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1、阿苯达唑自微乳体外抗泡球蚴药效学研究张丽娜 1*，张永军 2，3# ，陈卫军 2，李雪琴 1，李高 3(1石河子大学药学院，石河子832000；2石河子大学医学院第一附属医院，石河子，832008；3华中科技大学同济药学院，武汉 430030)摘要 目的 建立泡球蚴组织体外培养模型，以阿苯达唑片剂(ABZ-T)为阳性对照，初步观察ABZ自微乳（ABZ-S）体外抗泡球蚴作用。方法 泡球蚴组织体外培养6周后，分为5组：ABZ自微乳（ABZ-S）、ABZ片剂(ABZ-T)、空白组、二甲基亚砜（DMSO）组和空白乳组。再根据ABZ含量（0.01、0.1、1）mg/L将ABZ-S和ABZ-T各分为三个亚
2、组。用药48h、120h和14d后，分别取样观察超微结构。实验期间对囊泡进行计数，并监测囊液中阿苯达唑亚砜（ABZSX）的浓度。结果 ABZ-S和ABZ-T均可抑制泡球蚴的生长。超微结构观察：与同等浓度（1和0.1）mg/L片剂相比，ABZ自微乳对泡球蚴的损害强于片剂；但在低浓度（0.01mg/L），两种剂型在用药5d后，囊泡数均不再改变，泡球蚴对药物的敏感性降低。连续14d测定囊液中药物浓度，10d后囊液药物浓度趋于平衡，同剂量下ABZ-S囊液中药物（ABZSX）浓度高于ABZ-T。结论 ABZ自微乳能够促进药物穿过囊壁细胞，提高囊液药物浓度，增强ABZ抗包虫病的疗效。关键词 泡球蚴；体外培
3、养；阿苯达唑；自微乳Pharmacodynamic study of albendazole-SMEDDS against In vitro-Culture of Echinococcus multilocularis metacestodesZHANG Li-na1， ZHANG Yong-jun2,3， CHEN Wei-jun2， LI Xue-qin1， LI Gao3(1 Pharmacy College of Shihezi University, Shihezi 832002,China;2 The First Affiliated Hospital Medical Colleg
4、e of Shihezi University, Shihezi 832008,China;3 Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China )ABSTRACT Objective Echinococcus multilocular is metacestodes were cultured in vitro successfully, use albendazole tablets(ABZ-T) as a positive control, primary
5、observation on efficacy of ABZ-SMEDDS(ABZ-S) against in vitro-Culture of echinococcus multilocularis metacestodes . Methods After culturing for 9 weeks, the metacestode tissues were divided into 5 groups, albendazole tablets, albendazole-SMEDDS, a culture in culture medium alone, a culture containin
6、g an equal amount of DMSO, a culture containing an equal amount of microemulsion. The treapeutical groups were then divided into three subgroups by given the dose of (1, 0.1, 0.01)mg/L. During the experiment, vesicles were counted every day. 48 h ,120h and 14 d post-treatment, the parasite tissues w
7、ere fixed and observed under electron microscope. Every day, measure concentration of ABZ the main metabolite ABZ sulfoxide(ABZSX) in cysts fluid by HPLC. Results ABZ-S and ABZ-T can inhibit the growth of metacestodes in vitro. From the electron microscope, at the same concentration of ABZ (1 and 0.
8、1) mg/L, ABZ-S histopathological damage were obviously serious than ABZ-T; but in low concentration of ABZ(0.01mg/L), After 5 days, the number of vesicles are not changing, echinococcus multilocular reduced susceptibility to drugs. measure concentration of ABZ main 【基金项目】 新疆生产建设兵团科技攻关计划课题（2007GG26 ）
9、。* 硕士研究生。研究方向：药物新剂型研究。电话：13565544191。E-mail：# 通讯作者：主任药师。研究方向：药物新剂型研究。电话：0993-2852106。E-mail：metabolite ABZ sulfoxide(ABZSX) in cysts fluid by HPLC, the drug concentration after the 10d tends to balance, and at the same dose , Compare to ABZ-T, concentration of ABZ in cysts fluid were higher than ABZ
10、-S. Conclusions Microemulsion can promote drug through the wall in the cell, improve ABZ main metabolite ABZSX, which can potentiate the therapeutic effect on alveolar hydatides. Key words Alveolr echinococcosis; culture in vitro; albendazole ;self-microemulsifying drug delivery system 泡型包虫病（Alveola
11、r Echinococcosis, AE）是由多房棘球蚴绦虫的幼虫引起的，主要侵犯肝脏，该病的病死率较高，是一种严重危害牧区人民健康的寄生虫病 1。目前，许多学者在不断地进行治疗泡球蚴病的动物实验研究，因宿主和寄生虫之间的复杂关系，动物模型往往不适于对寄生虫成分和生理功能的研究，而且要消耗大量的人力、物力和时间 2,3。为了便于在实验室研究泡球蚴，寻找预防和治疗泡球蚴病的有效方法，体外培养有着生长周期短、便于控制条件等优点，被应用为研究包虫病和宿主之间复杂关系的有力工具 4,5。本研究使用 Caco-2细胞作为滋养层，进行包虫组织体外培养，用于ABZ不同剂型体外杀虫效果的初步研究。1 材料与方
12、法1.1 材料 阿苯达唑标准品( 中国药品生物制品检定所，批号：100373-200301)；阿苯达唑原料药（上海顺强生物科技有限公司，批号：061105）；油酸（上海山浦化工有限公司，批号：061220) ）；辛酸/葵酸三甘油酯（GTCC，浙江物美化学品有限公司提供）；聚氧乙烯（35）蓖麻油（Cremophor EL，德国BASF公司提供，批号：13416324U0）；乙二醇单乙基醚(Transcutol，法国Gattefosse公司提供)；阿苯达唑市售片（湖北制药有限公司，批号： 20090501）；DMEM培养基(Dulbecco s Modified Eaglesmedium, GIB
13、CO)，胎牛血清（FBS，Hyclone，USA）；青霉素（华北制药股份有限公司）；链霉素（华北制药股份有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，sigma公司）。高效液相色谱仪（LC-10Atvp型输液泵，SPD-10Avp紫外检测器，CBM-102色谱工作站，日本 Shimadzu公司）；透射电子显微镜( 日本 JEM-1230)。1.2 Caco-2细胞的培养当Caco-2生长至基本融合时，用胰酶消化法1:3 传代。加入1mL0.25% 胰蛋白酶，使消化液流遍所有细胞表面，消化5min后在镜下观察，若胞质回缩、细胞间隙增大，终止消化。反复吹打使细胞脱离瓶壁，分别接种在新的培养瓶内。1.3 泡球蚴
14、组织培养将感染泡球蚴6周的仓鼠颈椎脱臼处死后快速放入75%酒精中消毒10min后，无菌超净台内取出泡球蚴组织，剪成0.5cm 3小块 (修剪过程中可适当加数滴无菌 PBS，以防止组织块干燥) ；用无菌缓冲液冲洗数遍直至液体较为澄清，每个25cm 3的培养瓶中放入3块，加入20mL新鲜培养液，将培养瓶直立于37、5%CO2培养箱中，一周换液三次，每天观察并记录游离囊泡数。1.4 药物配制及分组1.4.1 药物的制备 阿苯达唑片剂：取相当于阿苯达唑的粉末，溶于二甲基亚砜(DMSO) 并配置成20g/L 的溶液备用（DMSO含量0.5%）；阿苯达唑自微乳：称取固定比例的的油酸、甘油三辛酸酯（GTCC
15、）、聚氧乙烯35 蓖麻油（Cremophor EL ）、乙二醇单乙基醚 (Transcutol HP )总量约2g，精密称取加入ABZ 原料药15.2mg，超声使药物溶解后，即得浓度为7.6mg/g (7.76g/L)ABZ-SMEDDS浓缩液。1.4.2 实验分组 阿苯达唑片剂组(ABZ-S)：浓度为（1、0.1、0.01mg/L）；阿苯达唑自微乳组(ABZ-T)：浓度为（1、0.1、0.01mg/L）；空白组：空白培养液组（等量培养基）；空白乳组（等量空白乳）；DMSO组（等量二甲基亚砜）。1.4.3 药物试验 将培养6周的泡球蚴组织，收集囊泡并随机按3.2中分组，每组约70个囊泡，各组培
16、养瓶加入含10%胎牛血清的DMEM培养基10mL(含青-链霉素1%)。分别加入上述各药物，使药物终浓度为（0.01 、0.1、1）mg/L。空白组加入等量的培养基。混匀后置于37、5%CO 2，细胞培养箱中培养，观察药物的药效，实验过程中不更换培养液。1.5 药物浓度测定 1.5.1色谱条件 色谱柱： Eclipse XDB-pheny 14.6mm25cm；流动相：乙腈:水=48:52 ；流速：0.8 mLmin-1；检测波长：295nm；柱温： 30；进样量：20L 。MBZ和ABZSX分离良好，保留时间为4.085和6.691min。1.5.2 样品采集 在给药后的2、4、6、12、24h取囊液，以后每隔24h取囊液一次，连续取囊液至14d。将ABZ-S和ABZ-T各组囊泡收集后并小心用PBS洗两遍，然后用细针扎破取囊液，取50uL囊液于0.5mL 离心管中，依次加入25uL内标（甲苯咪唑0.8mgL -1
