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1、植物组织培养实验基本步骤一、母液的配置1、MS大量元素母液的配制 将大量元素配制成10倍的母液，使用时再稀释10倍。按照配方表中用量依次分别称取扩大10倍的：NH4NO3 8.250g 、KNO3 9.500g 、KH2PO4 0.850g 、 MgSO47H2O 1.850g 、CaCl22H2O 2.20g，所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，最后定容至500ml，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。2、MS微量元素母液的配制 将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别依次称
2、取：MnSO4 4H2O 1.1150g 、ZnSO47H2O 0.4300g 、 H3BO3 0.3100g 、KI 0.0415g 、CuSO45H2O 0.00125g、 CoCl26H2O 0.00125g，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至500ml，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。3、MS铁盐母液配制 将铁盐配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：称 FeSO47H2O 1.390g和Na2EDTA 1.865g，把FeSO47H2O和 Na2EDTA2
3、H2O分别置于200ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解（磁力搅拌器，边加热，边搅拌）。保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后加蒸馏水到最终容积500ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡12min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4冰箱中保存备用。4、MS有机化合物母液的配制 将有机化合物配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：肌醇 5.000g 、维生素B1 0.025g 、烟酸 0.025g 、甘氨酸 0.100g 、维生
4、素B6 0.005g 、蔗糖 15.000g ，用蒸馏水依次溶解并定容至500ml后，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。二、植物激素的配置常见激素：二氯苯氧乙酸（2，4D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚3丁酸（IBA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、6苄氨基嘌呤（6BA）、赤霉素（GA3）、1、生长素类： （1）、生长素类在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织（2）、常见生长素：二氯苯氧乙酸（2，4D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚3丁酸（IBA）。NAA、IAA、IBA被广
5、泛用于生根，2，4D有利于愈伤组织的诱导和生长。IAA容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时间不要太久。 （3）、溶解方法：称25mg吲哚乙酸（IAA），用少量1mol/L NaOH或95酒精预溶解，再加蒸馏水定容至25ml，摇匀。 （4）、保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存2、细胞分裂素 组织培养中，细胞分裂素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。 （1）、常用的细胞分裂素有： 6苄氨基嘌呤（6BA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（TDZ ） （2）、溶解方法：称25
6、mg 6苄氨基嘌呤（6BA），用少量（1ml）1mol/L HCL预溶解，再加蒸馏水定容25ml，摇匀。（3）、保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存3、赤霉素（GA3） （1）、溶解方法：用少量95酒精预溶解，再加蒸馏水定容。 （2）、保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存 （3）、赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解 （4）、灭菌：高温易分解，要过滤灭菌4、脱落酸 （1）、溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。 （2）、保存：具有热稳定性，但容易发生光解。配成一定浓度后，冰箱冷藏保存三、培养基的制备与灭菌（一）、培养基的制备1、将所需的各种母液和植物激素按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等
7、放在指定位置。2、取烧杯一个内盛200ml蒸馏水，按照培养基配方所需量依次取母液加入烧杯，搅拌，按相应培养基称量蔗糖和琼脂，并添加到烧杯中，在电炉上加热待琼脂完全融化后加蒸馏水定容至所需体积。3、充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为5.6-5.8（可将其调为6.0），趁热把培养基分装到广口瓶中，封好瓶口，待灭菌。（二）、培养基的灭菌灭菌温度及灭菌时间：121（1.06kg/cm2）下灭菌20分钟。（如是实验所用菌材灭菌，如无菌水及器械，则是121（1.06kg/cm2）下灭菌30分钟），此时可将需要灭菌的实验仪器一起灭菌。1、检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少
8、时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。2、盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。3、灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。4、在培养基凝固之前加入一定量的植物激素后密封瓶口，放置在水平桌面上自然冷却。四、无菌操作技术和接种1、接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种房间紫外灯，照射约30min，然后关闭紫外灯。打开房间换气扇及微开超净工作台的玻璃挡板，通风20min后，即可进行无菌操作
9、。（此步由专人统一负责）2、接种室灭菌过程中同时对外植体进行表面灭菌。先将接种材料在流动的自来水下涮洗干净，吸干水份后切成大约70mm长的片段放进500ml烧杯中，用蒸馏水冲洗2次，倒掉蒸馏水后倒入0.1%的升汞水消毒，将材料淹没浸泡约10分钟（期间用镊子搅拌几次）。3、把在消毒液中的接种材料转移到超净工作台上。用无菌镊子将已完成灭菌的接种材料转移到烧杯中，用无菌水清洗3次，每次不少于1分钟，洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒液。最后一次清洗后转移到无菌托碟上，将接种材料切成一定大小（花托0.5cm2、茎段0.5-1cm）。4、取下培养瓶的盖子用火烧灼瓶口。用镊子将外植体轻轻插入到琼脂上，立即
10、盖上盖子。5、操作完后将镊子等器械浸入75%酒精中。操作器械需要在每次使用前消毒一次。方法是将浸于酒精中的器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。6、将培养瓶放到培养箱里，在要求温度下培养，观察记录五、所需实验仪器及额外药品电子分析天平、PH测试仪器、电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、药匙、玻璃棒、胶头滴管、移液枪、烧杯、培养瓶、棕色瓶、吸水纸、标签、记号笔、剪刀、镊子、三角瓶、培养皿、蓝盖瓶、细菌过滤器（0.2um微孔过滤膜）、量筒100ml、吸管、无菌水、0.1%升汞或次氯酸钠溶液、70%75%的酒精。注：植物激素灭菌可高压灭菌：IBA，NAA ，6-BA，2,4-D不可高压灭菌： IAA，GA3比较文学是一种以寻求人类文学共通规律和民族特色为宗旨的文学研究。它是以世界文学的眼光，运用比较的方法，对各种文学关系进行的跨文化的研究。一个国家或民族的文学思潮、文学运动队另一个国家或民族文学发展的影响,不同国家具体作家的相互影响
