第三章__载体讲解

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1、,基因工程工具酶比较,DNA聚合酶： 在DNA复制时起作用，将多个脱氧核苷酸催化聚合为脱氧核苷酸链（也就是DNA单链），此时形成的化学键是磷酸二酯键。 DNA解旋酶： 在DNA复制或转录时起作用，将DNA的双链解开，作用对象是氢键，使氢键断裂 DNA水解酶： 在消化道或细胞内起作用，将DNA水解为脱氧核苷酸，作用对象是磷酸二酯键,基因工程工具酶比较,DNA连接酶： 在DNA修饰过程或基因工程中起作用，将两个DNA片段连接起来，此时形成的化学键是磷酸二酯键。,基因工程工具酶比较,限制性核酸内切酶（以下简称限制酶）：限制酶主要存在于微生物（细菌、霉菌等）中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，

2、并且能在特定的切点上切割DNA分子。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。目前已经发现了200多种限制酶，它们的切点各不相同。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。在基因工程中起作用。,基因工程工具酶比较,DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。 DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷

3、酸二酯键，在DNA复制中起做用。 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 他们的区别在于，聚合酶是把单个脱氧核糖核苷酸连起来。也就是用于DNA复制。连接酶是把断裂的DNA再缝合起来。一般就是限制酶切开的它在连起来。,基因工程工具酶比较,RNA聚合酶（又称RNA复制酶、RNA合成酶）的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。真核生物RNA聚合酶：真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞

4、核内的RNA聚合酶：RNA聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。在RNA复制和转录中起作用。 反转录酶：RNA指导的DNA聚合酶，具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指导的DNA聚合酶。在分子生物学技术中，作为重要的工具酶被广泛用于建立基因文库、获得目的基因等工作。在基因工程中起作用。,基因工程工具酶比较,解旋酶：是一类解开氢键的酶，由水解ATP来供给能量它们常常依赖于单链的存在，并能识别复制叉的单链结构。在细菌中类似的解旋酶很多，都具有ATP酶的活性。大部分的移动方向是53，但也有35移到的情况，如n蛋白

5、在174以正链为模板合成复制形的过程中，就是按35移动。在DNA复制中起做用。 DNA限制酶作用于磷酸二酯键 DNA连接酶作用于磷酸二酯键 DNA聚合酶作用于磷酸二酯键 DNA解旋酶作用于氢键,基因工程工具酶比较,核糖核酸酶A：又称为RNA酶，主要是降解磷酸二酯键 ，可以用于去除DNA：RNA或RNA：RNA杂合体中未杂合的RNA区域；降解DNA制备物种的RNA分子；确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。 脱氧核糖核酸酶：一种发现于多种细胞和组织的核酸酶，属核酸内切酶，靶向切割邻近嘧啶的磷酸二酯键，产生5端为磷酸基团、3端为羟基的多聚核苷酸，平均消化产物最小为多聚四核苷酸。,第三章 载体,ve

6、ctors,在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。,一、载体 （Vectors）,广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具叫载体。,载体的本质是DNA。 经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以致功能的表达。,发展概况 1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。

7、3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,基因工程中常用的主要载体,质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒,噬菌体载体,柯斯质粒 (cosmid),单链DNA噬菌体M13,动物病毒,人工染色体 (artificial chromosome),载体的功能及特征,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,（1）具有对受体细胞的可转移性，可提高载体导入受体细胞的效率。 （2）具有与特定受体细胞相适应的复制原点或整合位点

8、，使得外源基因可在受体细胞中大量繁殖或稳定遗传。 （3）具有多种单一的核酸酶切位点(多克隆位点)，可用于外源基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖。 （4）具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测。 （5）具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因的非控制性扩散，给人类造成危害,2. 基因工程对载体的要求,遗传标记基因 1. 标记基因的作用 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ） 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 * 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非

9、选择性的（如TcS， lacZ, GUS），绝大多数为后者。 *有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZ，GUS等）。,2. 标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因 2）营养标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类

10、的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。 3）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT 4） 噬菌斑,3. 使用标记基因注意要点 1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始序列, 密码子偏爱性 4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS 4. 常用的遗传标记基因 1) 四环素抗性基因（Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AA

11、s蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。,2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。 3) 氯霉素抗性基因（Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生

12、素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。,5）半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ） 半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZ）均可作为标记基因。 半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测

13、直观 b. lacZ编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量大,6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS） 该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。 7）荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。 8）发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母

14、产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。,3. 载体 的种类,基因工程中常用的载体有5类：,质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）,来源,克隆载体 （cloning vector）,对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可,按功能分类,表达载体 （expression vector）,使目的基因在宿主细胞中表达，既有复制子，又有强启动子,穿梭载体 （shuttle vector）,可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。,功能,克隆载体: 克隆一个基因或DNA片段 表达载

15、体: 用于一个基因的蛋白表达 整合载体: 把一个基因插入到染色体组中,第一节 质粒载体,一、质粒（plasmid）,是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。,存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。,大肠杆菌的质粒,（1）分子小：,1. 质粒的一般生物学特性,1500 kb,（2）编码基因少：,23个中等大小的蛋白质。,（3）环形状：,双链环状DNA。,（酵母的“杀伤质粒”是RNA,编码毒性糖蛋白）。,如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。,质粒DNA分子大小,（4）质粒的空间构型：, 共价闭合环状DNA（cccDNA),呈超螺旋（SC）（super coi

16、l）,Covalent close circular DNA, 线形DNA （ linear ，lDNA）,一条链上有一至数个缺口。, 开环DNA（ open circular， ocDNA）,（5）质粒空间构型与电泳速率,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：,scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。,SC,OC,L,（6）氯化铯密度梯度离心提取质粒,原 理,氯化铯密度梯度离心法步骤：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加CsCl和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下注射器吸取cccDNA,稀释沉淀cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,过Dowex AG50W-X8柱子，用数倍体积的TE/0.2mol/L NaCL清洗去除EB,二、质粒的类型,在大肠杆菌中的质粒，可以分为：,接合型质粒:,非接合型质粒,能自我转移,不能自我转移,1、依据