蚕豆病ppt素材课件

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1、2010级本科分子生物学实验设计,案例： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 体格检查：体温38，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.981012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5mol/L，结合胆红素13.7mol/L，未结合胆红素71.8mol/L，尿蛋白（+），潜血(+)，尿胆红素

2、()，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。,阅读下列案例，根据要求回答问题并设计实验进一步明确诊断。,一、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病,蚕豆病,恶心、呕吐、面色苍白,皮肤及巩膜黄染,红细胞 1.981012/L,血红蛋白53g/L,血清总胆红素85.5mol/L,尿蛋白（+）,尿胆红素(),尿胆素原(+),尿液镜下未见红细胞,黄疸,红细胞膜不完整，已破裂,红细胞含量少,含量明显增加,血红蛋白量减少,排尿呈酱油样色,游离胆红素增加,溶血性黄疸,蚕豆病,肠肝循环增多,蚕豆病简介,蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6

3、-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。,易发人群,多见于儿童，男性患者约占90%以上。,临床表现,早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约50%患者脾大。严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于12日内死亡。,二、设计实验进一步明确诊断,红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定（紫外法）,（一）实验器材和试剂,1.实验器材 恒温水循环紫外分光光度计，可见分光光度计，离心机。

4、 2.试剂 （1）0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓冲溶液（pH8.0）：称取Tris12.1g,MgCl26H2O 4.06g,加入160mL蒸馏水溶解，用HCl调pH至8.0，然后加入蒸馏水至200mL。 （2）2 mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)：称取NADP 21.3mg，溶于10mL蒸馏水中。4 可保存20天左右。 （3）6mmol/L葡萄糖6磷酸二钠(G6PNa2)：称取21.5mg G6PNa22H2O，溶于10mL蒸馏水中。4 可保存20天左右。,（4）溶血剂：取巯基乙醇0.1mL，10% EDTA 2.0mL，6mmol/L NADP 0.4mL

5、，加蒸馏水至总体积200mL。 （5）血红蛋白氧化剂（Drabkin试剂）：称取K3Fe(CN)6 0.2g，KCN 0.052g，NaHCO3 1.0g，加蒸馏水至1000mL，置棕色瓶内避光保存，可保存20天。 （6）0.9% NaCl，ACD抗凝剂。,（二）实验操作流程,1、洗涤红细胞 取静脉血2.0mL，放入含0.4mLACD抗凝剂的试管中，混匀。吸取0.2mL抗凝血放入试管中，加入4mL预冷的生理盐水，轻轻摇匀，2500r/min离心5min,倾去上清，重复三次。 2、溶血液的制备 向红细胞沉淀中加入溶血剂2.0mL，震荡1min，4放置10min以上。,3、NADPH的测定 取石英

6、比色杯两只，标为“测定”及“空白”，按下表操作：,试剂,体积,蒸馏水（uL） 0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓冲溶液（uL） 6mmol/L G6P-Na2 (uL) 2mmol/L NADP+ (uL),2040 300 300 300,混匀后放入带恒温水循环（25）的紫外分光 光度计中，预热10min 然后在“测定”中加入溶血液60uL,“空白”中加入溶血剂60uL，混匀,以“空白”调“0”,1min后开始测340nm吸光度（A340），每2min纪录吸光度一次，至10min止，比较每2minA值的变化情况，若相近则表明酶促反应平稳。以10minA值的变化（A340）计算N

7、ADPH的产量。,4.溶血液中血红蛋白含量的测定 取试管一支，按下表操作：,试剂,体积,Drabkin(mL) 溶血液(mL),0.3 3.0,混匀，室温放置15min，以Drabkin试剂调零，读取540nm的吸光度（A540）。,（三）注意事项,1.洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避免溶血。 2.测定NADPH时读取吸光度的时间要准确。,（四）结果分析,1.NADPH产量的计算 NADPH在340nm处，其每微摩尔的吸光系数（）为6.220，故10min内NADPH的产量计算公式为： NADPH产量（mol）= 2.血红蛋白含量的计算 血红蛋白氧化为高铁血红蛋白以后，在540nm处，其毫摩尔吸光

8、细数（）为44，故溶血液中血红蛋白的含量计算公式为： 血红蛋白含量（mmol）=,3.G6PD比活性（U/g Hb）的计算 G6PD比活性单位（U/g Hb） = =,【参考范围】正常值：大于2.8U/gHb,三、从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果,红细胞膜的破坏 胆色素代谢异常,红细胞膜的破坏,葡萄糖磷酸戊糖途径,葡萄糖 6 磷酸葡萄糖,5 磷酸核糖,NADPH + H+,磷酸化,5 磷酸核糖,磷酸戊糖途径,NADPH + H+,5 磷酸核糖,NADPH + H+,5 磷酸核糖,NADPH + H+,5 磷酸核糖,NADPH + H+,NADPH维持GSH(谷胱甘肽）的正常含量和还

9、原状态,G6PD (6 磷酸葡萄糖脱氢酶）起关键作用,还原型谷胱甘肽 体内重要的抗氧化剂 保护红细胞膜蛋白的完整性,红细胞膜的破坏,单核吞噬细胞识别吞噬,血红蛋白,珠蛋白,氧化破坏,红细胞,氧化破坏,红细胞,单核吞噬细胞识别吞噬,氧化破坏,红细胞,血红蛋白,单核吞噬细胞识别吞噬,氧化破坏,红细胞,珠蛋白,血红蛋白,单核吞噬细胞识别吞噬,氧化破坏,红细胞,血红素,珠蛋白,血红蛋白,单核吞噬细胞识别吞噬,氧化破坏,红细胞,单核吞噬细胞识别吞噬,血红蛋白,珠蛋白,氧化破坏,红细胞,氧化破坏,红细胞,单核吞噬细胞识别吞噬,红细胞,血红蛋白,单核吞噬细胞识别吞噬,红细胞,珠蛋白,血红蛋白,单核吞噬细胞识

10、别吞噬,红细胞,血红素,珠蛋白,血红蛋白,单核吞噬细胞识别吞噬,红细胞,胆色素代谢异常,血红素,运送到肝,与血清蛋白结合,游离胆红素,结合胆红素,排出体外,进入肠道,胆素原,胆素,肠肝循环,胆红素,扩散进入组织 组织黄染 黄疸,排尿呈酱油样色,溶血性贫血 面色苍白,说明,1720为一个版本 2231为另一个版本 参考一下看哪个你比较容易理解然后就用哪个,实验室检查,G6PD,磷酸戊糖途径,NADPH,磷酸戊糖,维持谷胱甘肽的还原性,核酸生物合成原料,红细胞,90%95% 糖酵解通路 2.3二磷酸甘油酸旁路,5%10% 磷酸戊糖途径,NADPH,唯一,谷胱甘肽阻止氧化血红蛋白，从而保护红细胞膜的

11、完整性，如若缺乏，此时的红细胞易于破裂,Hb 具有携氧能力,MHb 高铁血红蛋白 Fe3+ 不具有携氧能力,NADPH高铁血红蛋白还原酶,GSH,MHb,Hb,胆红素,铁卟啉类化合物的降解产物 80%以上来自衰老红细胞破坏所释放的血红蛋白的分解 自由通过生物膜产生毒性作用,血红蛋白,珠蛋白,AA再利用,血红素,胆红素,胆红素分类,G6PD缺乏,NADPH严重缺乏,谷胱甘肽难以保持还原状态,NADPH高铁血红蛋白还原酶活性低,红细胞膜完整性破坏,红细胞裂解,血红蛋白大量溢出,胆红素生成量增加,Hb大量氧化成MHb，Hb含量减少,黄疸,皮肤，巩膜及黏膜等组织黄染 恶心，呕吐 全身无力 面色苍白,溶

12、血性黄疸,由于红细胞的大量破坏，在单核吞噬细胞系统产生胆红素过多，超过了肝细胞的摄取，转化和排泄胆红素的能力，造成血液中未结合胆红素浓度显著增高所致。,高未结合胆红素血症,由于肝对胆红素的摄取，转化，排泄增多，过多的胆红素进入胆道系统，肠肝循环增多，使得 尿中的尿素原和尿胆素含量增多，粪胆素与粪胆原也增加。,溶血性黄疸,大量红细胞破裂,血中未结合胆红素增加,肠肝循环增多,大量血红蛋白溢出,尿蛋白（+）,潜血(+),尿胆红素(),尿胆素原(+),尿液镜下未见红细胞,恶心、呕吐、面色苍白,排尿呈酱油样色,粪胆素原,红细胞大量破裂,四、要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？（选

13、答）,基因结构分析法,我组讨论认为：要想探讨该病发生的分子基础 ，需要对目的基因进行基因结构分析，即DNA序列检测,DNA序列测定方法,直接法,间接法：对于未知片段，或片段过长，用几种方法（RFLP；PCR-RFLP；SSCP）来粗略的估计待分析基因的一级结构是否与对照基因相同,双脱氧末端终止法（Sanger法）,化学裂解法（Maxam-Gilbert法）,DNA的自动化测序,DNA序列测定方法,DNA链的方向是5 3,交替的磷酸基团和戊糖构成了DNA的骨架 (backbone)。,双脱氧末端终止法（Sanger法）,Sanger法是根据双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)在DNA合成过程中不能形成

14、3,5-磷酸二酯键而导致链延伸终止的原理，利用四种ddNTP代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行DNA合成，从而获得在不同部位终止反应的大小不同的DNA链，结合高分辨率变性聚丙烯凝胶电泳分离，就可以对DNA序列进行分析。,TAATCTGCAGGC,3,5,加入引物； 32P-dATP,dGTP,dTTP； DNA聚合酶,3,TAATCTGCAGGC,5,5,3,primer,ddGTP,ddATP,ddTTP,ddCTP,ATTAG,ATTAGACG,A,ATTA,ATTAGA,AT,ATT,ATTAGACGT,ATTAGAC,ATTAGACGTC,ATTAGACGTCC,ATTAGAC

15、GTCCG,ATTAG,ATTAGACG,A,ATTA,ATTAGA,ATT,ATTAGACGT,ATTAGACGTC,ATTAGACGTCC,AT,ATTAGAC,聚丙烯酰胺凝胶电泳,G,A,T,C,GCCTGCAGATTA,3,5,ATTAGACGTCCG,五、患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答）,患者体型瘦小与该病症有关,蚕豆病是因为体内缺乏G6PD， G6PD主要影响体内的磷酸戊糖途径 该途径主要生成两种重要的物质即5-磷酸核糖和NADPH,5-磷酸核糖影响：,1：核酸的合成 2：体内己糖和戊糖的代谢 3：37碳原子糖类物质的相互转化,NADPH影响：,1：体内以NADPH作为供氢体合成多种活性物质如胆固醇 脂肪酸 和一些非必需氨基酸 2： NADPH可作为羟化酶的辅酶，参与体内生物转化作用 3： NADPH参与吞噬细胞的杀菌作用 4：维持GSH的正常水平 GSH可以保护体内蛋白质或酶免遭氧化 使蛋白质或酶处于活性状态,磷酸戊糖途径中生成多余的核糖转变为6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛进入糖酵解途径，G6PD缺乏使得糖代谢受到影响。脂酸可以合成甘油三酯，其主要功能是储存和氧化能量，机体难以合成甘油三酯则消耗原