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1、一、概述 在转录过程中, DNA双链中的一条链为模板,称为模板链或反义链,而另一条链称为编码链或有义链。 转录起始点前面的序列称为上游(upstream),后面的序列称为下游(downstream)。起始点为+1,上游的第一个核苷酸为-1,其他的依次类推。,第一节 转录的启动与终止,转录起始主要由DNA分子上的启动子（promoter)控制;终止由终止子控制. DNA链上提供转录终止信号的序列称为终止子（terminator）。是一个基因的末端或是一个操纵子的末端的一段特定序列。 由启动子到终止子的序列称为转录单位(transcription unit)。,大肠杆菌RNA聚合酶由多亚基组成。2
2、称为全酶（holoenzyme），分子量约为480kDa。亚基与全酶结合松弛，应用磷酸纤维素柱很容易使之与全酶分离。解离后的部分（2）称为核心酶（core enzyme）。 启动子（promoter）是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合以起始转录的区域。 启动子是控制转录起始的序列，并在很大程度上决定着某一基因的表达强度。,二、原核生物启动子的结构 分析了100多种大肠杆菌启动子的序列，发现主要有2个保守区域：10区、35区。 （1）-10区 在转录起始点的上游紧接着一个6bp的保守序列,在几乎目前已知所有的启动子中均存在。其中心位于转录起始点上游约-10bp处（在不同启动子中有所差别），
3、因此这一保守序列又称 为-10序列。其一致序列为T80A95T45A60A50T96，又称为Pribnow框. 其中带下划线的T称为“保守T”。,Pribnow盒是RNA聚合酶的牢固结合位点,又称结合位点,或称为解链区。 该区域富含AT对,熔点较低, RNA聚合酶的结合使得这个AT丰富区消耗较低的能量而解旋，此时RNA聚合酶与启动子的复合物便由封闭复合物(closed-promoter complex) 转变为开放复合物(open-promoter complex) ，转录启动。 （2）35区 在转录起始点上游35bp处，有另一个保守序列，称为35序列。其一致序列为T82T84G78A65C5
4、4A45。该保守序列又称Sextama框。RNA聚合酶的因子可以识别该位点，所以称作识别位点。RNA聚合酶先识别的这一区域并与之结合，然后再与结合位点相互作用。,决定原核启动子强弱的因素,(1) Sextama Box (-35区） (2) Pribnow Box（-10区） (3) Distance between the two boxes（两个区之间的距离）,三、转录的终止 在大肠杆菌中，有两种类型的终止子，第一类终止子称为不依赖因子的终止子(或称内在终止子intrinsic terminator），在体外实验中足以使转录终止，属强终止子。另一类终止子必须在因子（ factor）的存在下
5、才能终止转录，因此称为依赖因子的终止子（-dependent terminator），属弱终止子 。 两类终止子的共同序列特征 在转录终止点之前有一段反向重复序列. 5-ATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTT-3 3-TAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAA-5 E. coli色氨酸操纵子的转录终止子（不依赖于因子的终止子）及其中的反向重复（黄色）,两类终止子的共同序列特征 在转录终止点之前有一段反向重复序列. 5-ATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTT-3 3-TAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAA-5 E
6、. coli色氨酸操纵子的转录终止子（不依赖于因子的终止子）及其中的反向重复（黄色）,转录进行到终止子序列时，就进入了终止阶段，包括新生RNA链的释放及RNA聚合酶与DNA解离。 终止子在转录终止点之前，RNA聚合酶是通过了终止子后面后再终止转录的。,推测：终止子反向重复序列处转录出来的RNA形成二级结构，即柄-噜噗结构（stem-loop），又称发夹结构，该结构与RNA聚合酶的某种特定的空间结构嵌合，造成转录作用的暂停典型的终止子暂停时间为60秒左右。 回文序列后面连续的A，转录出U，dA和U之间的氢链力很弱，RNA和DNA杂交易拆开，导致三元复合物解体，RNA聚合酶解离下来，转录终止。 不
7、依赖因子的终止子的转录产物在结构上有两个特征，一是形成一个发夹结构（hairpin），茎富含GC对；二是发夹结构末端紧跟着6个连续的U串。,1.不依赖于Rho因子的终止子,在体外实验中，发现尽管有该类终止子存在，但RNA聚合酶只在终止子处暂停，转录并不终止。向该反应系统中加入因子，则可使转录在特定的位点终止。这种终止称为依赖因子的转录终止。 依赖于Rho因子的终止子不但柄部GC含量较低，因而暂停时间较短，且在下游缺乏连续的A/U，因此，若无Rho因子的帮助，RNA聚合酶会继续转录下去，称为通读(readthrough)。,2.依赖于Rho因子的终止子,是一个大聚体蛋白质,有两个活性：i.依赖于
8、RNA的NTPase活性，在有单链RNA存在时可水解ATP ；ii.RNA-DNA解旋酶活性：与亚基作用，使RNA链从复合物中解离。 沿新生RNA链向转录复合物移动，能使RNA聚合酶在依赖性终止子处终止转录。在原核生物中，转录与翻译是同时进行的，因子的终止作用可被核糖体的存在而阻碍。,RNA Pol转录DNA 因子附着到RNA 识别位点上 因子跟在RNAPol 后沿RNA移动 RNA Pol在终止位 点停下，并被因 子追上 在转录泡中 因子使DNA-RNA杂 种双链解开， 转录终止,释放出 RNA Pol,因子 和RNA。,几种细菌因子的氨基酸序列比较结果表明，它们均由两部分组成：即核心酶结合
9、区和一35区一10区结合区。前者在不同类型的因子中具有较高的同源性，暗示它们作用于同一种核心酶；而后者则呈现出较大的差异性，对应于不同的保守序列。 一种因子取代RNA聚合酶中的另一种因子，即可关闭一组基因，同时打开另一组基因。,第二节 因子的更替对转录起始的调控,在细菌受到外界环境的急剧影响或芽孢菌生活方式改变时，会产生因子更替的现象。 1. 枯草杆菌因子的更替 在枯草杆菌，因子的更替控制着生活方式的改变。枯草杆菌共有约10种因子。其中有些出现于正常生活期，有些出现于噬菌体感染或是芽孢中, 还有一些则在细菌从营养生长向芽孢形成转变的过程中发挥作用 枯草杆菌在正常营养生长期间所使用的RNA聚合酶
10、具有与大肠杆菌相同的结构， 255, 其中的55所识别的启动子保守序列也与大肠杆菌因子所识别的-10与-35大致相同。而其他因子所识别的-10与-35的一致性序列各异。 枯草杆菌在芽孢形成过程中采取更换因子的策略,2. 枯草杆菌噬菌体SP01的感染周期 一组基因的表达导致另一组基因随后表达，称为基因表达的时序调控或级联调控，这是噬菌体感染周期中的普遍特征。 在枯草杆菌噬菌体SP01的感染周期中，其基因表达的时序调控是由一系列的因子来实现的。 SP01的感染周期经历早中晚三个阶段： i. 刚刚感染时，早期基因被转录。 ii. 4-5分钟后早期基因转录停止，中期基因开始转录。 iii. 8-12分
11、钟后中期基因的转录又被晚期基因所取代。,寄主的RNA聚合酶转录早期基因，早期基因包括28 ，其表达产物是gp28； 由gp 28与宿主核心酶构成的噬菌体RNA聚合酶特异性识别中期基因33和34的启动子，并促使它们合成gp33和gp34。 这两个蛋白因子置换上述RNA聚合酶中的gp28，特异性识别晚期基因启动子，最终导致晚期基因的表达。,中期基因以早期基因的表达产物为因子； 晚期基因又以中期基因的表达产物为因子。,structural genes constitutive mutants 没有乳糖，代谢酶照样合成（不需要诱导）。 merodiploid dominant/recessive ci
12、s and trans,Recognize another class of repressor mutants constitutive and dominant. This kind of mutant gene makes a defective product that can still form tetramers with wild-type repressor monomers. However, the defective monomers spoil the activity of the whole tetramer so it cannot bind to the op
13、erator. Hence the dominant nature of this mutation. This kind of “spoiler“ mutation is widespread in nature, and it is called by the generic name dominant-negative.,Thus, Jacob and Monod, by skillful genetic analysis, were able to develop the operon concept. They predicted the existence of two key c
14、ontrol elements: the repressor gene and the operator. Deletion mutations revealed a third element (the promoter) that was necessary for expression of all three lac genes. Furthermore, they could conclude that all three lac genes (lacZ, Y, and A) were clustered into a single control unit: the lac ope
15、ron. Subsequent biochemical studies have amply confirmed Jacob and Monods beautiful hypothesis.,Bacterial Transcription Initiation,Cooperative binding of E. coli RNA polymerase and cAMP-CAP to the lac promoter. By themselves, both RNA polymerase and cAMP-CAP have relatively low affinity for their re
16、spective binding sites in lac promoter DNA. However, interaction between residues in CAP and an a subunit of RNA polymerase forms a protein-protein complex that binds much more stably to promoter DNA than either protein alone,调节基因的产物作为阻遏物与操 纵基因结合，从而关闭操纵子，称为负 控制。 调节基因的产物（例如CAP蛋白）作为激活因子开启转录，增加酶或蛋白质的合成。称为正控制。
