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1、点评,1.菌落-不称为点点或颗粒物。 2. 结果描述条理应该清晰，而不是简单的堆砌。 3. 设计题完成情况不理想。 4.显微镜使用， 复位，清洁、签字（尼康）。,实验5 革兰氏染色法 荚膜染色,一、实验目的,目的： 1.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术; 2.学习革兰氏染色法以及荚膜染色法； 3.掌握染色原理。,二、原理,革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G )和革兰氏阴性菌(G )两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G菌细胞壁中肽聚糖层厚（20-80nm，15-50层）且交联度高，类脂质含量少
2、，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄(10nm,2-3层)、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。,金黄色葡萄球菌革兰氏染色图,大肠杆菌革兰氏染色图,革兰氏染色的实际意义,(1)鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大类,这样可将致病菌的范围缩小,然后再进一步鉴定. (2)选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别,因而对抗菌素等药物的敏感度不一.例如大多数阳性菌
3、对青霉素敏感，大多数阴性菌对青霉素不敏感(脑膜炎球菌等除外),可供临床实践中选用抗菌药物的参考. (3)与致病性的关系:大多数革兰氏阳性菌的致病物质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物质主要为内毒素。,荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，含水量大，其他成分多为多糖、多肽或糖蛋白。 细菌荚膜染色的原理是因为荚膜和染料间的亲和力弱，不易着色，且易被水洗去，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90以上，固染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。,荚膜功能： 抗吞噬作用：荚膜因其亲水性及其空间占位、屏障作用，可
4、有效抵抗宿主吞噬细胞的吞噬作用。 粘附作用：荚膜多糖可使细菌彼此间粘链，也可粘附于组织细胞或无生命物体表面，是引起感染的重要因素。 抗有害物质的损伤作用：处于细菌细胞最外层，荚膜犹如盔甲可有效保护菌体免受或少受多种杀菌、抑菌物质的损伤，如溶菌酶、补体等。 抗干燥作用：荚膜多糖为高度水合分子，含水量在95%以上，可帮助细菌抵抗干燥对生存的威胁。 荚膜用途: 用于菌种鉴定、用作药物和生化试剂、用作工业原料等。有荚膜的菌形成的菌胶团对污水中的污染物有极强的吸附、降解的作用。,形成条件： 荚膜的形成与环境条件密切相关。一般在动物体内或含有血清或糖的培养基中容易形成荚膜，在普通培养基上或连续传代则易消失
5、。 产荚膜的细菌形成的菌落一般具有直径较大，无色透明，隆起明显，用接种环挑取时可拉出粘丝等特点。,三、实验材料,革兰氏染色： （1） 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌（Escherichia coli）斜面；或选用自己保种的细菌。 （2） 革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95乙醇、石炭酸复红液等)、 （3） 香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。,四、实验步骤,菌体适中，玻璃涂成薄膜，不宜太厚，用后接种环用火焰灭菌。,制作涂片,四、实验步骤,晾干，易于染色,3-6次过火固定，强度适中，不宜烫手,初染,1-2m
6、in，所有染色过程染液不可干涸,水洗至水流无色,媒染,先冲去残留水，媒染1min，水洗并沥干,脱色,脱色至流出液为无色，一般20-30s-1min，水洗并沥干。整个过程不要靠近火焰。,复染,1-2min，所有染色过程染液不可干涸,water,水洗，晾干，镜检。,注意事项,1、染料避免干涸，酒精脱色务必避开火焰。 2、老龄菌易被染成红色（细胞通透性出现变化），造成假阴性。一般选用生长活跃的菌体进行染色。（18h-32h） 3、涂片过厚或菌悬液过浓，导致细胞大量堆积，容易导致脱色不完全，造成假阳性。染色结果以分散良好的细菌染色结果为准。 4、酒精脱色不够导致假阳性，脱色过渡导致假阴性。 5、控制好
7、染色区域，保证整个染色过程及最后镜检在同一个区域进行，可用铅笔标记 。,思考题,可用什么方法证明革兰氏染色是成功的？ 革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？ 革兰氏染色哪一步最关键？,五、实验内容及结果,大肠杆菌、金黄葡萄球菌革兰氏染色，绘图，并记录染色结果（颜色，G+或G-）及放大倍数（包括物镜及目镜）等等。,大肠杆菌光学显微镜图（革兰氏染色） 放大倍数：1000 ,解析：大肠杆菌，杆状，菌体为粉红色，属革兰氏阴性菌,1. 细菌的革兰氏染色,金黄葡萄球菌光学显微镜图（革兰氏染色） 放大倍数：1000 ,荚膜染色,实验材料： (l) 同学们自己培养的细菌, 或
8、菌株vv6/vv52/XH7 (2) 1%甲基紫或结晶紫染色液、黑色液（墨汁）。 (3)载玻片、接种环、洗瓶。 (4)显微镜。,实验步骤,1制片：在干净载玻片一端滴一小滴无菌水，取少许细菌在水滴中制成悬液。取一小滴墨汁（或一接种环墨汁）与菌悬液混合，另取一块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以30度角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。 2固定：用纯甲醇固定1分钟，立即倾去甲醇，自然晾干。 3染色：加结晶紫/番红/碱性复红/甲基紫染液数滴于涂片上，染1-2min，以细水流适当冲洗，吸去水后自然晾干。 4. 油镜观察结果。 先用低倍镜再高倍镜观察。 结果：背景黑色，菌体紫色或红色，荚膜呈一清晰透明圈。,图6-2荚膜染色制片法,注意事项,1、玻片干净无油脂。 2、墨水使用量适中，关键是涂片要薄。 3、整个过程不加热，固定使用甲醇，甲醇有较强的毒性且易挥发，对人体的神经系统和血液系统影响最大 ，请同学使用过程特别留意。,实验内容及结果,2株菌株荚膜染色，绘图，记录染色结果（菌体及荚膜形态）及放大倍数（包括物镜及目镜）。,菌株SJJM光学显微镜图（荚膜染色） 放大倍数：1000倍,2. 细菌的荚膜染色,解析：,菌株vv6光学显微镜图（荚膜染色） 放大倍数：1000倍,思考题,1、荚膜染色，为什么不能热固定？ 2、荚膜负染法，荚膜为何不着色而菌体着色？,
