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1、,细胞的体外培养,仪器和设备,细胞培养的基本条件,培养基的组成成分,培养基的物理性质,(1)无菌条件：风淋室、超净台、干燥除菌设备、低温冰箱等。 (2)细胞生长条件：纯水蒸馏器、纯水仪、CO2孵箱、培养器皿等。,一.仪器和设备,风淋室,超净台,纯水仪,CO2 培养箱,培养瓶,培养器皿,培养板,血清 一般常用为小牛血清(包括胎牛血清),人血清和其它动物血清。,二.培养基的组成成分,氨基酸（必需氨基酸） 谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。,维生素 维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。,碳水化合物 细胞生长的主要 能量来源其中有的
2、是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。,平衡盐溶液 主要用于稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压 ，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。,抗生素 常用为青霉素和链霉素、两性霉素，以抑制革兰氏阴性菌和阳性菌的污染。,氢离子缓冲器,成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,FGF,EGF,三.培养基的物理性质,PH 大多数细胞在PH =7.4时生长最好，一般6.8 -7.6。,温度 温度除直接影响细胞生长外，也与培养液的PH值有关。 如：低温时，CO2 溶解多，影响PH值。,PH指示剂,粘度 粘度对细胞生长影响较少
3、，但在细胞培养或用胰蛋白酶处理时，为尽量减少细胞损伤 ，可通过提高培养液粘度来克服。加羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮 来增加粘度。 表面张力和泡沫 表面张力有利于培养物粘着于底物上面。在悬浮培养中，减少泡沫的产生，加防泡沫硅。 渗透压 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。,原代培养 传代培养 细胞的衰退,细胞培养的类型,一、细胞原代培养,从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。,严格的说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养 ，随不同的组织时间长短不一，一般
4、为1-4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂但不旺盛。,原代培养6天后的大鼠神经元,1.组织解离：,1）胰蛋白酶解离细胞法: 2）胶原酶解离细胞法 3）机械解离细胞法,2.细胞解离,无菌条件下采取动物组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液中，然后尽快在超净台内进行解离处理。,解除了细胞之间的“组织关系”从而可以反映出单个细胞的生物形态,作用,细胞培养的基本方法,原代细胞培养的方法,（1）外植块细胞培养 （2）单层细胞培养 （3）悬浮细胞培养,(1)外植块培养：外植块在一定限度内可保持其原有组织结构，有利于其适应体外培养环境。短期培养的外植块成为细胞培养的材料来源之一。,在动物培养中，一经贴壁
5、就迅速铺展并开始有丝分裂，逐渐形成致密的细胞单层。 优点： 更换新鲜培养液比较容易。一般1-3天换液一次，细胞长成单层后进行传代 可用于观察某些因子对细胞生长的影响 容易表达某些产物,(2)单层细胞培养：,（2-3天）,(3)悬浮细胞培养：（1）使细胞呈悬浮状态在培养液中连续生长（小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞）（2）通过机械搅拌使细胞保持悬浮状态，选择得到悬浮生长的细胞进行悬浮培养。,机械搅拌式生物反应器：它通常由罐体、管路、阀门、泵及马达组成，由马达带动桨叶混合培养液，通过搅拌器的作用使细胞和养分在培养液中均匀分布。,原代培养的细胞特点,也称初代培养, 是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次
6、培养。 细胞保持原有的性质（二倍体细胞系）：适合作药物测试，细胞分化研究。 原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，供体和细胞间有很大差异。,二、细胞的传代培养,培养的细胞由于细胞增殖,数量增加,细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，将培养的细胞分散，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养，也叫做继代培养。,细胞株：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持（10-50代） 特点：遗传物质不改变 细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖 （50代以上）。 特点:
7、遗传物质改变，具有癌细胞的特性，可以无限分裂,有关概念,一代周期内细胞生长有三个时期,所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。,潜伏期 指数生长期 停滞期,1、潜伏期,2、指数生长期,3、停滞期,1）悬浮细胞生长传代 2）半悬浮细胞生长传代 3）贴壁细胞生长传代,传代细胞培养的方法,1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2.半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴
8、壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。,细胞传代培养的方法,贴壁生长细胞传代方法：,采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液 1. 吸光培养瓶中的培养液; 2.加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）; 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液; 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液; 5. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内; 6. 将后者放入培养箱中培养。,贴壁细胞的生长规律,贴壁过程,注意事项,1传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯
9、火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。 2传代时间的掌握：每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 3、消化时间的掌握,合适,过头,刚加入,细胞培养的基本方法,细胞的冻存与复苏,背景知识,细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。细胞培养过程中耗费巨多，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。 适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种 的作用。,原理,细胞冻存及复苏的基
10、本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。 细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂; 复苏细胞应采用快速融化的方法。,（一）细胞冻存,操作步骤,（二）细胞复苏,1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37温水中，并不时摇动令其尽快融化; 2. 从37水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3. 离心,1000rpm,5min； 4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37培养箱静置培养； 5. 次日更换一次培养液，继续培养。,不能，除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外，绝大部分细胞株
11、（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml 新鲜培养基的培养瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。,问题1：细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？,从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 冻存和复苏最好用新配制的培养液； 在冻存时要均匀减少细胞内水分，减少冰晶形成。,注意事项,细胞污染的种类和判定,细胞培养中常见的污染： 1、细菌污染 2、真菌污染 3、支原体污染 4、外源
12、病毒污染,培养液颜色变黄，出现浑浊显微镜下观察有大量圆球状颗粒漂浮，细胞表面和周围有大量细菌细胞生长停止，并有中毒表现。,圆球状颗粒漂浮物,显微镜观察到的细菌污染,肉眼可见培养液中见白色或黄色漂浮物，倒置镜下可见丝状、管状、树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养皿中，有的形态呈卵形或链状排列，散在细胞周边和细胞之间生长，培养液多不浑浊,显微镜下观察到的真菌感染,黄色漂浮物,树枝状,链状,黄色漂浮物,培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化。,3T3-L1细胞，用hoechst33342染色,黑色的小点,1.细菌、真
13、菌污染的检测,污染物的检测,1）肉眼观察：细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。如培养液变浑浊，或略加振荡可观察到很多漂浮物。,漂浮物,2、镜下观察：,a.在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。,b.若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。,酵母菌,Hela细胞,2、支原体污染的检测,a.荧光技术检测 利用荧光染料检测支原体污染。被支原体污染的细胞经染色后在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA，证明有支原体污染。,被污染,未被污染,b.电镜检测,可用
14、扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养4872小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。,支原体污染电镜照片 （煎蛋状）,扫描电镜下的支原体（附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体）,c.培养检测,将细胞悬液5ml加入45ml支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37培养3天观察有无荷包蛋菌落出现。,3、病毒的检测,a.扫描电镜和透射电镜观察病毒颗粒形态,b.致细胞病变效应（CPE）或集落的检测,常见的形态学变化为细胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。,正常细胞,病
15、变细胞,细胞污染的种类可分成细菌、真菌、霉菌、病毒等。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等。严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染最好方法。,问题2：应如何避免细胞污染？,药物研究与开发,细胞培养的应用,1、药物研究与开发,新药筛选 :如化学合成药物药效研究； 疫苗研究与开发 :如病毒性疫苗的研究与开发 基因工程药物的研究与开发:如干扰素的研究与开发； 细胞工程药物的研究与开发 :生物活性多肽研究与开发； 单克隆抗体的制备 :包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体。,2、生物制药,(1) 疫苗生产:病毒性疫苗,肿瘤疫苗等； (2) 基因工程药物生产:一些细胞生长因子等； (3) 诊断和药用单克隆抗体生产 (4) 细胞工程药物生产:生物细胞内的一些生物活性多肽物质等。,
