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1、 儿童原发性免疫缺陷病的临床表型及基因诊断分析 原发性免疫缺陷病是由遗传因素使致免疫细胞或免疫分子缺陷引起免疫反应缺如或降低,导致机体抗感染免疫能力低下的一组临床疾病1。自1952年发现首例X-连锁无丙种球蛋白血症(X-Iinked agammaglobulinemia,XL A)以来,随着分子生物学和遗传学技术的快速发展,很多PID病例被不断发现,新发现PID种类也逐年增多,成为儿科临床的一组重要疾病。迄今共发现200多种PID,其中150余种已明确致病基因。最近每年都有2-3种新的PID和致病基因被发现,是目前儿科临床及免疫学界的热点领域。 PID临床表现多种多样,程度轻重不一,但共同临床
2、特点均为严重、反复或持久的感染,自身免疫性疾病和肿瘤发生率高。临床工作中能否及时诊断出原发性免疫缺陷病十分重要,因为大部分患有PID (如细胞免疫缺陷)的患儿都不能接种减毒的活病毒疫苗,接种后往往可造成感染,并且PID患儿也不能接触已经服用了活的脊髓灰质炎病毒疫苗的儿童。我国由于不能及时的诊断原发性免疫缺陷病,疫苗接种所造成的不必要感染应引起高度注意。T淋巴细胞缺陷的患儿必须使用血制品时,应使用未感染过巨细胞病毒并经照射处理过的血制品,否则有可能感染巨细胞病毒,并且起移植物抗宿主疾病。而选择性IgA缺乏症的患儿应避免使用含有IgA的血制品,否则可使机体致敏,产生抗IgA抗体。此外重症PID病儿
3、生后易患严重、反复或持久的感染,并且发生自身免疫性疾病和肿瘤,尤其是淋巴系统肿瘤的发生率较正常人群高数10倍乃至100倍以上。对于临床表现不典型的轻症PID患者,如不能及时诊断、缺乏适当治疗,也必将导致生活质量低下和由反复感染引起的残疾。虽然目前免疫调节剂的品种繁多,但往往对原发性免疫缺陷病很难起到真正的作用,如果不能及时诊断PID,泛泛应用这些免疫调节剂,往往可能延误病情,耽误可治疗的机会。PID主要发生在儿童时期,大约40%起病于1岁以内,40%在5岁以内,15%于16岁以内,仅5%发病于成人期2。另外PID具有高度的异质性,其缺陷可引起免疫应答的多方面缺如或紊乱,临床表现从机体对微生物的
4、易感性增加,到变态反应和自身免疫,以及淋巴组织增生和肿瘤等。因此,要想及时地发现原发性免疫缺陷病,则应全面提高儿科、产科、儿童保健医师对PID的认识,从而尽可能早期诊断和治疗PID患者,减少其致残、致死率。 有关PID的发病率,世界范围内已有许多国家 展了全国范围的PID登记,并且公布了其发病情况,根据国外的资料,澳大利亚报道PID发病率约为人口的2.82/100()003,其中还不包括无症状性IgA、IgG亚类缺乏和补体缺陷;而日本和瑞典报道约为1/5 000;我国香港地区报道约为1/8 0004,不同类型PID发病情况差异很大,如重症联合免疫缺陷病(Severe combined immu
5、nodeficiency disease,SCID)的发病率为1/100 000,白人健康献血者中选择性IgA缺乏症的发病率为1/3285。我国大陆尚未建立完善的原发性免疫缺陷病登记,至今尚无有关该病发病率的资料,故缺乏流行病学的统计学数据。若按PID总发病率为1/5 000活产婴,我国每年3 000万新生儿计算,每年将新增PID病例约6 000例,考虑到许多病例因得不到诊断和治疗而死亡,儿童期累积存活病例可能多达510万例。但是截止目前,全国确诊病例数仍不足500例,亦即超过99%的PID病例并未得到及时诊断和治疗,可见及时发现、诊断并治疗该病的重要性。 然而由于该类疾病临床表现多样,仅靠临
6、床及常规免疫学检查难以确诊,随着分子生物学的迅猛发展,基因诊断已成为该类疾病明确诊断、遗传咨询、评价预后和干预治疗不可缺少的手段。 自1970年起WHO和国际免疫协会(Immunological Societies, lUIS)联合组织专家每2?3年即召开会议以修改更新PID命名和分类。2009年该会议对新发现的PID及PID新分类进行了充分讨论。目前PID共分八大类,即T细胞和B细胞联合免疫缺陷病、以抗体为主的免疫缺陷病、其他已明确临床(基因表型)的免疫缺陷综合征、免疫调节失衡性疾病、先天性吞暖细胞数量和(或)功能缺陷病、天然免疫缺陷病、自身炎症反应性疾病和补体缺陷病。本文对我院近7年来诊治
7、的PID患儿的临床资料进行回顾性分析,发现以抗体为主的免疫缺陷病5例,占50%,包括X-连锁无丙种球蛋白血症3例、普通变异型免疫缺陷病(Common variable immunodeficiency disease,CVID) 2例;T细胞和B细胞联合免疫缺陷病2例,占20%,包括X-连锁重症联合免疫缺陷病(X-linked severe combined immunodeficiency disease, XL-SCID)、Omenn综合征各1例;其他已明确临床(基因表型)的免疫缺陷综合征2例,占20%,包括高IgE综合征(Hyper-IgE syndrome,HIES)、慢性皮肤黏膜念珠
8、菌病(Chronicmucocutaneous candidiasis, CMC)各1例,先天性吞嘴细胞数量和(或)功能缺陷1例,占 10%,为慢性肉芽肿病(Chronic granulomatous disease,CGD) 1 例。现本文对这10例PID患儿的临床表型及基因诊断进行总结分析,以加强儿科医师对该类疾病的认识,从而尽可能早期诊断和治疗PID患者,减少其致残、致死率,同时亦为优生优育提供帮助。 X-连锁无丙种球蛋白血症(X-linked agammaglobulinemia,XL A)是由于人类B细胞系列发育障碍引起的原发性免疫缺陷病,1952年由Bmton首先报道,故又称811
9、11;011病6。其病因是Bmton酪氨酸激酶(Bmton tyrosine kinase,BTK)缺陷,导致外周血成熟B细胞明显减少,产生低丙种球蛋白血症,使机体的免疫力低下,易反复发生细菌感染7。诊断的确立有赖BTK基因突变的检测,国际上已经通过BTK基因分析和单核细胞内BTK表达检测进行诊断。本研究在临床上通过检测B细胞数目、免疫球蛋白定量及基因分析确诊3例XLA。现对其临床表型和基因诊断分析总结如下,以提高对该病的认识。1资料与方法1.1一般资料本组3例,为2005.08?2009.12就诊于本院儿科的患儿,均为男性,3例均来自贵州,均为汉族。发病年龄分别为3个月、1岁、5个月,诊断年
10、龄分别为4岁、12岁6个月、2岁2个月,从发病到确诊分别为3年9个月、11年6个月、1年9个月。1.2XLA临床拟诊依据我国XLA临床拟诊:主要根据全国免疫缺陷病登记方法。简要依据:(1)男性;(2)反复较严重细菌感染(呼吸道、胃肠道、皮肤以及其他深部感染),抗生素治疗效果不佳;(3)伴或不伴有自身免疫性疾病;(4)伴或不伴有母系家族中有类似疾病表现的男性患者。1.3常规免疫功能评价血清免疫球蛋白测定采用免疫池度法,使用免疫球蛋白IgG、IgM、IgA检测试剂盒(宁波,美康生物科技有限公司),T、B淋巴细胞分化簇(CD)测定使用突光标记的抗CD19、抗CD3、抗CD4和抗CD8单克隆抗体(美国
11、,BD公司),通过流式细胞仪分类检测,结果采用BDFACSDiva软件分析。1.4 RT-PCR及序列测定BTK基因突变情况1.4.1 BTK基因扩增采集患儿及母亲外周静脉血各约5 mL,采用Total RNAPurification Kit(Genemega Inc)提取总RNA,操作捧照试剂盒说明书进行。以lxgRNA为模板,应用随机引物进行逆转录合成cDNA,参照文献2设计4对引物,采用RT-PCR方法扩增 BTK cDNA。PCR 反应条件为:94C 预变性 5 min; 94C 1 min,60C 1 min,72C Imin,扩增35个循环;最后72C延伸10 min。1.4.2琼
12、脂糖凝胶电泳鉴定铺板制备1.5%琼脂糖凝胶,511?01产物加样,120 V压电泳30 min后,凝胶成像系统观察并记录目的条带。1.4.3 BTK基因序列测定BTK基因组DNA的PCR产物采用QIAGEN琼脂糖胶回收试剂盒回收后,委托重庆医科大学感染性疾病分子生物学实验室完成双向序列测定。2结果2.1临床表现本组3例,临床表现以反复感染为主。均有反复发作的上呼吸道感染、肺炎及腹湾表现,例1反复多次患中耳炎、鼻窦炎;例2有反复全身脓疱瘆史,并因左髋关节脱位和化脓性关节炎于9岁时行左髋关节复位和切开引流术,因脓胸、支气管狭窄于11岁时行右肺叶切除术;例3长期患中耳炎,因肺炎并胸腔积液、细菌性脑膜
13、炎于3.5岁时死亡。2.2体格检查3例诊断时均表现为营养不良和生长发育落后。其他突出的体征是扁桃体和浅表淋巴结很小或不可查及,伴有相应的感染体征。2.3家族史3例家族史均不十分明确。病例2有一弟弟,1年患12次以上呼吸道感染,不能自行走路,2岁时夭折(死因不详)。病例3有一舅舅1岁时出现反复感染,2岁时夭折(死因不详),均未经检查和确诊。2.4实验室检查结果本组3例血清IgG、IgM、IgA均明显低下,但程度有所差异。免疫球蛋白低下的程度与发病早晚和临床表现的严重程度无关。循环B细胞水平均明显低下,B细胞量与血清免疫球蛋白的水平无明显关系,见表1。本组2例CD4/CD8比值明显倒置。诊断时Ig
14、水平/gL -循环B细胞IS号T77V(CD19) /%IgG IgM IgA2.5 BTK基因分析结果3例经基因诊断明确存在BTK突变。例1为外显子9的949位G缺失,例2为外显子17的错义突变,例3为外显子15的错义突变,对例2、例3患儿母亲进行BTK基因分析,发现例2母亲为携带者,存在相同的基因突变,例3母亲基因型正常,2.6治疗及预后3例患儿均行静脉注射免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin, IVIG)替代疗法,400mg/kg.次,每1?2月1次,降低了感染机会,其生活质量得到明显改善,治疗有效。例3因未继续定时进行IVIG替代治疗,3.5岁时因肺炎并胸腔
15、积液、细菌性脑膜炎死亡。3讨论XLA致病基因已经成功克隆,所编码的蛋白属于酪氨酸激酶家族,称为BTK,发生于BTK任何亚区的突变均可导致其功能障碍,使原始B淋巴细胞向前B淋巴细胞的分化过程受阻,使成熟B淋巴细胞的寿命缩短,外周血缺乏B淋巴细胞和楽细胞导致各类免疫球蛋白合成不足,对很多抗原不能产生特异抗体反应,机体发生免疫缺陷。该病为X-连锁隐性遗传病,发病率约0.5?1/10万9。遗传学分析结果证实,致病基因BTK定位于X染色体q21.3-22。BTK基因全长37.5kb,含有19个外显子,除第1显子外,其余18个编码BTK蛋白的659个氨基酸。BTK属于非受体型蛋白酪氨酸激酶Tec家族成员,
16、包括5个不同的结构区段,从N末端起为PH、TH、SH3、SH2及TK段|(。本组患儿使用RT-PCR及序列测定BTK基因突变情况明确诊断。该病典型病例发病年龄多于出生后4?12个月,本组发病年龄分别为3个月、1岁、5个月,与此相符。Conley等”曾报道过有学龄前期才发病的XLA患儿,也有成年发病的病例。国外报道该病诊断年龄约3?4岁12,13,国内报道诊断年龄较大,为4?9岁I4,也见21岁、28岁确诊病例。本组诊断年龄分别为4岁、2岁6个月、2岁2个月,平均6岁3个月。Conley等11报道美国53个研究机构诊断XLA的平均年龄为35月龄,其中20%小于12个月。意大利多中心研究显示XLA诊断时平均年龄3.5岁13。国外报道也见51岁才确诊的病例
