代谢调节与发酵工程

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1、代谢调控若干问题探讨,华东理工大学 储 炬,微生物的生命活动是由产能与生物合成的各种代谢途径组成的网络，互相协调来维持的。每一条途径是由一些特异的酶催化的反应组成的。许多这些反应的结果造就了一个新生的细胞。微生物要在自然界生存与竞争，就必需生长迅速，能很快适应环境。,微生物的代谢网络是受到高度调节,1)微生物生长在含有单一有机化合物为能源的合成培养基中，所有大分子单体(前体)，如氨基酸的合成速率同大分子，如蛋白质的合成速率是协调一致的。 2)任何一种单体的的合成，如能从外源获得，只要它能进入细胞内，单体的合成自动中止。参与这些单体生成的酶的合成也会停止。,微生物的代谢网络是受到高度调节,3)微

2、生物只有在某些有机基质，如乳糖存在时，才会合成异化这些基质的酶； 4)如存在两种有机基质，微生物会先合成那些能异化更易利用的基质的酶，待易利用的基质耗竭才开始诱导分解较难利用基质的酶； 5)养分影响生长速率，从而相应改变细胞大分子的组成，如RNA的含量,微生物的代谢网络是受到高度调节,微生物具有很强的适应环境变化的能力。它可以通过调整其代谢机能来响应环境的变化。如给予细菌不同的养分，细胞的大分子组成会起相应的变化。 例如，改变培养基的成分，维持培养温度不变，可以改变鼠伤寒杆菌的生长速率，用倍增或世代时间来表示其生长速率，见表3-1。,微生物的代谢网络是受到高度调节,一种诱导酶表达控制作用的Ja

3、cob-Monod模型,代谢途径的各种调节方式,一种诱导酶表达控制作用的Jacob-Monod模型,分解代谢物阻遏的分子水平的机制,反馈阻遏在分子水平上的作用机制,反馈阻遏在分子水平上的作用机制,反馈抑制,这是一种常用于组成代谢的负向变构控制。,代谢工程,代谢工程（metabolic engineering），又称途径工程，是由美国学者Bailey J E (1991)首先提出8。他把代谢工程定义为，用重组DNA技术操纵细胞的酶运输和调节功能来改进细胞的活性。Stephanopoulos等认为，代谢工程是一种提高菌体生物量或代谢物产量的理性化方法。,研究内容,l).在微生物体内建立新的代谢途径

4、以获得新的代谢物(如链霉菌的聚乙酮)； 2) 生产异源蛋白(如人体胰岛素，人血清白蛋白)； 3) 改进己存在的途径(如抗生素，工业酶的生产)。,研究方法,1) 生理状态研究； 2) 代谢(物)流分析； 3) 代谢流控制分析； 4)代谢途径热力学分析； 5) 动力学模型。 目前代谢工程的研究工作主要集中在代谢分析上。,代谢流的研究任务,对已知途径而言，是了解生物过程环境变化时对代谢流及其分布的影响，确定流向终产物的比例； 对未知途径而言，是主要途径的鉴别，副产物途径的了解以便指导遗传操作，克服微生物自身的遗传机制，去除副途径。,代谢工程可在以下几个方面得到广泛的应用：,1) 改进由微生物合成的产

5、物的得率和产率； 2) 扩大可利用基质的范围； 3)合成对细胞而言是新的产物或全新产物；4)改进细胞的普通性能，如耐受缺氧或抑制性物质的能力； 5)减少抑制性副产物的形成； 6)环境工程方面；,代谢工程可在以下几个方面得到广泛的应用：,7)药物合成方面，作为中间体的手性化合物的制备； 8)在医疗方面 用于整体器官和组织的代谢分析；用于鉴别藉基因治疗或营养控制疾病的目标； 9)信息传导途径方面，即信息流的分析，为了治疗疾病而进行基因表达的分析和调节，需了解信息流的相互作用和控制。,代谢工程,代谢工程的要素是将分析方法运用于与物流的定量化，用分子生物技术来控制物流以实现所需的遗传改造。,微生物次级

6、代谢与调节,次级代谢产物是某些微生物在生命循环的某一个阶段产生的物质，它们一般是在产生菌生长中止后合成的。微生物产生的次级代谢物有抗生素、毒素、色素和生物碱等。,微生物次级代谢的特征,次级代谢产物一般不在产生菌的生长期产生，而在随后的生产期形成。 种类繁多，含有不寻常的化学键，如氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、麦角生物碱、吲哚衍生物、吩嗪、吡咯、喹啉、萜烯、四环类抗生素等。 一种菌可以产生结构相近的一簇抗生素。例如，产黄青霉能产生至少10个具有不同特性的青霉素。,微生物次级代谢的特征,一种微生物的不同菌株可以产生多种在分子结构上完全不同的次级代谢产物，例如，灰色链霉菌不仅可以用于生产链霉素，

7、还可用来生产白霉素、吲哚霉素、灰霉素、灰绿霉素等。 不同种类的微生物也能产生同一种次级代谢产物。 次级代谢产物的合成对环境因素特别敏感。其合成信息的表达受环境因素调节。如对抗生素的合成需在较低的磷酸盐浓度0.110mM范围内进行，而生长能耐受的范围平均要大10倍，即.3300mM。,微生物次级代谢的特征,微生物由生长期向生产期过渡时，菌体在形态学上会发生一些变化。例如，一些产芽胞的细菌在此时会形成芽胞，真菌和放线菌会形成孢子。因此，有人把次级代谢产物的合成作用看作是细胞分化的伴随现象。 微生物的次级代谢产物的合成过程是一类由多基因控制的代谢过程。这些基因不仅位于微生物的染色体中，且位于质粒中，

8、并且染色体外的基因在次级代谢产物的合成中往往起主导作用。,生长与次级代谢产物共用的代谢中间产物,由芳香中间体合成的抗生素和其它次级代谢物,可作为次级代谢物的前体的一些中间体,化合物类型 中间体 短链脂肪酸 乙酸，丙酸，丙二酸，甲基丙二酸，丁酸 异戊二烯单位 甲羟戊酸，异戊烯焦磷酸 氨基酸与芳香中间体 正常蛋白质氨基酸，不常见氨基酸 糖与氨基糖 己糖，戊糖，丁糖，经修饰的己糖、氨基糖 环己醇与氨基环己醇 肌醇，肌糖胺，链霉胍，2-脱氧链霉胍，放 线菌胺 脒基 精氨酸 嘌呤和嘧啶碱 腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，二甲基腺嘌呤， 芳香中间体与芳香氨基酸 莽草酸，分枝酸，预苯酸，对氨基 苯甲酸，酪氨酸，色氨

9、酸 甲基 S-腺苷酰甲硫氨酸,次级代谢调控策略探讨,发酵过程前期控制 发酵过程控制策略 前体添加策略,发酵前期的控制,菌形的控制；原材料质量；种子质量 阿维菌素，青霉素，四环素，金霉素 红霉素前50小时的控制(pmv, 质量),红霉素发酵趋势曲线图,混沌现象,9小时左右CER、OUR、pH和DO都有一个对应的上升或下降峰。这种峰值的高低以及峰值出现的时间，反应了发酵初期的系统特征。 出现混沌现象,黄豆饼粉以碳骨架通过氨基酸代谢进入菌体，有利于红霉内酯的形成。 分析进一步提出了黄豆饼粉利用的时间、利用方式和不同碳源间的竞争性利用特性。,金霉素发酵趋势曲线图,基因工程人血清白蛋白(r-HSA)趋势

10、曲线图,发酵过程控制策略,温度往往会影响生物合成的方向。例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能生产金霉素，在低于30下，合成金霉素的能力较强。合成四环素的比例随温度的升高而增大，在35下只产生四环素。,发酵过程控制策略,青霉素发酵采用变温05 h 30，540 h 25，40125 h 20，125165 h 25培养比25恒温培养提高青霉素产量近15。 说明通过最适温度的控制可以提高抗生素的产量，进一步挖掘生产潜力还需注意其它条件的配合。,发酵条件的影响及其控制,要想控制发酵，使其按人的意志转移，目前还不能完全办到。 因影响发酵的因素实在太多。 有些因素还是未知的，且其主要影响因素也会变化。,发

11、酵条件的影响及其控制,因此了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握菌的生理代谢和过程变化的规律，可以帮助人们有效地控制微生物的生长和生产。,发酵条件的影响及其控制,微生物发酵的生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件(包括培养基)。为此，了解生产菌种与环境条件，如培养基、罐温、pH、氧的供需等的相互作用，菌的生长生理，代谢规律和产物合成的代谢调控机制将会使发酵的控制从感性到理性认识的转化。,培养基对发酵的影响,许多用于生产贵重商品的培养基的配方一般都不发表，视为公司的机密。这说明发酵培养基对工业发酵生产的重要性。,培养基对发酵的影响,先进的培养基组成和细胞代谢物的分析技术加上统计优化策略和生化研究对于

12、建立能充分支持高产、稳产和经济的发酵过程是关键的因素。,发酵条件的影响及其控制,发酵条件的影响及其控制,培养基的成分对微生物发酵产物的形成有很大的影响。 每一种代谢产物有其最适的培养基配比和生产条件。,发酵条件的影响及其控制,通常，用于次级代谢物生产的复合培养基配方多半是经验性的，因对生产菌的性质及所需化合物的生物合成知道得不多。培养基配方的设计主要根据过去文献报道，并通过试验调整。 表5-6 若干复合原材料的成分,培养基的优化,工业发酵通常采用两种培养基，一种用于培养种子；另一种用于产物合成。 前者的功能主要在于支持细胞的生长。 种子培养基的优化的目标在于生长，也有着眼于产生最多的孢子。,培

13、养基的优化,典型的培养基优化方法是每次试验只改变1个成分(一维搜索)。这种方法很快被强有力的统计学方法所取代。 这些方法对新老菌种的培养基优化均很有效率。 下面介绍几种优化培养基的统计数学方法：,培养基的优化,(1)布列可特博曼(Plackett-Burman)设计法 (2)响应平面设计(Response surface design) (3)均匀设计方法,发酵过程优化,发酵过程优化的实质是代谢流优化的过程。,生长能量学对产物形成的影响,如将产气气杆菌作好气碳限制恒化培养，其呼吸强度qO2(这与能量产生的速率成正比)与生长速率之间呈线性关系，但此直线不通过原点。 其截矩说明，生长速率为零的情况

14、下细胞仍消耗氧。 这是维持生命的能量需求。,生长能量学对产物形成的影响,但对一活细胞维持其生存所需的能量最低是多少呢？ 有两个证据说明除了维持生存的需要，还存在另一种能量的溢出。,生长能量学对产物形成的影响,Neijssel等指出，在产气气杆菌的恒化培养中在碳源过量(氮、硫或磷限制的)情况下，其呼吸强度qO2与生长速率之间仍旧存在线性关系，见图5-19。,生长能量学对产物形成的影响,但在=0 (将直线外推到纵坐标) 下其它养分限制所得的呼吸强度比碳限制培养物都要高。,生长能量学对产物形成的影响,因很难解释生长在过量碳源的维持能量需求要比葡萄糖限制的培养物的要高，故得出这样的结论，即在这些细胞中

15、必然存在其它类型的能量消耗反应。,能量溢出(energy-spilling),另一个试验也得出同样的结论。如产气气杆菌在一好气葡萄糖限制的恒化器中以D=0.1h-1下生长，葡萄糖被耗竭，转化为CO2和新的细胞。 这种培养物有活力和稳定，维持细胞完整的能量消耗并无浪费。,能量溢出(energy-spilling),这时，如向培养液添加额外的糖，会导致氧耗与CO2的释放速率迅速增加，但生长速率并未立即增加。 由此得出结论，加进去的额外糖所产生的能量必然大部分被浪费掉。,能量溢出(energy-spilling),催化这些能量溢出(energy-spilling)反应的酶是组成型的。 从发酵生理的观

16、点分析，可以区分三种能量消耗的反应： 新细胞材料的净合成； 维持细胞完整与存活的能量需求； 能量溢出反应(不管其作用是什么)。,能量溢出(energy-spilling),有不少有用的化合物是通过能量反应产生的，如葡萄糖酸、乳酸、醋酸、乙醇、丙酮、丁醇、异丙醇等。 这些产物的大多数是由发酵过程形成的(从狭义看，没有呼吸链的参与)，其余涉及呼吸作用，此两种过程的共同点是其生产都是放能反应。,能量溢出(energy-spilling),能量用于维持与能量溢出反应对产物的形成起重要的积极作用。它们消耗能量，生产所需化合物，但不会过量生产无用的细胞，尽管会产生额外的热(这是能量溢出反应的不可避免的结果)。 那么，如何优化能量流的分配呢？,优化能量流的策略：,1)若干类型的生长环境，如钾的限制，导致这种不经济的能量流失。 2)有些微生物在分泌产物时会诱发能量溢出反应。,优化能量流的策略：,3)