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1、第二章 菌种的选取和培育2.1 试验材料和方法2.1.1 材料- 2003年5月29日，从微生物研究所购买枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC 9372）和球毛壳菌（Chaetomium globosom IFO 6347）各一支。- 2003年6月5日，从微生物研究所再购买了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC 9372）和球毛壳菌（Chaetomium globosom IFO 6347）各一支，作为备份和对比。 2.1.2 试剂培养- Linde Grain Medium营养液- 无菌水2.1.3 主要仪器和设备- 冰箱- 培养箱- 100mL
2、 带塞锥形瓶- 接种针- 酒精灯- 试管架- 20毫升试管- 微生物实验室- 高速台式离心机TGL-16G （上海安亭科学仪器厂）- 快速旋涡混匀器 JY-B (江苏姜堰市沈高康健生化器具厂)- 杀菌釜- 标签/记号笔- 水浴锅- 电子温度计http:/ 实验方法2.1.4.1放大培养a. 在对微生物实验室进行消毒和紫外线照射准备；b. 对微生物培养用的器具进行121C下20分钟杀菌； 按供应商的要求准备和对营养液进行杀菌；c. 在二个100mL 三角瓶中分别加入50mL LGM营养液；从冰箱取出枯草芽孢杆菌和球毛壳菌种样品，在无菌环境中小心分别加入二个100mL 三角瓶中，盖上透气硅胶塞后摇
3、匀；d. 枯草芽孢杆菌接种LGM营养液，35 oC培养2天；球毛壳菌接种LGM营养液，25 oC培养5-7天。e. 斜面接种：从已生长好的菌种溶液中，挑取少量的菌种移植到另一支新鲜的斜面培养基上的一种方法。具体操作见附录1。f. 对斜面进行培养，通过观察确定培养终点。g. 枯草芽孢杆菌收集：用（0.85%NaCl）无菌生理盐水将菌种从斜面上洗脱，离心3次纯化。使用6000rpm的高速离心机，一个试管采一个离心管。多次洗脱，一般3次以上。h. 使用快速旋涡混匀器使枯草芽孢杆菌聚集体从离心管底部脱离。2040管并一根。得到两管枯草芽孢杆菌：A管和B管。i. 热处理： - 使用一个离心管，存有与待处
4、理样品相同容量无菌生理盐水，插入电子温度计进行观察记录温度；- 热处理80oC 10分钟。j. 得到两管枯草芽孢杆菌：A管(使用)和B管(备用)。放入冰箱保存。k. 球毛壳菌接种马铃薯葡萄糖琼脂斜面，25 oC培养数天。采收多根试管。使用玻璃珠搅碎。硅胶塞来密封试管，可以透气。孢子囊。观察变黑。150mL 三角瓶收集到100mL震动器震动。使用6000rpm的高速离心机，一个试管采一个离心管。多次洗脱，一般3次以上。2.1.4.2菌种确定和纯化计数2.1.4.2.1 菌种确定枯草芽孢杆菌：因选用的菌种是来源于专业机构的纯种菌种，确认只是辅助的、使用初步的方法进行。对培养过程中菌落的形态进行观察
5、；使用格兰氏染色法进行确认。实验使用的格兰氏染色法，具体见：附录2球毛壳菌：球毛壳菌鉴别：青色菌丝，孢子为黑色。2.1.4.2.2 纯化计数枯草芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌梯度稀释，浇胰蛋白胨大豆琼脂平板，35 oC培养2天读数。稀释了10个梯度。梯度稀释：有一未知浓度的菌液，用一支1ml的无菌吸管从中吸取1ml菌液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后再用一支1ml的无菌吸管从中吸取1ml菌液加入另一盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，依次类推，制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7等不同稀释度的菌液。各稀释度的溶液，在充分混匀后取1毫升样品进行培养。计数，
6、得结果如下：试管A: 2.1108 CFU/ml试管B: 2.5108 CFU/ml球毛壳菌：球毛壳菌梯度稀释，浇马铃薯葡萄糖琼脂平板，25 oC培养5天读数。球毛壳菌平板读数结果：2.6107 CFU/ml2.1.4.2.3 菌种对实验用培养基的适应确认LG培养基的生长支持试验：将枯草芽孢杆菌作梯度稀释，分别吸取1ml 10-5, 10-6, 10-7，10-10，左右的菌液至2块无菌平板，倒入胰蛋白胨大豆琼脂，同时分别吸取1ml 10-5, 10-6, 10-7的菌液至2支装有10ml LG培养基的试管中，35oC培养2-3天，平板读数和检查试管的混浊度。球毛壳菌的测试同上，梯度3-7左右
7、，使用马铃薯葡萄糖琼脂浇平板，平板和试管放25oC培养3-5天。结果：Bacillus subtilis concentration(CFU/ml)枯草芽孢杆菌浓度TSA Plate Count平板读数LG培养基试管观察10-5无法计数, 无法计数生长, 生长10-6257, 273生长, 生长10-730, 31生长, 生长Chaetomium globosum concentration(CFU/ml)球毛壳菌浓度PDA Plate Count平板读数LG培养基试管观察10-5无法计数, 无法计数生长, 生长10-629, 22生长, 生长10-76, 3生长, 生长胰蛋白胨大豆肉汤培养基
8、的生长支持试验：将枯草芽孢杆菌作梯度稀释，分别吸取1ml 10-5, 10-6, 10-7的菌液至2块无菌平板，倒入胰蛋白胨大豆琼脂，同时分别吸取1ml 10-5, 10-6, 10-7的菌液至2支装有10ml 胰蛋白胨大豆肉汤培养基的试管中，35oC培养2-3天，平板读数和检查试管的混浊度。球毛壳菌的测试同上，使用马铃薯葡萄糖琼脂浇平板，平板和试管放25oC培养3-5天。2.2 结果与讨论2.2.1 菌种的选取和确认微生物广泛存在于原料、包装和环境中，如：水、牛奶、蔬菜、果汁、瓶、盖、动物、无机原料等上面。如果产品在包装后，产品中仍然含有微生物，产品就很有可能引起感官上的变质，有菌块或菌团；
9、有些微生物甚至会引起食物中毒。以下是食品中常见的微生物群属（Group of Bacteria）： GroupFamilyGeneraSpiral and curved bacteriaSpirallaceaeCampylobacterGram-negative aerobic rods and cocciPseudomonadaceaePseudomonas, Altermonas,Gluconobacter, Xanthomonas,ShewanellaGram-negative facultative anaerobic rodsEnterobacteriaceaeEscherichia
10、, Citrobacter,Salmonella, Shigella,Klabsiella, Enterobacter,Serratia, Proteus, Yersinia,Erwinia, Haffnia, Arizona,PantoeaGram-negative facultative anaerobic rodsVibrionaceaeVibrio, AeromonasGenera of uncertain affinityFlavobacterium, ChromobacteriumGram-negative diplococci and diplococcibacilliNeiss
11、eriaceaeMoraxella, Acinetobacter, PsychrobacterGram-positive cocciMicroccocaeceStreptococcaceaePeptococcusMicrococcus, Staphylococcus,Streptococcus, Leuconostoc,Pediococcus, Lactococcus,Enteroccus, CarnobacteriumVagococcusSarcinaEndospore-forming rods and cocciBacillaceaeClostridium, BacillusGram-po
12、sitive asporogenous rods of regular shapeLactobacillaceaeGenera of uncertain affinityLactobacillus, BrochothrixListeriaNon-spore-forming rods of irregular shapeCoryneform bacteriaArthrobacter, Brevibacterium,Propionibacterium预计可能在调试、生产运作时最可能的微生物来源：- 肠杆菌科（Enterobacteriaceae）：常来源于人体；- 杆状菌、孢子菌或霉菌（Bacil
13、lus or spore forming bacteria or mould）常来源于土壤、空气或环境；- 假单胞菌（Pseudomonas）常来源于水源。我们需要选取生存能力最强，不易被杀死的菌品种，进行测试。这样，在实际的生产中才能保证生产线有能力保证无菌的环境和运作。此无菌灌注杀菌工艺中，是使用过氧乙酸(PAA)进行杀菌，因此，我们还要考虑选取最耐PAA的菌作为指标菌。经过与化学品供应商、各微生物研究所、设备供应商和我司自己的经验，总结出以下产品分类和指标菌：产品指标菌茶、果汁Chaetomium globosom IFO 6347,Bacillus subtilis ATCC 9372
14、 or Bacillus globigii spores瓶装水Pseudomonas aeruginosa, Cladosporium cladosporioides根据生产茶和果汁产品的需要，我们选取从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ATCC 9372）和球毛壳菌（Chaetomium globosom IFO 6347）分别代表细菌类和真菌类作为本实验的指标菌。2.2.2对菌种样品的确认和计数在培养的过程中观察菌落形态和特性，用以判断菌种是否是所需菌种？菌种是否被污染？培养终点是否已到？2.2.2.1 枯草芽孢杆菌菌种鉴别：菌种形态：胰蛋白胨大豆琼脂斜面上为白色不规则形菌落革兰氏染色：革兰氏阳性杆菌实验中我们观察到枯草芽孢杆菌的生长形态符合指定的菌种形态和特征：革兰氏染色的结果在排除指示干扰后确认为阳性。2.2.2.2 球毛壳菌种鉴别实验中我们观察到球毛壳的生长形态符合指定的菌种形态和特征：2.2.2 菌含量的确定经洗取相同数量的试管斜面，得到的结果接近，在同一数量级。2.2.3结论a) 菌种品种的初步鉴定确认结果显示：符合指定菌种的形态特征。b) 实验中发现，指标菌的培养和生长正常，均转为孢子体状态，满足实验需求。c) 得到的菌种数量符合要求。d) 按配方配制的LG培养基可以支持枯草芽孢杆菌和球毛壳菌的生长，可以用于微生物验证试验。（所有微生物
