《荧光定量pcr步骤【2014-12-24】.》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光定量pcr步骤【2014-12-24】.（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、荧光定量PCR步骤一土壤基因组DNA提取（一）试剂和仪器：1. 乙醇(96%-100%)2. 异丙醇3. 离心机4. 漩涡振荡器5. 水浴锅6. 电子天平7. 超净工作台8. 1000ul、100ul移液枪；灭菌枪头9. 1.5ml灭菌离心管、2ml灭菌离心管10. 称量纸、称量勺、滤纸、酒精棉球、镊子等（二）提取步骤（OMEGA试剂盒 E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit）：提取前准备工作：按说明书的比例用乙醇稀释SPW Wash Buffer。1. 打开水浴锅预热70（70预热Elution Buffer），用1.5ml离心管，取0.5g土壤，加入0.5g玻璃珠，加入1ml Bu
2、ffer SLX MLus，立即在涡旋仪上最高速涡旋3min，使菌体进入溶液（豆粕的改为：打开水浴锅预热70，取3g豆粕到50mL离心管中，加入27mL水，3000rpm离心5min，重复3次各取4mL上清到5mL离心管，13000rpm离心2min，弃上清，加0.5g玻璃珠，加1mL Buffer SLX MLus，立即在涡旋仪上最高速涡旋3min，使菌体进入溶液）；2. 加入100ul Buffer DS，涡旋混匀；3. 转移至预热至70水浴锅中水浴10min，水浴过程中轻轻翻转一次（若存在较难溶解的细菌，水浴温度可增加到90），使菌体裂解；4. 3,000 rpm室温离心3min，转移8
3、00ul上清液到新的2ml离心管中，并加入270ul Buffer SP2涡旋混匀；（离心时准备冰盒）5. 置于冰中5min，13,000 xrpm、4离心5min（配平）；6. 在超净台中把上清液转称至新的2ml离心管中，加入0.7倍（749ul）的异丙醇，翻转混匀20-30次，把样品置于-20 1h；7. 13,000 rpm、4离心10min，沉淀DNA（可能看不到沉淀）；8. 倒弃上清液，并反扣于吸水纸上1min, 若还有残留，则在超净台中用移液器吸去；9. 加入70预热的200 ul Elution Buffer，涡旋10s，65水浴15min，让DNA充分溶解（如果想得到不含RNA
4、的DNA，在这一步向样品中加10ul 25mg/mL的RNA酶A）；10. 用剪过的黄枪头加入50ul HTR Reagent(使用前充分摇匀)，漩涡混合10s;11. 置于室温2min，13,000 rpm离心2min, 使HTR Reagent沉降；12. 转移上清液至新的2ml离心管（若经HTR Reagent提取后样品仍然显棕色或深色，重复步骤10-12）；13. 加入与上清液等体积（约200ul）XP2 Buffer, 漩涡震荡充分混匀；14. 将上步所得溶液加到吸附柱（柱子套在2ml收集管中），12,000 rpm 室温离心1min，弃上清液，保留收集管；15. 柱子重新套在上步收
5、集管中，加入300ul XP2 Buffer，12,000 rpm 室温离心1min，弃上清液和收集管；16. 柱子套在新的2ml收集管中，加入700ul SPW Wash Buffer（经乙醇稀释），12,000 rpm室温离心1min，弃上清液，保留收集管；17. 柱子重新套在上步收集管中，重复步骤16；18. 柱子重新套在上步收集管中，13,000 x g 室温空离2min，使吸附柱干燥（空离完后在超净台中开盖晾干2min。该步对去除乙醇残余至关重要，乙醇残留可能会影响下游酶的使用）；19. 把柱子置于新的1.5ml离心管，枪头不要碰触吸附柱，垂直悬空加加30ul Elution Buf
6、fer至吸附柱中央，65水浴15min， 13,000 x g离心1min，洗提回收DNA；20. 换个1.5ml离心管，重复上步（不需要水浴）；21. 将两次得到的DNA溶液合并后再分装两管，每个30ul，一个放4常用，另一个-20低温储存。22. 用微量之外分光光度计测定提取的DNA浓度，OD260/OD280约为1.8左右，过低有蛋白质和酚污染，过高有RNA存在。二琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA产物（1%琼脂糖凝胶）（一）试剂和仪器1. EDTA、NaOH、Tris、乙酸2. EB3. 琼脂糖4. 10ul移液枪5. 电泳槽6. 电泳成像系统（二）药液配制1. 50TAE缓冲液（pH8.3
7、）：称取Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g，向烧杯中加800ml的去离子水，充分搅拌溶解；加入57.1mL乙酸，使用去离子水定容至1L，高压灭菌后保存于室温。2. 1TAE缓冲液：例如需要使用200ml的1*TAE，则量4ml的50*TAE，196ml的去离子水，混匀即可。（三）步骤1. 制备1%琼脂糖凝胶（大胶用60ml,小胶用30ml）: 称取0.6g（0.3g）琼脂糖置于锥形瓶中,加入60ml（30ml）1TAE，该上盖子。微波炉加热煮沸，煮沸后转两圈取出摇匀，重复一次，至琼脂糖全部融化，摇匀。用水冷却锥形瓶至50-60，加入6ul（3ul）EB，摇匀，倒入内槽玻璃板
8、上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，若有气泡需赶走气泡，插好梳子，室温下静置直至凝胶完全凝固（20min左右）。2. 垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。从负极（黑色）处添加 1TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。3. 加样: 用10 ul微量移液器在第一孔添加5ul Marker；取样品3ul，与2ul Loading buffer在点样板或PE手套上混合，用分别将样品加入凝胶槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压120V，时间20min，
9、n=1-1。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。5. 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出荧光条带，凝胶成像系统拍照保存。三、普通PCR扩增（一）耐药基因的特异性引物如表1如示（由北京奥科公司合成）表1耐药基因的引物序列目标基因引物引物序列（5-3）目标片段大小（bp）参考文献ermBermB-91fGATACCGTTTACGAAATTGG364Chen et al, (2007)ermB-454rGAATCGAGACTTGAGTGTGCermFermB-189fCGACACAGCTTTGGTTGAAC309Chen et al, (2007)ermB-497rGGACCTACC
10、TCATAGACAAGermTermB-52fCATATAAATGAAATTTTGAG369Chen et al, (2007)ermB-420rACGATTTGTAT TAGCAACC（二）耐药基因的PCR扩增反应体系均为25L（表2），表2耐药基因的PCR扩增反应体系组分（L）ermBermFermT2Mix12.5012.5012.50上游引物（10M）0.500.500.5下游引物（10M）0.500.500.5DNA模板1.001.001.00灭菌超纯水10.5010.5010.50（三）各基因的PCR扩增反应条件如表3所示。表3耐药基因的PCR扩增反应程序步骤ermBermFerm
11、T1预变性94，240s94，240s94，240s2变性94，45s94，45s94，30s3复性（退火）58，45s56，45s49，30s4延伸72，45s72，45s72，45s5循环数（24步骤）（次）3535356再延伸72，360s72，360s72，360s7保存4，1h4，1h4，1h四琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物（2%琼脂糖凝胶）（一）试剂和仪器7. EDTA、NaOH、Tris、乙酸8. EB9. 琼脂糖10. 10ul移液枪11. 电泳槽12. 电泳成像系统（二）药液配制1. 50TAE缓冲液（pH8.3）：称取Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g
12、，向烧杯中加800ml的去离子水，充分搅拌溶解；加入57.1mL乙酸，使用去离子水定容至1L，高压灭菌后保存于室温。2. 1TAE缓冲液：例如需要使用200ml的1*TAE，则量4ml的50*TAE，196ml的去离子水，混匀即可。（三）步骤6. 制备2%琼脂糖凝胶（大胶用60ml,小胶用30ml）：称取1.2g（0.6g）琼脂糖置于锥形瓶中，加入60ml（30ml）1TAE，该上盖子。微波炉加热煮沸，煮沸后转两圈取出摇匀，重复一次，至琼脂糖全部融化，摇匀。用水冷却锥形瓶至50-60，加入6ul（3ul）EB，摇匀，倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，若有气泡需赶
13、走气泡，插好梳子，室温下静置直至凝胶完全凝固（20min左右）。7. 垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。从负极（黑色）处添加 1TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。8. 加样: 用10 ul微量移液器在第一孔添加5ul Marker；取样品5ul用分别将样品加入凝胶槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。9. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压120V，时间20min，n=1-1。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。10. 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出荧光条带，采用凝胶成像系
14、统拍照保存。11. 若有目的条带则将PCR产物（剩余PCR产物20ul左右，上游引物10ul或上下游引物各10ul）送至北京奥科公司进行测序，根据测得的序列在NCBI上进行同源性比对，同源性应大于98%，判断是否为目的耐药基因。五胶回收（一）试剂和仪器：1.乙醇(96%-100%)3.离心机5.水浴锅8.移液枪；灭菌枪头9.1.5ml灭菌离心管、2ml灭菌离心管 （二）提取步骤（OMEGA试剂盒 E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit）： 提取前准备工作：A.按说明书的比例用乙醇稀释SPW Wash Buffer；B.调节水浴的温度为50-55；C.65预热的Elution
15、 Buffer。1. （普通PCR反映体系为25ul，需要两管，共50ul，插大梳子，用1.52的胶，将两管全打入一个孔）琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，推荐使用新鲜的TAE/ TBE Buffer和新配制的胶。2. 片段完全分离后，在紫外灯下迅速切取所需条带，DNA在紫外灯下爆光时间不超过30s，。 3. 切取下来的胶放入1.5ml的离心管，按照每1g凝胶加入1ml Binding Buffer（XP2）对应量，即胶与XP2以1:1体积混合（一般将凝胶全部淹没即可)，50-55水浴至凝胶完全溶解（约7min）。每隔2-3mi n翻转一次。注意: 当pH8，DNA会明显降解。当Binding Buffer完全溶解凝胶后,请注意溶液颜色的变化。如果溶液颜色已经变成紫色或红色，必须加入5ul 5M NaAc, pH5.2至溶
