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1、1丙泊酚对内毒素血症大鼠肾损伤的保护作用及机制研究The Protective effects and mechanisms of propofol in endotoxemia induced acute rat kidney injury崔文瑶 王俊科中国医科大学附属一院麻醉科2丙泊酚对内毒素血症大鼠肾损伤的保护作用及机制研究目 的内毒素血症常见于严重创伤、烧伤、休克、重症感染等应激状态下，来自于感染部位的LPS大量进入体内，并引起炎症介质的大量合成、释放，使包括肾脏在内的多器官受累，在急性损伤的发生、发展中起着不可忽视的作用。肾脏又是代谢产物及毒素排泄的主要途径，LPS亦可经肾小管重吸收
2、后，使肾小管上皮细胞处在高浓度LPS微环境中，可能对肾小管上皮细胞结构和功能产生重要的影响，在AKI的发生、发展中起着一定的作用 1。急性肾损伤所致的急性肾功能衰竭的特征性改变就是肾小球滤过率下降及肾小管功能障碍，完善的尿液浓缩与钠离子重吸收的肾小管功能依赖于水通道蛋白的参与及功能性表达。AQPs（水通道蛋白）分布广泛，脑、肺、肾等脏器组织均有不同亚型分布，对水和甘油等小分子物质代谢有重要的调节作用，是保持内环境稳定的重要物质，也受多种因素影响其结构和功能，从而改变对水的通透性，影响器官水和小分子物质的代谢，同时也是导致细胞凋亡的关键因素。1992年Preston等发现肾脏AQP，这一发现合理
3、地解释了肾脏自由水代谢的问题。肾脏是水代谢的主要器官，AQPs在肾脏中的研究对揭示肾脏的病理生理改变具有重要作用 2。近期有报道药物、缺血等引起的肾功能衰竭中AQP2表达明显下调，AQP2的这一变化与肾集合管上皮细胞损伤程度密切相关，恢复早于形态学改变 3、4 。已证明AQP2是集合管上皮细胞上最重要，且是惟3一受AVP 调节的水通道蛋白。分布在细胞顶质膜及细胞内小泡。AVP 对AQP2的调节有2种方式：（1）短期调节作用，AQP2氨基酸序列中从253-256 位含蛋白激酶A（PKA）磷酸化部位，AVP 与V2R 结合后激活AC-cAMP-PKA 信号传导途径，导致AQP2磷酸化，是含AQP2
4、的细胞内小泡向细胞顶质膜转移并与之熔接，从而使细胞膜对水的渗透性迅速增加，这种调节作用可在数分钟内发生 5、6 。（2）长期调节作用：V2R 稳定激活可导致AQP2合成增加，AVP 是通过V2RcAMP-PKA 信号传递途经致细胞核内cAMP 结合转录因子磷酸化及cjun / cFos 基因表达，影响AQP2mRNA 转录及AQP2蛋白合成，从而上调AQP2的总丰度，因而改变肾脏集合管对水的渗透性，AQP2mRNA的变化可在几个小时内出现 7、8、9 。近年研究发现AQPs可以改善一些病理过程中脏器如肺、脑、肾的水及小分子物质的代谢，减少这些相应脏器的水肿和损伤，水通道蛋白介导的细胞移行对急性
5、肾损伤肾小管功能的恢复和重建很重要，与预防和治疗这些重要脏器损伤关系密切 10，研究其在这些病理过程中功能和结构的变化有助于指导用药。早期发现和治疗肾功能异常不仅对于纠正休克具有作用，对于内脏器官保护具有更加重要的意义。水通道蛋白可以受多种因素影响，但是对其有调节作用的药物并不多，其阻断剂也多为重金属物质，本身就对生物体有损伤，少数药物如糖皮质激素据报道有一定的水通道蛋白调节作用。目前研究表明麻醉药如异氟烷、七氟烷、利多卡因和丙泊酚等对心、脑、4肺和肾等脏器的不同损伤具有保护作用，丙泊酚作为一种静脉麻醉药具有镇静催眠作用，广泛应用于临床，有报道在内毒素血症肺损伤时丙泊酚可以通过调节AQP1起到
6、保护作用 12，但对大鼠内毒素血症肾损伤是否通过调节AQPs起到保护作用尚未见报道。本实验根据文献并模拟病人内毒素血症观察所见建立大鼠内毒素血症模型 13、14 ，12 小时后行功能检查并留取肾脏标本，病理检查肾脏损伤情况以及观察肾脏超微结构的改变 15，应用 RT-PCR 技术、Western 印迹杂交技术、免疫组织化学染色技术等检测 AQP2 基因 mRNA 和 AQP2 蛋白、TNF-、ICAM-1、Bcl2、Bax、Caspase3 蛋白等在大鼠内毒素血症肾损伤过程中表达的变化，细胞凋亡程度；同时观察在大鼠内毒素血症肾损伤过程中应用公认的具有抗炎抗氧化作用的静脉麻醉药丙泊酚 16、17
7、 ，采用预处理，同时给药和后处理的不同时间给药方式，观察其在大鼠内毒素血症肾损伤过程中对肾脏功能和 AQP2 基因 mRNA、AQP2 蛋白、ICAM-1、Bcl2、Bax、Caspase3 和细胞凋亡程度的影响，从分子生物学角度观察和探讨不同丙泊酚给药时间对大鼠内毒素血症肾损伤的作用，为指导临床用药提供实验依据。本实验包括三部分：1、内毒素血症大鼠肾脏 AQP2 基因表达及结构功能变化；2、丙泊酚对大鼠内毒素血症肾组织 AQP2 基因表达及结构功能的影响；3、丙泊酚对内毒素血症大鼠肾脏细胞凋亡的影响。实验材料1 实验动物选取 48 只 Wistar 大鼠（体重在 200g300g 之间） ，
8、5由沈阳军区总院实验动物中心提供。2 实验试剂 aquaporin 2 一抗：兔抗鼠 aquaporin 2，试剂盒(武汉博士德公司)；二抗：羊抗兔 IgG，试剂盒(美国西格玛公司)；丙泊酚（ASTRA ZENECA）； Bcl-2/Bax 兔抗鼠多克隆抗体（即用型）（santa，美国）；caspase-3 兔抗鼠多克隆抗体（Neomarker，美国）；Histostain TM Plus Kits S-P 9000 免疫组化染色试剂盒、ZLI-9108 浓缩型 DAB 试剂盒（北京中杉生物公司） ；Trizol（Invitrogen，美国）；One step RT-PCR 试剂盒（大连宝生物
9、公司）；聚偏二氟乙烯(PVDF）蛋白印迹膜（Bio-Rad，美国）；PBS 等其它试剂为国产分析纯。3 主要实验仪器（1） 振荡水浴箱（GFL THERMOLAB，美国）（2） 超低温冰箱（SANYO MDF-U，日本）（3） 旋涡振荡器（VORTEX-2 GENE，美国）（4） 水平板电泳系统（BIO-RAD Sub-cell GT，美国）（5） 通用电泳仪（BIO-RAD PowerPac200，美国）（6） 台式低温高速冷冻离心机（Sigma 3K30，美国）（7） 显微图像分析系统（Olympus AX70/Coolsnapfx/MetaMorph，日本）（8） 电热恒温鼓风干燥箱（余
10、姚 TDW，中国）（9） 自动电泳凝胶成像分析仪（Alphainnotech ChemiImager 5500，美国）6（10） 小型垂直电泳仪（Bio-Rad Mini-Protein ，美国）（11） 半干转印仪（Bio-Rad Seimidry transfer system，美国）（12） 自动封膜仪（江苏仪器设备公司，中国）（13） HEIDOLPH DIAX900 型匀浆机（德国）（14） PTC-100 型 PCR 扩增仪（美国）（15） GLS-700D 型数码凝胶扫描分析系统（上海，中国）（16） A-200 Ds 电子天平（美国）（17） B-Brown 微量泵（德国）（1
11、8） 超纯水装置（MILLIPORE MILLI-Q，美国）（19） 实验室制冰机（ZIGERA 2BE-70-35，德国）（20） 小型台式离心机（SIGMA 1-13，美国）（21） PH 计（WTW InoLab，德国）（22） 电动高压消毒锅（HIRAYAMA HVE-50，美国）（23） HSS-1 数字超级恒温浴槽（成都仪器厂，中国）实验方法1 建立模型：Wistar 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)进行麻醉诱导及维持，LPS5mg/kg 静脉注射建立大鼠内毒素血症模型，按照7各组要求给予相应药物静脉注射（丙泊酚：持续 4 小时静脉输注30mgkg-1h-1）后分别置入各自代谢笼中，以分别收集尿液，正常取食水，12 小时后收集尿液和采取血液行功能检查及提取肾脏标本。
