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1、镇镇 江江 高高 专专 ZHENJIANG GAOZHUAN 毕毕 业业 设设 计计 (论论 文文) HPLC 法测定非诺贝特含量的方法学考察 HPLC method for determining the content of fenofibrate methodology 系 名： 化工系 专业班级： 学生姓名： 学 号： 指导教师姓名： 徐 兵 指导教师职称： 讲 师 2010 年 5 月 2 目 录 第一章 立题简介 5 1.1 非诺贝特简介.5 1.2 HPLC 法简介 6 第二章 实验部分 7 2.1 检测波长选择.7 2.2 流动相选择.7 2.3 实验仪器及色谱条件10 2.3
2、 方法学考察10 2.3.1 线性与范围10 2.3.2 进样精密度13 2.3.3 溶液稳定性16 2.3.4 准确度18 2.3.5 重复性试验19 2.3.6 中间精密度试验21 2.3.7 样品含量测定24 第三章 结果与讨论.26 致 谢.27 参考文献.28 3 HPLCHPLC 法测定非诺贝特含量的方法学考察法测定非诺贝特含量的方法学考察 专业班级： 学生姓名： 指导教师： 徐 兵 职称： 讲师 摘要摘要 目的：根据中国药典 2010 版采用 HPLC 法对非诺贝特进行方法学考察6；方法：采 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱 ，流动相为甲醇-水（81：19） ，检测波长为 2
3、86nm，流速为 1.0ml/min，进样体积：20l。结果：非诺贝特在 2.75024.750g/ ml 范围内线性关系良好（r=0.9999） ；本法精密度良好，符合测试要求；本品的流动相溶 液在室温条件下放置，8 小时内的稳定性较好，符合测定要求 ；结论：该法快速，准确， 重现性好，可以用于非诺贝特含量测定。 关键词：非诺贝特，HPLC 法，含量，方法学考察 HPLC method for determining the content of fenofibrate methodology Objective according to Chinese pharmacopoeia 2010
4、 version of using HPLC fenofibrate on methodology; Methods: using Silica column for the filling agent, mobile phase chromatographic column for methanol-water (81:19), for 286nm detected wavelength, velocity of 1.0 ml/min, volume: 20l, L. Results: fenofibrate 2.75024.750g/ ml, G/m range inside (r = 0
5、.9999), This test requirements, with good precision, This product of mobile phase solution at room temperature, 8 hours with good stability, determination of requirements, Conclusion: the method is rapid, accurate, reproducible and can be used for fenofibrate content determination. Keywords fenofibr
6、ate, HPLC, content and methods 4 引 言 随着人们生活水平的提高,血脂异常的病例近年有明显的上升趋势。高脂血症是公认 的高血压、冠心病和脑血管意外的主要危险因素，同时它又与许多疾病相关。因此，纠 正脂代谢紊乱，对改善冠心病、高血压及相关疾病的症状，降低脑血管意外的发生具有 十分重要的意义。而非诺贝特是临床常用的调血脂药物,其主要作用是可显著降低血清甘 油三酯(TG)、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)水平以及升高高密度脂蛋白胆 固醇(HDL)水平1。 5 第一章第一章 立题简介立题简介 1.1 非诺贝特简介 非诺贝特（C20H21ClO4）是临床常用
7、的调血脂药物,其主要作用是可显著降低血清甘油 三酯(TG)、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)水平以及升高高密度脂蛋白胆固 醇(HDL)水平。其作用机制主要是通过激活脂蛋白酶，促进富含 TG 的乳糜微粒和极低密 度脂蛋白(VLDL)的分解，并且还可抑制肝脏合成和分泌富含 TG 的 VLDL，从而降低血浆中 TG 的水平；还可通过减少羟甲基戊二酰辅酶 A(HMG-CoA)还原酶前体的合成而抑制 HMG- CoA 的作用，从而减少 TC 在肝脏的合成，并增加 LDL 受体的数量，加速 LDL 由血液转入 肝细胞，使血清 TC 和 LDL 水平下降，是首选的降 TG 药物。临床上主要用于
8、治疗高胆固 醇血症，高甘油三酯血症及混合型血症2。 目前,以 TG 升高为主的高脂血症治疗药物有苯氧芳酸类、烟酸及鱼油等,其中以苯 氧芳酸类疗效为佳。苯氧芳酸类中又首推非诺贝特降 TG 最有效,且非诺贝特对羟甲基戊 二酰辅酶 A(HMG-coA)还原酶有一定程度抑制作用3。因此,非诺贝特能够降低 TC,TG,LDL-C,sLDL,apoB 及升高 HDL-C 血浆水平,多方面对脂质代谢紊乱起调脂作用。 然而,非诺贝特属难溶性药物,口服吸收较差。近年来发展的微粒化非诺贝特剂型, 因药粉粒度减小, 其微粒直径均在 50m 以下,而极大增加了药物和胃肠道的接触面积, 与普通剂型相比, 其优点为口服吸
9、收好, 生物利用度高, 能保持较恒定的血药浓度，在 临床使用时较小剂量即可达到与普通剂型相同的效果4。 6 1.2 HPLC 法简介 高效液相色谱（high performance liquid chromatography , 简称 HPLC）是 20 世 纪 70 年代迅速发展起来的一种高效、快速的新型分析分离技术,是目前应用最多的色谱 分析方法.高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记 录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。 HPLC 的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相 粘度远远高于
10、气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气 相色谱柱。HPLC 是以液体溶剂作为流动相的色谱技术, 它是结合经典液相色谱法及气相 色谱法的分析分离原理, 进一步发展并迅速成长的新型液相色谱法。该法具有高压、高 速、高效、高灵敏性等优点7。而且与气相色谱法相比, 只要求试剂能制成溶液, 而不 需要气化, 因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热不稳定性差、相对分子质量大 的有机物, 原则上都可用高效液相色谱法来进行分离、分析8。HPLC 因其独特的优点已 经广泛应用于药物的含量测定、组成分析、质量控制等方面, 已成为天然药物有效成分 分离、分析最重要的方法之一12。 现在
11、HPLC 经历近 40 年的发展，色谱工作者可对任何类型的分离提供适用的色谱柱 及相应的分离条件，并可在短的时间内，利用计算机提供的软件计算程序，获得可包含 40 个组分的优化完全分离。现在除低沸点化合物使用 GC 分析外，其他样品都可用 HPLC 进行分析。但随着质谱分析技术的快速发展，可以预见质谱分析将在当代发展成为继色 谱分析之后的，一种通用的分离和分析方法。 HPLC 由于具有高选择性、高灵敏度, 并可同时用于有关物质检查与含量测定的特点, 已成为医药研究的有力工具15。如在中草药有效成分的分离和纯度测定、人工合成药 物成分的定性和定量测定、新型高效手性药物中手性对映体含量的测定以及药
12、物代谢物 的测定等方面 , 都需要用到 HPLC 的不同测定方法予以解决。 7 第二章第二章 实验部分实验部分 2.1 检测波长选择 精密称取非诺贝特 50mg，置 100ml 量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密 量取续滤液 2ml，置另一 100ml 量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，照紫外分光光度法 （中国药典 2010 年版二部附录 IVA）,测得非诺贝特的无水乙醇溶液在 286nm 附近有最大 吸收，见图 1，故选择 286nm 为含量测定的检测波长。 200220240260280300320340360380400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.
13、7 0.8 0.9 1.0 波长（nm） 吸光度 图 1 非诺贝特的吸光度与波长关系 Figure 1 Fenofibrate enhances the absorbency and wavelength 2.2 流动相选择 在实验过程中，根据其本身性质及参考相关文献，选择甲醇-水、乙腈水为流动相 组成，进行试验，优化流动相，经过对各组份比例的考察，具体见表 1、图 24，最终 确定本品的流动相为甲醇-水，分离效果好，保留时间合适。 8 表 1 非诺贝特流动相的选择 Table 1 fenofibrate flow of the select 编号流动相的选择结 论 A 甲醇-水（85：15）
14、 分离效果差，杂峰与主峰未完全分开 B 甲醇-水（81：19） 分离效果好，分离度合格 C 乙腈-水（80：20） 分离效果较好，分离度合格，但对小杂峰的分离不如甲醇系统 图 2 流动相 甲醇-水（85:15） Figure 2 mobile phase fisher chem alert guide（85:15） 9 图 3 流动相 甲醇-水（81:19） Figure 3 mobile phase fisher chem alert guide（81:19） 图 4 流动相 乙腈-水（80:20） Figure 4 mobile phase anhydrous acetonitrile（8
15、0:20） 10 2.32.3 实验仪器及色谱条件 仪器： 泵： 岛津LC-10ADvp 高效液相色谱仪 检测器：岛津SPD-10AVvp 紫外检测器 工作站：N2000 色谱数据工作站 色谱条件 ： 流动相：甲醇-水（81：19） 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 检测波长：286nm 流速：1.0ml/min 进样体积：20l 2.32.3 方法学考察 2.3.1 线性与范围 取经 50减压干燥至恒重的非诺贝特对照品 50mg，精密称定，置 100ml 量瓶中,用 无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀，作为储备液。分别精密吸取储备液 1、1.5、4、5、8ml 置 200ml 量瓶中,用无水
16、乙醇稀释至刻度，摇匀。依色谱条件，分别 精密量取 20l，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度 C（g/ml）为横坐标，峰面积 A 为纵坐标，进行线性回归，并计算回归方程和相关系数 。结果见表 2，色谱图见图 510。 11 表 2 线性相关性实验结果 Table 2 relevant results of the linear 序 号12345 浓度(g/ml)2.7505.50012.37515.09724.750 峰面积1189962371385349096536581064235 回归方程A=43010X+1612 R=0.9999 (n=5) 线性范围2.75024.750g/ml 024681012141618202224 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 1000
