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1、2010版药典无菌检查法主要增修订及其展望,第八、九届药典会微生物专业委员 上海市食品药品检验所 钱维清,国内外药典微生物学检验 发展的宗旨： 提高方法捡出率、保证检验结果的准确性、可靠性。 1、 实验环境、设施的发展； 2、 培养基的品种和适用性要求； 3、 检验数量、检验量符合统计学要求； 4、 检验方法和仪器的改进 （薄膜过滤法、全封闭过滤培养器） 5、 验证试验；（ICH、USP、EP、BP、JP均有规定） 6、 培养时间； 7、 结果 的分析和判断； 等。,回顾国际无菌检查法发展历史 1925年 直接接种法首先使用在英国 1932年 英国药典推荐使用无菌测试 1936年 美国药典第十
2、一章首先引用单个培养基的直接接种法 1950年 美国药典第十六章推荐使用FTG和SB两种培养基分别 培养需、厌气 菌和真菌 1957年 美国FDA和MILLIPORE公司介绍膜过滤法用于抗生素无菌测试 1963年 英国药典63版收载薄膜过滤法无菌测试 1965年 美国药典引用薄膜过滤法用于非抑菌性药品的无菌测试 1971年 欧洲药典第二版公布参照薄膜过滤法无菌测试 1978年 欧洲药典修订版发行公布推荐使用薄膜过滤法无菌测试 1988年 美国FDA规定：假如第一次无菌检查不符合规定的样品不再复试，这 一批次的药品应报废。实际上排除了药品无菌阳性后再测试的机会 1998年 英国药典1998无菌测
3、试以一次检出为准，取消复试。 2000年 美国药典24版无菌测试以一次检出为准，取消复试。,检视我国历版药典无菌检查法发展历史 1953版 实验环境仅要求为半无菌操作箱；仅收载一种直接接种法； 用一种培养基检查 1963版 仅一种直接接种法；用三种培养基分别培养细菌和霉菌 1977版 开始收载薄膜过滤法（简单装置），用二种培养基分别培 养细菌和霉菌 1985版 收载薄膜过滤法限于抗生素样品；用需、厌气菌培养基及 霉菌培养基；要求实验环境为紫外线灭菌的无菌室。 1990版 与85年版相同 1995版 开始要求对培养基进行灵敏度检查。 2000版 规定实验环境为100级洁净度；检验数量从2支/瓶增
4、加为 611支/瓶；明确薄膜过滤法为首选方法包括大容量液体样品 首次引用、收载全封闭过滤技术。,对比国际无菌检查发展历史 ， 我国2000版以前药典无菌检查法因技术和认识的不足，对提高方法捡出率、保证检验结果的准确性、可靠性方面的规定与先进国家药典中的要求严重脱节。,2005版无菌检查法取得长足发展 实验环境要求 、验证试验、 延长培养时间至少为14天、以一次检出为准，取消复试等亮点。 是2005年版药典无菌检查法的大步发展，从而使2005年版无菌检查法比历版无菌检查法有了突破性的提高。 基本与国际先进药典无菌检查法接轨。,2010年版药典无菌检查法的发展，主要是在总结和巩固实施验证试验以来所
5、取得经验及认识的基础上，作两方面的发展： 一、附录无菌检查法（一部附录 B） （二部附录 H） （三部附录 A） 围绕着保证实验结果的准确性、可靠性作进一步的增、修订。 二、品种各论中【无菌】各论化的发展,一、附录无菌检查法中的增、修订 （一）总则部分 （二）培养基部分 （三）灵敏度检查部分 （四）稀释液、冲洗液部分 （五）方法验证部分 （六）薄膜过滤法部分 （七）培养及观察部分 （八） 结果判断部分 （九） 表1、表2和表3,（一）总则部分 新增规定 1、“ 防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。” 2、“ 日常检验还需要对环境进行监控。” 3、“ 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，
6、并经过无菌技术的培训。,（二）培养基部分 1、删除： 硫乙醇酸盐流体培养基 后括号（用于培养好氧菌、厌氧菌）的说明 2、删除： 改良马丁培养基 后括号（用于培养真菌）的说明,3、删除： 选择性培养基 项下加入适量中和剂或表面活性剂 “ 如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供试品）、聚山梨酯80（用于非水溶性供试品）或-内酰胺酶（用于-内酰胺类供试品）”等说明。 修订为： 在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。 增订：表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法 (见微生物限度检查法中）,表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法,4、将原排列第 6. 的 0.5%葡萄糖肉汤培养基（用
7、于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查） 修订排列为第 4. 按顺序归类培养基1.4. 均为直接用于无菌检查的液体培养基。,（三）培养基灵敏度检查部分 1、在菌液制备中，修订黑曲霉的孢子悬液制备方法：规定应使用含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液，洗脱孢子及稀释孢子液，制成每1ml中含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。 删除了：（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管） 吸出孢子悬液的操作方法,2、新增加稀释后的工作用菌液的保存条件和保存期限： 菌液制备后“若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存期
8、内使用。”,（四） 稀释液、冲洗液及其制备方法部分 在原有 1. 0.1%蛋白胨水溶液 2. pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲 新增加： 可根据供试品的特性，选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。,（五）方法验证试验部分 1、验证试验用菌种及菌液制备在培养基灵敏度所用菌种的基础上，删除铜绿假单胞菌，增订大肠埃希菌。 是因在验证试验的实践中，发现作为革兰氏阴性杆菌代表的铜绿假单胞菌在验证试验中对大部分抗生素不敏感，而大肠埃希菌对抗革兰氏阴性杆菌为主的抗生素敏感性较好。,2、验证试验中样品用量的规定： 删除了原：“ 将规定量供试品按 ”修订为 薄膜过滤法： “ 取每种培养基规定接种的供试品总
9、量按 薄膜过滤法过滤” 直接接种法： “接入每支培养基规定的供试品接种量” 明确了验证试验所需样品量是供试品的检验量而不是供试品的检验数量。,（六）供试品的无菌检查部分 1、阳性对照用量的修订： 原：“若采用直接接种法，应增加供试品1支（或瓶）作阳性对照用。” 修订为 ：若采用直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照用。 因若是液体制剂，应该采用薄膜过滤法，若是固体制剂每管接种量可能不止1支（或瓶），应按验证的方法确定。,2、薄膜过滤法中的增、修订： 2.1 新增规定：抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜 2.2 新增规定：对每片滤膜的总冲洗量不得过1000ml
10、2.3 新增规定：所用冲洗量、冲洗方法同验证试验,2.4 修订：无菌气（喷）雾剂供试品的检验方法： 规定置至少-20冰室冷冻1小时。并新增开启容器后 “将供试品转移至无菌容器中”的操作步骤。,2.5 修订：装有药物的注射器供试品的检验方法： 删除 原 “装上无菌针头（非包装中所配带的）” 修订为 “取规定量，排出注射器中的内容物，若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解，直接过滤，” 没有必要将原装配好的针头取下来,3、 直接接种法中的增、修订： 删除了原直接接种法中-内酰胺类或黄胺类供试品项 。 因该两类供试品的无菌检查以采用薄膜过滤法加中和剂更好。,4、 培养及观察中的增、修订： 对于培养1
11、4天后，不能从外观上判断有无微生物生长时， 删除了：“或划线接种于斜面培养基上” 的规定。 必然删除：可根据斜面是否有菌生长而判断的规定。,（七）结果判断部分 新增订：阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。 强调阳性对照、阴性对照在无菌检查实验成立与否中的作用。,（八） 表1、表2和表3部分 表1 将表1第3列的表题原 “每种培养基最少检验数量” 修订为：“接种每种培养基所需的最少检验数量” 更明确指出接种到培养基中去的检验量。 修订了表1下的 注: 对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍。,表2 将表2原名称：“上市抽验样品（液体制剂）的
12、最少检验数量” 修订为：“ 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量” 明确液体制剂最少检验量见表2的第2列，供试品最少检验数量见表2的第3列。 修订了表2下的 注: 对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍。,表3 将表3原名称：“上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量” 修订为：“ 固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量” 明确固体制剂最少检验量见表3第2列；供试品最少检验数量见表3的第3列。 修订了表3下的 注: 对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍。,二、各论中【无菌】各论化的发展 举例如下： 乙酰谷酰胺注射液、丁
13、溴东莨菪碱注射液 无菌：取本品，经薄膜过滤法处理，用0.1无菌蛋白胨水溶液分次冲洗（每膜不少于100ml），以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查（附录H），应符合规定。,举例如下： 头孢曲松钠、头孢拉定、头孢哌酮钠、头孢硫脒、注射用阿莫西林钠克拉维酸钾、盐酸林可霉素注射液 无菌：取本品，用适宜溶剂溶解后转移至不少于500ml的0.9%无菌氯化钠溶液中，用薄膜过滤法处理后，依法检查（附录H），应符合规定。 氧氟沙星氯化钠注射液 无菌：取本品，经薄膜过滤法处理，用0.1无菌蛋白胨水溶液分次冲洗（每膜不少于500ml）每管培养基中加入0.1mol/L硫酸锰溶液1ml,以大肠埃希菌为阳性对照菌，依法
14、检查（附录H），应符合规定。,一、无菌检查用培养基的不断改进 二、增加对检出菌的检定要求 三、对每种接种后的培养基分别置两种温度（适合细菌生长和适合真菌生长）下培养 四、各论化中无菌检查表述的进一步规范化,无菌检查法的展望,一、无菌检查用培养基的不断改进,1、应与国际先进药典无菌检查法所用培养基保持一致 理由（1） 与USP/BP/EP/JP保持一致便于国际交流。,理由（2） USP中大豆酪蛋白胨培养基灵敏度测定要求用3种菌：枯草杆菌、白念、黑曲检查。我国药典改良马丁培养基灵敏度测定只要求2种菌：白念、黑曲。 实验证明大豆酪蛋白胨培养基同时适合真菌、细菌的生长，有利于提高污染菌的检出率。,2、
15、须进一步深入开展无菌检查用培养基的研究与开发 理由（1） 无菌检查用培养基曾从仅1种发展起来，且配方也逐步调整。随着对药品安全的保证和药品无菌检查要求的不断提高，无菌检查用培养基应不断改进。 理由（2） 任何一种培养基不可能把药品中可能存在的菌都培养出来。,理由（3） 与培养基灵敏度试验用菌相比较，药品中的污染微生物会更广泛、活性更低。 理由（4） 如存在某些苛养菌、亚致死状态菌是否需要添加更丰富的营养成分，如动物的血液、动物组织提取液等才能被检出。,理由（5） 据报道：巯乙醇酸盐流体培养基中指示剂刃天青对微生物有一定抑制作用，（加0.1%刃天青1ml0.5ml对灵敏度无显著差异。） 美国药典
16、中同时收载两种巯乙醇酸盐流体培养基供选择，其中之一无刃天青和琼脂 引入思考：什么情况下应选择用？为什么我国只收载一种？,理由（5） 可能存在严格厌氧菌巯乙醇酸盐流体培养基中所营造的厌氧环境是否足以满足严格厌氧菌的培养需要？ 引入思考：现无菌检查的实验操作、培养条件是否足够能满足严格厌氧菌的检出。,二、增加对检出菌的检定要求,理由（1） 面临更高的要求。 随着现代科技的发展和国际交往的频繁，人们对物质文化生活及健康保障的要求越来越高，医药品的发展必将对药品微生物质量标准的制定、质量监督和检测的任务提出更高的要求。,理由（2） 无菌检查是高风险产品关乎用药安全性的必检项目，为对所检供试品的质量负责，对检验质量的负责，应对检出菌有一定的交代和证明。,理由（3） 无菌检查法前言中：“若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明供试品在该检
