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1、发光的大肠杆菌,朱静宇 张明 石卉,制备感受态细胞,质粒扩增,质粒酶切,目的基因序列扩增,连接,转化,实验方案概述,材料,大肠杆菌 少量PET 28质粒（既为原核质粒又为真核质粒） 显示绿色荧光的PEGFP-N3质粒（为真核质粒）,制备大肠杆菌感受态细胞,挑取E.coil单菌落接种至2mlSOC 培养液，37摇床过夜。 挑取0.51ml过夜培养的菌液转种到50ml SOB 中，18剧烈震荡，直至A600达到0.6，取出水浴10min 4 4000rpm/min 10min.同时冰浴配置TB溶液。 弃上清，倒置离心管于滤纸上 1mlTB溶液打散菌体沉淀，再加入15mlTB 溶液冰浴10-15mi
2、n。4 4000rpm/min 10min 去上清，沉淀重悬于4mlTB中，冰浴10min 加入280uL DMSO,混合均匀，冰浴10min 分装于EP管中，-80或液氮保存 检测感受态细胞的质量（阴性对照）,质粒扩增,pet28的质粒扩增,PEGFP-N3质粒扩增,摇菌,转化,提质粒,转化,取100ul感受态细胞于冰浴上融化 加入1ul pet28质粒和1ul PEGFP-N3质粒，轻轻吹匀，冰浴30min 将菌液放入42C水浴热激90s，立即放入冰浴中2min 将菌液2000rmp/min离心3min，留200ul上清液将菌体打散，均匀涂布于含卡那抗性的琼脂平板，平板于37C倒置培养过夜
3、。 同时进行阳性和阴性对照,摇菌+提质粒,将培养过夜的平板取出，用已灭菌的枪尖挑取平板上单个的较大的菌落 将移液枪尖打入5ml培养基内，放入37C摇床中 rpm/min,摇菌16小时左右 运用Omega等品牌的试剂盒对菌液进行小提 用浓度为1%的胶，120V 20min，用10000的marker做对照验证 测浓度,质粒的酶切,寻找pet28和pegfp-n3的酶切位点,质粒的酶切（两个质粒同时酶切）,确定的酶切位点：EcorR I、Xba I,内切酶：Not I、BamH I内切酶 Buffer：cutsmart,37 温育 4hours,未酶切的质粒作对照，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果,纯化
4、,01,02,03,04,05,06,设计引物,PEGFP-N3 目的基因扩增,PCR,电泳,胶回收,纯化,测序,PEGFP-N3目的基因EGF的PCR引物,PEGFPN5 5TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG3 PEGFPN3 5GTCGCCGTCCAGCTCGACCA3,Primer 2 Tm 68.5 C Molecular weight 6863.5 g/mol Extinction coeficient 181100.0 l/(molcm),Primer #1 Tm 57.6 C Molecular weight 6863.5 g/mol Extinction coeficient 229700.0 l/(molcm)SXJ,PCR 体系,premix体系,Taka Ra Taq dNTP mixture PCR buffer,PCR反应条件,循环35次,02,01,03,加入样品与buffer,混匀，短暂离心,孵育 22 3h,连接,01,02,03,04,05,质粒的转化,感受态细胞冰浴融化,加入质粒，混匀，冰浴,菌液热激90s后冰浴2min,加SOD，37摇菌,2000rpm/min 3min 涂布,涂布后，适当培养，挑取单克隆大肠杆菌菌落，进行检验。,挑菌落,镜检,在荧光显微镜下可看见发绿色荧光的大肠杆菌即为实验成功。,
