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1、梅毒血清学实验室诊断,四川省人民医院皮肤病性病研究所中心实验室 王有为 2013年9月 成都,“性病”概念的演化,性病：是指通过性接触而发生传播的一组传染病。 20世纪70年代以前经典性病（venereal diseases,VD） 包括：梅毒、淋病、软下疳等 1975年，WHO性传播疾病（sexually transmitted diseases,STD） 20世纪90年代以后性传播感染（sexually transmitted infections,STI），包括：艾滋病、梅毒、淋病、CA、GH等。,历史的回顾,性病是一个历史悠久的疾病，多数认为梅毒是1505年由印度传入我国广东岭南。 梅
2、毒是一个曾经广泛流行的性病，解放初期，估计的性病（主要是梅毒）患者约为1000万。 1954年之后，全国逐渐形成了一个“四级”皮肤性病防治体系。 1964年，实现了全国梅毒基本消灭的目标。,性病死灰复燃,上世纪70年代末，改革开放后， 性观念的改变 性产业的出现 性生活方式的变化 高危人群规模在不断的增加，如：暗娼、男男性接触者、流动人口等。 性病在我国死灰复燃，再度流行。,现况,严重的公共卫生问题和社会问题； 临床认知水平不够，实验室诊断水平参差不齐； 实验室检测各流程存在不规范现象； 新的实验室诊断技术不断出现而又缺乏了解； 部分（如私人诊所）医疗工作存在过度诊疗或诊疗不规范，延误患者的最
3、佳诊疗时机； 无症状感染者成为维系性病流行的重要的传染源。,如何就目前高发的性病，尤其是对梅毒进行有效监测和控制？ 如何对高危人群及潜在易感人群进行筛查，主动发现无症状的性病感染者？ 如何确定感染的病原体种类？ 需要完善的实验室检测工作，包括检测能力建设和质量控制,性病防治工作的重点 两个系统 疫情监测系统 实验室检测系统-实验室检测能力和质量控制 一个服务 规范化医疗服务,常用梅毒实验室检测方法,病原学检测 血清学检测,梅毒血清学检测分类 （1）非梅毒螺旋体抗原血清学试验 （非特异性梅毒抗体） （2）梅毒螺旋体抗原血清学试验 （特异性梅毒抗体）,非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理,梅毒螺旋体一旦
4、感染人体，在3-4周产生抗类脂质抗原的IgM和IgG的混合抗体（也叫反应素）。 未经治疗的病人，其血清内的反应素可长期存在。经正规治疗后，反应素可以逐渐减少至转阴。,非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理,反应素与心磷脂形成抗原抗体反应，卵磷脂可加强心磷脂的抗原性，胆固醇可增强抗原的敏感性。 心磷脂、卵磷脂及胆固醇都是醇溶性脂类、遇水形成胶体溶液，胆固醇遇水形成结晶。,非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图,非梅毒螺旋体抗原血清学试验方法,包括： （1）快速血浆反应素环状卡片试验（RPR) （2）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST) （3）性病研究实验室试验（VDRL） 所用抗原基本成分是：心磷脂、卵磷
5、脂和胆固醇,VDRL试验抗原组成及特点 抗原组成：0.03%心磷脂、0.21%卵磷脂、0.90%胆固醇 抗原需新鲜配制，不能保存 待检血清需灭活 需要在显微镜下观察结果 目前主要用于脑脊液检查，特异性较高 是诊断神经梅毒的重要依据，但检测阴性不能排除神经梅毒,VDRL试验仪器材料 1、水平旋转仪、显微镜 2、试剂盒：VDRL抗原原液、VDRL缓冲液、抗原滴管及针头、带直径为14mm漆圈的玻璃反应板、VDRL试验结果判读用参照涂片 3、30ml平底玻璃小瓶、生理盐水,VDRL试验标本采集 1、血清：新鲜血清或冻存血清； 2、脑脊液：采用腰穿术获得 一般来说，送检VDRL试验的脑脊液应采集两份，一
6、份作脑脊液常规（白细胞10*106/L、蛋白含量500mg/L）测定，检测结果与另一份用作VDRL试验的脑脊液样本同时送性病实验室,VDRL试验操作步骤 1、VDRL抗原配制； 2、VDRL玻片定性试验 （1）灭活：血清标本56灭活30分钟； （2）吸样：吸取0.05ml血清放入反应板圈中，并涂布于整个圈内； （3）加抗原：用标准针头加入1滴抗原； （4）反应：置水平旋转仪上旋转4min，1805次/min，立即置低倍显微镜下观察。,VDRL试验操作步骤 3、VDRL定量试验 （1）加稀释液：在圈内加入0.05ml生理盐水； （2）样本稀释：吸取0.05ml样本与第一个圈内生理盐水混合，混匀后
7、，吸取0.05ml加至第二个圈，做系列稀释，并将稀释样本涂布于整个圈内 （3）同定性试验的（3）、（4）。,VDRL试验结果判读 凝集反应强度分级： 3+4+：镜下见中等大小或大的絮状物，液体清亮； 2+ ：絮状物较小，液体较清亮； 1+ ：絮状物较小，均匀分布，液体浑浊； ：抗原复合物颗粒稍粗； ：抗原颗粒均匀、细小。 定性试验：镜下可见1+4+的絮状凝集物为阳性，不产生凝集为阴性； 定量试验：镜下可见絮状凝集物的样本最高稀释倍数为其滴度。,VDRL试验临床意义 脑脊液VDRL试验是神经梅毒的标准试验，阳性结果可诊断为神经梅毒，但阴性结果不能排除诊断，存在假阴性。,RPR试验 在VDRL试剂
8、成分的基础上，加入黑色活性碳颗粒，作为凝集的指示物；与待检血清（浆）中的反应素结合，形成肉眼可见的黑色絮状物。 用白色硬纸片代替玻片； 血清不需要灭活； 不需要显微镜观察结果 可作定性和定量试验,TRUST试验 原理和成分以及操作与RPR试验相同 用红色的甲苯胺红替代了活性碳颗粒，在与待检血清（血浆）中的反应素结合，形成肉眼可见的红色絮状物,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),样本类型：血清、血浆、脑脊液 样本保存：短期（1周）内进行检测的可存放于28； 保存一周以上的应置于-20 以下冰箱保存； 长期保存应置于-70 以下冰箱中保存。,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),样本运送： 应按
9、照生物安全要求进行包装和运送。 （1）第一层容器（如试管） （2）第二层容器 （3）第三层容器,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),样本接收： （1）检查标本管有无破损和溢漏； （2）核对标本与送检单； （3）检查标本的状况; （4）如标本不能接收，怎么处理？ （5）样本交接应在接收单上双方签字确认,注意：应把每一份样本当作强阳性样本来处置和对待！,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),仪器：水平旋转仪（要求？） 试剂盒： （1）含有活性碳的抗原悬液； （2）一个标定的9号针头（0.9mm）； （3）压印有10个18mm直径圆圈的封塑环状卡片； （4）内部对照； 为了保证试验结果的可靠性，以
10、及每批试剂间的可比性，应制备外部对照血清 （5）50ul量程移液器和吸头 （6）0.9%无菌生理盐水,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),定性试验 （1）试剂准备：复室温30分钟 （2）加标本：样本量50ul； （3）加抗原：抗原量（601滴/ml，约17ul/滴） （4）反应：反应时间8min （5）读取结果,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),定量试验 抗原1滴 抗原1滴 抗原1滴 抗原1滴 抗原1滴,50ul标本 1:1（全血）,50ul标本 50ulN.S 1:2,50ulN.S 1:4,50ulN.S 1:8,50ulN.S 1:16,吸取50ul,吸取50ul,吸取50ul,弃
11、掉50ul,标本稀释顺序,涂布顺序,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),结果判读 判读凝集反应强度分级： 3+ - 4+：圆圈内出现中到大的黑色絮状物，液体清亮； 2+ ：圆圈内出现小到中的黑色絮状物，液体较清亮； 1+ ：圆圈内出现小的黑色絮状物，液体浑浊； - ：圆圈内仅见碳颗粒集于中央一点或均匀分散。,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),结果报告 （1）定性试验： 出现1+-4+强度的凝集反应报告阳性（+） 不产生凝集反应报告阴性（-） （2）定量试验： 出现凝集反应的血清最高稀释倍数为抗体滴度，结果报告滴度为1：X。 也可将每个稀释度的反应强度依次报告，如1:1（全血）（4+）、1
12、:2（3+）、1:4（2+）、1:8（1+）、1:16（-）。有利于疗效观察,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),质量控制 （1）内部对照： 试剂盒含有的阳性质控血清，用于检查该盒试剂的有效性。 新开试剂，以及每天工作开始前或每批试验开始前，应常规进行内部对照质控。 （2）外部对照： 可采取自留阳性标本用作外部对照。 新开试剂或更换试剂批次，应同时进行外部对照试验，用于检查每批试验结果的重复性和可比性。,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),质量控制 （3）移液器质量控制：强检和定期校准； （4）旋转仪质量控制：检查转速； （5）人员的质量控制：有经验人员的指导下开展工作、双人核对结果； （
13、6）操作的质量控制：反复操作、正确操作。,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),临床意义 （1）产生的抗类脂质抗体，未经治疗可长期存在； （2）经适当治疗后，抗体可以逐渐减少至转为阴性； （3）定性试验结果可用于现症梅毒诊断； （4）定量试验结果可用于疗效观察及判愈。,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),梅毒血清反应假阳性 即非梅毒患者的梅毒血清反应呈阳性的现象。 （1）技术性假阳性反应 由于标本保存不当（如细菌污染或溶血）、试剂质量差或过期、或试验操作错误等所造成。 （2）生物学假阳性反应 非梅毒螺旋体抗原血清学试验采用的抗原为脂类混合物，所检测的抗心磷脂抗体亦可见于其他多种疾病，如自身免
14、疫性疾病、怀孕的妇女，麻风病人。,王千秋教授等检测了10546份血清样本，RPR假阳性率为0.21%（15/7002）。 假阳性中： 10例为有高危性行为的常规检查者 2例孕妇 皮肌炎、尖锐湿疣、龟头破溃各1例,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),梅毒血清反应假阳性的处理 （1）技术性假阳性反应：实验前检查试剂的有效性、重复操作排除人为操作错误等； （2）生物学假阳性反应：应做TPPA(TPHA)等试验进行排除,单一RPR（非特异性抗体血清试验）结果阳性，不能作为梅毒的确定型诊断试验结果，需用梅毒螺旋体抗原血清试验进行确证。,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),前带现象 指非梅毒螺旋体抗原
15、血清学试验中，有时血清中存在高浓度的反应素导致抗原抗体浓度不匹配，出现弱阳性、不典型或阴性反应的结果，而临床上又像早期梅毒（一期和二期），此时将血清稀释后再进行试验，可出现阳性结果的现象。,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),血清固定 指经抗梅毒治疗后，非梅毒螺旋体抗原血清试验在一定时期内不阴转。 早期的血清固定常与治疗不足或不规则治疗、复发、再感染或有神经系统梅毒等因素有关。 病期不明的潜伏梅毒患者血清固定发生率显著增高，应加强对潜伏梅毒的筛查和及时治疗。,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),RPR用于脑脊液的检测，近年来也有不少研究。 有作者在对154例各期梅毒患者及90例非梅毒神经系
16、统疾病患者的脑脊液进行试验并作统计分析： RPR脑脊液敏感性为99.1%、特异性为77.8% VDRL脑脊液敏感性为98.6%、特异性为70.4 结论：RPR可以代替VDRL用于神经梅毒的诊断。 但是？,快速血浆反应素环状卡片试验（RPR),注意事项 1、使用无菌生理盐水；标本无严重脂血、溶血和细菌污染 2、正确操作，移液器吸头保证在血清/血浆液面以下但不能接触反应纸板；防止产生气泡； 3、每批次标本数量不宜过多，防止干燥或血清水分挥发， 4、实验前应检查水平旋转仪转速，常规进行质量控制； 5、稀释后摊开液面是顺序应从低浓度向高浓度进行； 6、反应完毕应及时观察结果。,梅毒螺旋体抗原血清学试验,试验原理： 以梅毒螺旋体特异蛋白为抗原，检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。 感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者几乎终生阳性。,梅毒螺旋体抗原血
