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1、第九章 动植物细胞大规模培养技术原理,一、动物细胞形态,1. 成纤维细胞型 细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆形核，胞质向外伸出23个长短不同的突起。 细胞群常借原生质突连接成网，生长时呈放射状、漩涡或火焰状走行。,成纤维细胞型,第一节 动物细胞培养技术,2. 上皮细胞型,这种细胞呈扁平的不规则三角形，中央有圆形核，生长时常彼此紧密连接单层细胞片，起源于外胚层和内胚层组织的细胞，如皮肤表皮及衍生物(汗腺、皮脂腺等)。,上皮细胞型,3. 游走细胞型,这种细胞的培养需要在支持物上生长，一般不连接成片，细胞胞质经常出现伪足或突起，呈活跃的游走和变形运动，速度快而且方向不规则。,游走细胞型,4. 多
2、形性细胞型,除上述三种细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定它们的稳定形态，可统归多形性细胞。,多形性细胞型,二、动物细胞培养基组成及制备, 天然培养基 合成培养基,1、培养基的组成, 动物血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，血清含有丰富的营养物质，包括大分子蛋白质和核酸等，对动物细胞的生长繁殖具有促进作用。同时，血清对细胞贴壁和保护亦有明显作用，且能中和有毒物质的毒性，使细胞不受伤害。,天然培养基, 根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的，具有一定的组成。 优点：它给细胞提供了一个近似体内生存环境，又便于控制和标准化的体外生存环境。,合成培养基, 氨基酸 维生素 碳水
3、化合物 无机盐 促生长因子及激素 血清,合成培养基, 合成培养基的种类虽多，但一般都含有:,必需氨基酸是动物细胞本身不能合成的，因此，在制备培养基时需加入必需氨基酸。 有时也加入其他非必需氨基酸。,氨基酸, 碳水化合物是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分，主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸钠等。,碳水化合物,维生素可以提供辅酶和辅基，主要靠从血清中取得。,维生素, 无机盐是细胞的重要组成部分之一，它们积极参与细胞的代谢活动。无机盐中Na+、K+、Mg2+、Ca 2+、Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-等金属离子及酸根离子是决定培养基渗透压的主要成分。,无机盐,培
4、养基中的细胞生长条件因子主要来源于血清。,促生长因子及激素, 组织细胞培养中常用的天然培养基是血清。这是因为血清中含有大量的蛋白质、核酸、激素等丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖，粘附及中和某些物质的毒性起着一定的作用。,血清, pH值 渗透压 粘度,2、培养基制备以及制备过程中应考虑的因素,多数细胞系在pH=7.4下生长得很好； 正常的成纤维细胞系以pH=7.47.7最好； 转化细胞pH=7.07.4更合适； 上皮细胞pH=5.5合适。,pH值, 多数培养细胞对渗透压有很宽的耐受围，一般常用冰点降低或蒸汽压升高测定。如果自己配培养基，可通过测定渗透压防止称量和稀释等造成的误差。,渗透压, 培
5、养基的粘度主要受血清含量的影响，在多数情况下，对细胞生长没有什么影响。在搅拌条件下，用羧甲基纤维素增加培养基的粘度，可减轻细胞损害。,粘度,贴壁依赖性细胞（非淋巴组织的细胞和许 多异倍体体系的细胞）。这一类需采用贴壁培养。 非贴壁依赖性细胞（来源于血液、淋巴组织的细胞，肿瘤细胞和某些转化细胞）。这一类可采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养。,二、培养方法, 指大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常生长，并最终在附着表面扩展成单层。,1. 贴壁培养, 是指少数悬浮生长型动物细胞在离体培养时不需要附着物，悬浮于培养液中即可良好生长。,2. 悬浮培养,
6、是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养。 制备方法很多，包括吸附法、共价贴附法、离子/共价交联法、包埋法、微囊法等。,3. 固定化细胞培养,将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法称为包埋法。 优点是：步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞泄漏少，抗机械剪切。 缺点是：扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化，常用载体为多孔凝胶，如琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白。, 包埋法,用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法。 优点：操作操简便、条件温和、是动物细胞固定化中最早研究使用的方法。 缺
7、点：载体的负荷能力低，细胞易脱落。微载体培养和中空纤维培养是该方法的代表，,吸附法,双功能试剂处理细胞悬浮液，会在细胞间形成桥而絮结产生交交联作用，此固定化细胞方法称为离子共价交联法。交联试剂会使一些细胞死亡，也会产生扩散限制。, 离子共价交联法,利用共价键将动物细胞与固相载体结合的固定化方法称为共价贴附法。 此法可减少细胞的泄漏，但须引入化学试剂，对细胞活性有影响，且因贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。,共价贴附法,是用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜； 囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、
8、密度高。微囊直径控制在200-400m为宜。,微囊法, 动物细胞无论是贴壁培养或是悬浮培养，均可采用： 分批式； 分批补料式； 半连续式； 连续式； 灌注式。,三、培养方式,细胞分批式培养的生长曲线与微生物细胞的生长曲线基本相同。 在分批式培养过程中，可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段。,分批式培养,分批补料式培养,在细胞培养的过程中随着营养物质的消耗，不断地向系统中补充新的营养物质，是近年来动物细胞大规模培养技术研究的热点。, 半连续式培养是在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并重新补充加入等量的新鲜培养基，从而使反应器内培养液的总体积保持不变的培养方式
9、。,半连续式培养, 动物细胞的灌注培养即是把细胞接种后进行培养，一方面连续往反应器中加入新鲜的培养基，同时又连续不断地取出等量的培养液，但是过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。,灌注培养,细胞可维持在较小体积培养液中生长； 细胞损伤程度低； 易于更换培养液； 细胞和培养液易于分离； 培养液中产物浓度高，简化了产品分离纯化操作。,固定化培养优点, 动物细胞生长缓慢，又具有锚地依赖性，培养时为防止污染，除反应器密封性能良好外，尚需添加抗生素，培养过程还要求培养器、管道及接头处所用材质不可释放出对细胞有毒害的物质。,三、培养条件控制, 在分批培养时，随着细胞生长，营养
10、消耗，必然产生乳酸等代谢物的积累，引起细胞衰退死亡，需更换培养液或移植继代培养。, 动物细胞培养过程亦应控制一定的环境条件，如培养温度、溶解氧、pH、罐压及搅拌速度等。 动物细胞对环境变化适应能力较微生物细胞小得多，故条件控制精密度要求更高。其中特别重要的是溶解氧和pH的控制。, 细胞密度低，细胞生产率低，产物浓度也很低。 细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物力的丢失或产物活性的降低依然是细胞培养领域深感棘手的问题。 动物细胞培养基，培养设备以及培养用微载体颇为昂贵，限制了细胞培养工程在发展中国家的开展。,四、动物细胞培养存在的问题,开发能高密度生长、能分泌大量目标产品的细胞系。 开发细
11、胞生长性能优良、解离细胞容易，并能重复使用的新型廉价微载体。 研制更大规模的高无菌条件的生物反应器和剪切力小、混合性能良好的新型搅拌系统。 传感器、自动控制技术的应用。 开发新型无血清培养基。,五、动物细胞培养发展的方向,在人工控制下高密度大量培养有益植物细胞技术称之为植物细胞大规模培养，其目的在于通过细胞工业规模培养，获得细胞、初级及次级代谢产物，为药品、食品及化工行业提供服务。,第二节 植物细胞培养技术, 选择培养基的基本原则： 需要根据不同培养对象、培养目的及培养条件探索适宜培养基。 选择的培养基在培养过程使细胞总体积倍增时间1天左右为宜。,一、培养基, 悬浮培养法 分批培养法 半连续培
12、养法 连续培养法 固定化培养法,二、培养方式,主要采用气升式反应器，其培养过程用通气代替搅拌，细胞产量高于平叶轮培养器。 本培养方法中植物细胞生长规律与微生物相似，随着细胞增长，培养液营养物质不断下降。 细胞增长过程也分为延迟期、对数生长期、转换期、静止期及衰减期等阶段。,1. 分批培养法, 在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称之为半连续培养法。反应过程通常以一定时间间隔进行数次反复操作以达到培养细胞与生产有用物质的目的。,2. 半连续培养法, 采用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间 后，以一定速度连续采集细胞与培养液，并以同样 速度供给新鲜培养基，此种培养方式可使细胞生长 环境长期维持恒定。 连续培养法细胞生产能力一般较分批法高，但因细 胞生长缓慢，培养时间长，要维持系统无菌状态， 技术条件要求相当苛刻。,3. 连续培养法, 固定化培养采用固定化反应器，这类反应器有网状多孔板、尼龙网套及中空纤维膜等形式。 固定化培养法的优点在于细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及建立细胞间物理学和化学联系，维持细胞间物理化学梯度，利于细胞组织化，易控制培养条件及获得次生产物。,4. 固定化培养法, 细胞种质影响 外界因素影响 光照影响 温度影响 培养基成分的影响 搅拌方式与通气的影响,三、影响细胞培养因素,思考题,见教材416面。,
