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1、2019/10/16,高效液相色谱法(HPLC) high performance liquid chromatograph,2019/10/16,高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压驱动流动相 、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。,概述,2019/10/16,发展： 1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。20世纪60年代末科克兰
2、（Kirkland）、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、哈伯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。,2019/10/16,高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。 1971年科克兰等人出版了液相色谱的现代实践一书，标志着高效液相色谱法 (HPLC)正式建立。,2019/10/16,1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为色谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动相的组成提高选择性的关键
3、。,2019/10/16,一、HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径1-3cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n） 分析周期长 无法在线检测 2HPLC：分离和分析 柱内径2-6mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H，n） 分析时间大大缩短 可以在线检测,2019/10/16,2019/10/16,二、HPLC与GC差别,1分析对象 GC： 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：
4、溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制 ,分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测,用途广泛，占有机物的80%,2019/10/16,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,2019/10/16,2流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用,3操作条件差别 GC： 加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度
5、大，峰展宽小）,2019/10/16,高效液相色谱仪的结构示意图：一般可分为五个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统,检测系统和数据处理及控制系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。,第三节 高效液相色谱仪,2019/10/16,第三节 高效液相色谱仪,2019/10/16,2019/10/16,2019/10/16,Agilent 1200液相色谱系统,2019/10/16,2019/10/16,高效液相色谱仪的仪器流程,(process and main assembly of HPLC),高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数 据采集和控制系统,2019
6、/10/16,2019/10/16,1.高压输液系统 高压输液泵:主要部件之一，压力：1535 MPa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,（动画）,(二).主要部件,2019/10/16,流动相的预处理： 在使用前必须进行脱气处理，以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡 抽真空脱气 吹氦脱气 加热回流脱气 超声波脱气,2019/10/16,等强度洗脱（isocratic):样品的组成较简单，各组分的分配系数值相差不
7、大。在同一分析周期内流动相的组成保持恒定。 梯度洗脱（gradient)：样品的组成较复杂，各组分的分配系数值相差大，即宽分配比的组分,流动相的洗脱方式,2019/10/16,梯度洗脱的特点 梯度洗脱的主要条件 梯度洗脱的基本原理,梯度洗脱（溶剂程序）：在同一个分析周期内按一定的程序改变流动相的组成,从而改变流动相极性、离子强度、pH，来调整组分的k值，改变分离因子值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。,梯度洗脱（gradient),2019/10/16,1梯度洗脱的特点,（1）提高分离度，加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, （3）提高检测的灵敏度， 有利于痕量组分的检测； （4）
8、增加峰容量； （5）强烈滞留的组分不容易残留在柱上, 保持柱性能长期良好；,梯度洗脱的作用,2019/10/16,(2)梯度淋洗装置,外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度:一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,2019/10/16,2梯度洗脱的主要条件, A 流动相/弱溶剂组成； B 流动相/强溶剂组成； 梯度时间； 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。,2019/10/16,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,2.进样系统,2019/10/16
9、,2019/10/16,六通阀定量环,通废液口,进柱,定量环,手动进样器、六通阀、定量环,2019/10/16,仪器：自动进样器,机械手,样品盘,自动进样器,自动进样100样品盘、机器手、自动洗针,2019/10/16,高效分离柱:柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,分离系统,2019/10/16,柱温箱,外挂架,色谱柱、柱温箱、色谱柱外挂架,2019/10/16,4. 检测系统,a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流
10、速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。,2019/10/16,b. 光电二极管阵列检测器,光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,2019/10/16,光电转换元件是:光电二极管,即晶体硅(体积仅50ul),如Agilent 1100型光电二极管阵列检测器,波长范围为190-950nm对应1024个光电二极管,平均0.74nm谱带区间,由一个光电二极管接收.,光电二极管阵列检测器构造,2019/10/16,2019/10/16,当复合光透过流通池后,被组分吸收,其透过光具有了组分的光谱吸收特征.此透过光被光栅分
11、光后,形成组分的吸收光谱,照到光电二极管阵列装置上,使每个纳米光波的光强转化为相应的电信号,给出组分的吸收光谱. 本检测器可以同时获得样品的色谱图(C-t)及每个色谱峰的吸收光谱(A-入),得到三维光谱-色谱图,可以同时得到定性和定量及色谱峰是否单一组分的信息.,工作原理,2019/10/16,2019/10/16,c. 示差折光检测器 （differential refractive index detector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏感、不
12、能用于梯度洗脱； 偏转式、反射式和干涉型三种；,2019/10/16,示差折光检测器,2019/10/16,高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,荧光检测器 （fluorescence detector）,2019/10/16,蒸发光散射检测器 (evaporative light scattering detector, ELSD),此类检测器是上世纪90年代出现的最新型的泛用检测器.可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测.但灵敏度低于紫外光度型.因而主要用于糖类,高分子化合物,高级脂肪酸及甾体类等几十类化合物. 构
13、造 检测机理,蒸发光散射检测器（ELSD） evaporative light scattering detector,2019/10/16,步骤一 ：雾化 柱洗脱液进入雾化器针管，在针的末端，洗脱液和氮气混合形成均匀的微小雾状液滴 步骤二：流动相的蒸发 液滴流经加热的漂移管时，流动相蒸发，样品在溶剂蒸气中形成雾状微小颗粒，悬浮在溶剂蒸气中 步骤三：检测 样品小颗粒进入流动池时，经过一束激光,颗粒散射激光,经硅晶体光电二极管检测散射光，并产生电信号。,2019/10/16,构造,构造,2019/10/16,检测机理,1.雾化过程:形成细小均匀的雾状液滴 2.流动相蒸发过程:流动相蒸发,样品分子
14、形成雾状颗粒. 3.检测过程:670nm激光束的照射,产生散射光,其被硅晶体光电二极管产生电信号,工作原理,2019/10/16,五,色谱工作站 计算机：控制显示,五.数据记录系统和控制系统,2019/10/16, 流路系统（分析单元）：高、低压流路 电路系统（控制单元）：信号传输与处理,2019/10/16,仪器：化学工作站,进样器,高压泵,流动相,色谱柱,检测器,数据处理,2019/10/16,首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,高效液相色谱的工作流程,2019/10/16,原理 储液器中的流动相被 高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度不同，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。,
