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1、第一章： 普通光学显微镜发展历史与主要技术参数,普通光学显微镜： 人的眼睛不能直接观察到比0.1mm更小的物体或物质的结构细节。在显微镜发明出来之前，人类关于周围世界的观念局限在用肉眼，或者靠手持透镜帮助肉眼所看到的东西。人要想看得到更小的物质结构，就必须利用工具，这种工具就是显微镜。 很早以前，人们就知道某些光学装置能够“放大”物体。比如在墨经里面就记载了能放大物体的凹面镜。公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。至于凸透镜是什么时候发明的，可能已经无法考证。 凸透镜有的时候人们把它称为“放大镜”能够
2、聚焦太阳光，也能让你看到放大后的物体，这是因为凸透镜能够把光线偏折，形成放大的虚像。单个凸透镜能够把物体放大几十倍，这远远不足以让我们看清某些物体的细节。 早在1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。,一、显微镜的发展简史,大约在16世纪末，荷兰的眼镜商詹森（Zaccharias Janssen）和他的儿子把几块镜片放进了一个圆筒中，结果发现通过圆筒看到附近的物体出奇的大，这就是现在的显微镜和望远镜的前身
3、。 詹森制造的是第一台复合式显微镜。使用两个凸透镜，一个凸透镜把另外一个所成的像进一步放大，这就是复合式显微镜的基本原理。,复式显微镜的出现,1665年，英国科学家罗伯特胡克用他的显微镜观察软木塞切片的时候，惊奇的发现其中存在着一个一个“单元”结构，胡克把它们称作“细胞”。 胡克的显微镜能够放大约140倍，其中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台等，使得操作更加方便。这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。 意大利科学家伽利略最早把复式显微镜用于科学研究工作。 1610 年前后，他用复式显微镜研究昆虫，观察到了昆虫的复眼。 在这一时期，伽利略和德国的开普勒在研究望远
4、镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，提出了“显微镜”这一术语。,十七世纪的显微科学,荷兰人安东尼冯列文虎克（Anthony Von Leeuwenhoek ，1632-1723)制造的显微镜让人们大开眼界。 他制造的显微镜其实就是一片凸透镜，而不是复合式显微镜。不过，由于他的技艺精湛，磨制的单片显微镜的放大倍数将近270倍，超过了以往任何一种显微镜。,当列文虎克把他的显微镜对准一滴雨水的时候，他惊奇的发现了其中令人惊叹的小小世界：无数的微生物游曳于其中。他把这个发现报告给了英国皇家学会，引起了一阵轰动,十八世纪的显微科学,十八世纪时的显微镜都存在很大的像差和色差，成像
5、很模糊。这时显微镜主要是在外观上的发展,在外观上，几乎所有的显微镜的基座都连在一个木盒子上。盒子的作用很多:有的用来放一些常用物品;有的用来放显微镜上的一些零件;更有甚者，被作为显微镜的镜箱。当显微镜不用时，把显微镜折叠后放进盒子里，就可以长期保存。 十八世纪中使用最广泛的显微镜:卡夫(Cuff)显微镜。,十九世纪的显微科学,十九世纪，随着工业革命的进行，显微科学也同其它学科一起飞速发展起来。其主要的原因是机械的使用使透镜的质量大大提高，光学的发展使显微镜的结构更加符合光学原理。,在这个世纪里，人们制造出了没有色差和像差的高质量显微镜以及分辨率极高的暗视野显微镜，从而带来了生物学和显微科学的革
6、命。 1850 年出现了偏光显微术。 1876 年 Abbe( 阿比 ) ：剖析影像在显微镜中成像时所产生的绕射作用，试图设计出最理想的显微镜， 奠定了显微镜成像的古典理论基础。 1886 年 Zeiss( 蔡斯 ) ：打破一般可见光理论上的极限，他的发明 - 阿比式及其它一系列的镜头为显微学者另辟一新的解像天地。 1893 年出现了干涉显微术；,代表性的显微镜有： Ladd的学生显微镜:这个显微镜由英国人WilliamLadd在1864年制造。它采用了当时最先进的齿轮调焦装置（这一装置在今天仍然被大多数光学显微镜所使用）。这个显微镜的镜臂上多出了一个在前几个世纪的显微镜上都看不到的东西-聚光
7、镜。聚光镜的出现对显微科学的发展起到了重要的作用。因为聚光镜是后来的一些新型显微镜的重要结构之一。,1684年前后，荷兰学者惠更斯设计并制造出结构简单而且效果较好的双透镜目镜惠更斯目镜，至今仍然广泛地应用在各种普通显微镜上。 19世纪中叶，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。 1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为19世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。,在接下来的两个世纪中，复合式显微镜得到了充分的完善。
8、,20世纪初期的显微镜,19世纪中期的显微镜,19世纪末至20世纪初，欧洲的一些科学家致力于提高显微镜的分辨率及观察效果，设计并制造出了反射镜、消色差物镜、大数值孔径物镜、油浸物镜、暗视野聚光镜、偏光附件及补偿目镜等光学部件，使得显微镜的性能不断提高，应用范围越来越广泛。 随后，人们又利用光波动某些特性和现象，对成像光路作了改进。1902年艾夫斯奠定了现代双目镜的基本系统。,现代普通显微镜,如果仅仅凭借光的直线传播和折射等原理，我们可以想象出任意放大倍数的显微镜。但是光的波动性质使得光学透镜的诸多弊端原形毕露，而且即使消除掉透镜形状的缺陷，任何光学仪器仍然无法完美的成像。原因很简单：普通光学显
9、微镜已经达到了分辨率的极限。 光在通过显微镜的时候要发生衍射简单的说，物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。如果两个衍射光斑靠得太近，我们就没法把它们分辨开来。显微镜的放大倍数再高也无济于事了。,1.分辨率：指显微镜在25厘米的明视距离处，能分辨出标本上相互接近的两点间的最小距离的能力。 对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是0.2微米。任何小于0.2微米的结构都没法识别出来。 2.反差：指物体与背景之间的对比度。增大反差可使物体清晰可见 解决方法：a.对于无色样品，可以通过染色增强反差 b.利用特别设计的显微镜加强反差，如使用暗视野显微镜、相差显微镜、偏振光显微
10、镜等复杂显微镜。,放大物体的可见性的决定因素,在显微镜本身结构发展的同时，人们对于光学知识的不断积累，使得人们对显微镜的光学成像原理有了新的认识，并开始从新的角度来改进显微技术。 人们在显微观察技术上典型的创新有： 1850年出现了偏光显微术； 1893年出现了干涉显微术； 1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖。,复杂光学显微镜：,相衬显微镜,古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。 随着摄影技术和感光胶片、硅晶片等记录存储技术的产生和发展，人们开始把这些技术应用到显微镜装置中，以感光胶片作为可以记录
11、和存储的接收器，代替人眼的直接观察。 现代又普遍采用光电元件、电视摄像管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图像信息采集和处理系统，使得显微技术得到飞速发展和更加广泛的利用。,带自动照相机的光学显微镜,配有电脑设备的显微镜,光学显微镜的使用，使得人们用肉眼仅能够分辨0.1mm的物体的极限被突破，达到了0.2um。但是，这个厚度对于微观世界来说依然是很大的，不能满足人们对于微观世界的进一步探索的渴望。,依据显微镜的成像原理，提高显微镜分辨率的途径之一就是设法减小光的波长，或者用具有更短波长的电子束来代替光。根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度越快，
12、它的“波长”就越短。如果能把电子的速度加到足够高，并且汇聚它，就有可能用来放大物体。 1938年，德国工程师Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜（TEM）。1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜（SEM）。 电子显微镜是20世纪最重要的发明之一。由于电子的速度可以加到很高，电子显微镜的分辨率可以达到纳米级（10-9m）。很多在可见光下看不见的物体例如病毒在电子显微镜下现出了原形。,电子显微镜：,透射式电子显微镜,扫描电子显微镜,用电子代替光，这或许是一个反常规的主意。但是还有更令人吃惊的。1983年，IBM公司苏黎
13、世实验室的两位科学家Gerd Binnig和Heinrich Rohrer发明了所谓的扫描隧道显微镜（STM）。这种显微镜比电子显微镜更激进，它完全失去了传统显微镜的概念。 很显然，你不能直接“看到”原子。因为原子与宏观物质不同，它不是光滑的、滴溜乱转的削球，更不是达芬奇绘画时候所用的模型。扫描隧道显微镜依靠所谓的“隧道效应”工作。如果舍弃复杂的公式和术语，这个工作原理其实很容易理解。隧道扫描显微镜没有镜头，它使用一根探针。探针和物体之间加上电压。如果探针距离物体表面很近大约在纳米级的距离上隧道效应就会起作用。电子会穿过物体与探针之间的空隙，形成一股微弱的电流。如果探针与物体的距离发生变化，这
14、股电流也会相应的改变。这样，通过测量电流我们就能知道物体表面的形状，分辨率可以达到单个原子的级别。 因为这项奇妙的发明，Binnig和Rohrer获得了1986年的诺贝尔物理学奖。这一年还有一个人分享了诺贝尔物理学奖，那就是电子显微镜的发明者Ruska。,扫描隧道显微镜,STM,工作原理模型,第一代显微镜：光学显微镜，极限分辨率是200纳米。由于光的衍射效应，分辨率受制于半波长，可见光的最短波长为0.4微米。 第二代显微镜：电子显微镜。1924年，德布罗意提出了微观粒子具有波粒二象性的假设，后来这种假设得到了实验证实。此后物理学家们利用电子在磁场中的运动与光线在介质中的传播相似的性质，研制成功
15、了电子透镜，在此基础上于1933年发明了电子显微镜。TEM的点分辨率为0.20.5nm，晶格分辨率为0.10.2nm，扫描电镜的分辨率为610nm。它们的工作环境都要求高真空，并且使用成本很高，在一定程度上限制了电子显微镜的发展。 第三代显微镜：扫描探针显微镜。80年代初期，IBM公司苏黎世实验室的G.Binning 和H.Rohrer发明了扫描隧道显微镜，它的分辨率达到0.01纳米。STM的诞生，使人类第一次在实间观测到了原子，并能够在超高真空超低温的状态下操纵原子。 因为这两项重大的意义，这两位科学家荣获了1986年的诺贝尔物理奖。,三代显微镜之比较:,在STM的基础上，又发明了原子力显微
16、镜、磁力显微镜、近场光学显微镜等等，这些显微镜都统称扫描探针显微镜。 因为它们都是靠一根原子线度的极细针尖在被研究物质的表面上方扫描，检测采集针尖和样品间的不同物理量，以此得到样品表面的形貌图像和一些有关的电化学特性。,显微镜的进一步发展方向：,光学显微镜有多种分类方法，根据结构的复杂程度可以分为单式和复式显微镜两种： 单式显微镜结构简单，通常仅由一块或几块透镜组成，一般只进行一次放大，放大倍率和机械性能都不高。早期的显微镜是单式显微镜。 复式显微镜的构造比较复杂，各类透镜由透镜组合有机结合而成，机械性能和自动化程度都较高。其结构不仅有物镜和目镜之分，还配有专用的照相目镜及相应的设备。现代显微镜多半是复杂显微镜。,二、光学显微镜的分类,根据结构和功能的不同可以分为三种：普及型、专用型和高级型 1.普及型，这类显微镜结果相对简单，造价适中，普及性较好，通常用于教学、常规镜检和一般性研究工作。 2.专用型，这类显微镜是根据不同的光学原理设计而成的，专门用来在特定的环境下进行特殊的观察和研究，例如暗视场、相位差、微分干涉、荧
