的诺贝尔化学奖。 1941年，英国科学家Martin（马丁）和Synge（辛吉）在研究氨基酸的分离时又发展了液-液分配色谱法，开创了分配色谱的新阶段，他们因此获得了1952年的诺贝尔化学奖。,6,1952年，Martin和James采用了自动滴液仪作检测器分析脂肪酸，开创了气体作流动相的气-液色谱法。他们采用涂渍在惰性载体上的高沸点液体为固定相，以溶解分配原理代替了吸附分配原理，大大的扩展了气相色谱法的应用

4、范围，弥补了吸附剂种类不多的缺陷。因此，他们在分析化学界产生了巨大的影响。 1958年，Golay（戈雷）提出了分离效能极高的毛细管气相色谱法。 从此以后，气相色谱技术得到了广泛的应用，蓬勃发展起来。,7,随着对色谱法的深入研究和相关技术的不断发展，新一代的色谱方法不断的涌现： 离子色谱: 20世纪70年代出现了采用自动电导检测器分析痕量正负离子的新式离子交换色谱。 超临界流体色谱：Klesper等人1962年提出， 20世纪80年代后开始应用毛细管柱。目前已成为填补气相色谱与液相色谱之间空白的主要手段。 毛细管电泳： 20世纪80年代发展起来，结合了电毛细管技术及色谱微量检测方法，运用在电场

5、中离子迁移速度不同的原理进行分离分析。,8,俄国植物学家茨维特在1901年使用的色谱原型装置，如图。 色谱法是一种分离技术。 试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。 其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体(气体或液体),称为流动相。,9,色谱分离原理,当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当

6、的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。,10,两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础。 这种借在两相间分配原理而使混合物中各组分分离的技术，称为色谱分离技术或色谱法。,二、色谱法分类 1、按两相物理状态分类 气相色谱（气体作流动相） 气-固色谱、气-液色谱 液相色谱（液体作流动相） 液-固色谱、液-液色谱,11,2、按固定相的形式分类,柱色谱：固定相装在色谱柱中，分为填充柱色谱和毛细管色谱。 纸色谱：滤纸为固定相 薄层色谱：吸附剂粉末制成薄层作固定相,12,3、按分离过程中物理化学原理分类,吸附色谱：吸附剂表面对不同组分的物理吸附性 能差异 分配色谱：不同组分在两相中有不同的分配

7、系数 离子交换色谱：利用离子交换原理 排阻色谱：利用多孔性物质对不同大小分子的排阻作用,按其它原理：凝胶色谱 超临界流体色谱 高效毛细管电泳,13,三、色谱法的特点,（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。 （2） 灵敏度高 可以检测出10-610-9g的物质。 （3） 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 （4） 应用范围广 几乎所有的化学物质。 不足之处： 被分离组分（未知物）的定性较为困难。,14,四、气相色谱法,15,16,M6单四极杆气相色谱质谱联用仪,17,1、气相色谱流程,1-载气钢瓶； 2-减压阀； 3-净化干燥管； 4-针形阀；

8、5-流量计； 6-压力表； 7-进样器； 8-色谱柱； 9-热导检测器； 10-放大器； 11-温度控制器； 12-记录仪,18,载气系统、进样系统、色谱柱、检测器、记录系统、温度控制系统。,19,2、载气系统 包括气源、净化干燥管和载气流速控制。,20,3. 进样系统 包括进样器及气化室。其作用是将液体或固体试样，在进入色谱柱前瞬间气化，快速定量地转入到色谱柱中。 (1) 进样器 微量注射器和六通阀,21,22,23,24,25,(2) 气化室 为了让试样在气化室中瞬间气化而不被分解，要求气化室热容量大，无催化效应。 为了减小柱前色谱峰变宽，气化室的死体积应尽可能小。,26,4、分离系统和温

9、度控制系统 色谱柱：色谱仪的核心 填充柱（填充固定相） 毛细管柱 （内壁涂有固定液） 温度控制系统：柱室、气化室的温度控制,5、记录系统： 放大器、记录仪或数据处理仪,27,五 色谱法常用术语,1、色谱图,色谱图（色谱峰）：组分从色谱柱流出，检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线。,28,2、基线,仅有流动相通过色谱柱时，检测响应信号随时间变化的曲线。稳定的基线应该是平行于时间坐标的直线。,29,色谱峰顶点与基线之间的垂直距离,3、色谱峰高,30,4、色谱峰区域宽度,色谱峰的区域宽度是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。 度量色谱峰区域宽度通常有三种方法

10、： （1）标准偏差：0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半 （2）半高峰宽Y1/2：峰高一半处对应的色谱峰宽 Y1/2=2(2ln2)1/2 = 2.354,31,（3）色谱峰底宽Y：色谱峰两侧拐点作切线与基线交点间距离。 Y4,32,（1）死时间tM：不被固定相保留的组分从进样到色谱图上出现峰最大值所需的时间。 u流动相的线速度，L柱长 （2）保留时间tR：试样从进样开始到柱后出现峰极大值所需的时间。 相应于试样到达柱末端的检测器所需的时间。,5、保留值,33,（3）调整保留时间tR： 扣除死时间后的保留时间 tRtRtM 死体积VM： VMtMqv,0 qv,0色谱柱出口载气流量mL/min

11、保留体积VR：试样从进样开始到柱后出现峰极大值所需的载气体积 VRtRqv,0 调整保留体积VR：VRVRVM,34,由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关,而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关,色谱法中,特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据。,(4)相对保留值2.1,某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比,35,色谱流出曲线得到的信息 1）根据色谱峰的个数，可以判断试样中所含组分的最少个数。 2）根据色谱峰的保留值或位置，可以进行定性分析。 3）根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析。 4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。 5）色谱峰两峰间的距离，是

12、评价固定相和流动相选择是否合适的依据。,36,第二节 气相色谱分析理论基础,1、分离原理 色谱法实质是一种物理化学的分离方法。它是根据混合物各组分在互不相溶的两相固定相和流动相中具有不同的吸附能力、分配系数或其它亲和作用的性质作为分离依据，当两相作相对运动时，组分在两相中反复多次分配，这样就使得那些吸附能力或分配系数只有微小差别的物质，在移动速度上产生了较大差别，从而达到完全分离。,一、色谱法分离原理,37,2、分配系数 K,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。 在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示

13、，即：,38,分配系数 一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢； 试样一定时，K主要取决于固定相性质； 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。,39,3、分配比k（容量因子）,分配比k：在一定的温度、压力下，在两相间达到分配平衡时，组分在两相中的质量比。,40,VM与VS之比称为相比（phase ratio,），它反映了各种色谱柱型及其结构的重要特性。 填充柱值约为635 毛细管柱值为501500,41,分配系数K和分配比k都与温度、压力、组分的性质、固定相和

14、流动相的性质有关，分配比k还与值有关。K与k是两个不同的参数，但在表征组分的分离行为时，二者是等效的。 k可以由色谱图直接求得，所以容量因子k是一个重要的色谱参数。,42,当某一组分的色谱峰最高点出现时，说明该组分恰好有一半的量洗脱在VR的流动相中刚好流出柱子，其余一半则留在柱内，即留在柱内的流动相（体积为Vm）与固定相（体积为VS）中，根据物料等衡原理：,4、K、k与保留值的关系,43,调整保留体积VR与分配系数成正比。是色谱过程的基本方程，将反映色谱行为的保留值（VR、VM、VR）与反映物质性质的热力学常数K联系起来。,44,容量因子k是调整保留时间和死时间之比，即表示溶质分子花费在固定相

15、中的时间比在流动相中长多少倍。,45,46,将色谱柱假想为一个精馏塔，塔内有一系列连续的、相等体积的塔板，每一块塔板的高度称理论塔板高度H。并假设在每一块塔板上被分离组分在气液两相间瞬时达到一次分配平衡，若色谱柱长为L，溶质平衡的次数则为: n=L/H n理论塔板数，H为每一块塔板的高度。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。,二、塔板理论（plate theory）,47,将色谱分离过程比作蒸馏过程，直接引用处理蒸馏过程的概念、理论和方法来处理色谱过程，即将连续的色谱过程看作是许多小段平衡过程的重复。,48,塔板理论假设： （1）在每一小段间隔内，气相平

16、均组成和液相平均组成可以很快地达到分配平衡。达到分配平衡的每一小段柱长称为理论塔板高度（H）； （2）载气（流动相）进入色谱柱，不是连续的而是脉动式的，每次进气为一个板体积； （3）试样开始时都加在第0号塔板上，且试样沿色谱柱方向的扩散（纵向扩散）可忽略不计； （4）分配系数在各塔板上是常数。,49,塔板理论指出： （1）当溶质在柱中的平衡次数，即n50时，可得到基本对称的峰形曲线。 气相色谱，n约为103106，流出曲线趋近正态分布曲线。 （2）试样进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，可获得良好的分离。 （3）由塔板理论可导出n与半峰宽度或峰底宽度的关系：,50,有效塔板数和有效塔板高度 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 组分在tM时间内不参与柱内分配。 需引入有效 塔板数和有效塔板高度：,51,塔板理论的特点和不足 1.当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越