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1、血血洁白蛋白的白蛋白的分分别、纯化与化与鉴定定血洁白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，约占总血洁白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，约占总量的量的60。它是一种水溶性很强的蛋白，构造稳定，能结合多它是一种水溶性很强的蛋白，构造稳定，能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血液的正常浸透压作用。血液的正常浸透压作用。此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临床及生物领域运用广泛床及生物领域运用广泛 。实验目的目的
2、1.1.掌握血液掌握血液掌握血液掌握血液样样品的正确品的正确品的正确品的正确处处置和制置和制置和制置和制备备方法方法方法方法2.2.掌握血掌握血掌握血掌握血洁洁白蛋白粗分白蛋白粗分白蛋白粗分白蛋白粗分别别的普通方法的普通方法的普通方法的普通方法3.3.掌握离子交掌握离子交掌握离子交掌握离子交换换法分法分法分法分别纯别纯化蛋白化蛋白化蛋白化蛋白质质4.4.掌握蛋白掌握蛋白掌握蛋白掌握蛋白质纯质纯度度度度检测检测的方法的方法的方法的方法5.5.掌握掌握掌握掌握SDS-SDS-SDS-SDS-聚丙聚丙聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶胺凝胶胺凝胶电电泳泳泳泳测测定蛋白定蛋白定蛋白定蛋白质质分子量分子量分子
3、量分子量的原理和方法的原理和方法的原理和方法的原理和方法6.6.学会考学会考学会考学会考马马斯亮斯亮斯亮斯亮蓝蓝法法法法测测定蛋白定蛋白定蛋白定蛋白质质含量含量含量含量原理与操作原理与操作血清的制备血清的制备 白蛋白的分别白蛋白的分别 白蛋白的纯化白蛋白的纯化 蛋白质含量的蛋白质含量的测定测定白蛋白纯度的白蛋白纯度的检测检测 白蛋白的相对分白蛋白的相对分子质量的测定子质量的测定留样：留样：2 2，3 3留留样：4,4,留样：留样：1 1一、血一、血洁白蛋白的分白蛋白的分别1 1 采血采血 2 2 血清分血清分别别 3 3 盐盐析法分析法分别别血血洁洁白蛋白白蛋白4 4 除除盐盐搜集血清：搜集血
4、清： 取取2 mL血液，血液，4 ，3,000 rpm离心离心15 min，用移液，用移液枪汲取上清血清汲取上清血清1 mL至至10 mL离心管；留离心管；留0.1mL样1至至1.5 mL离心管，用于离心管，用于测定蛋白定蛋白质含量和含量和电泳泳.盐析：中性析：中性盐使蛋白使蛋白质从溶液中析出的从溶液中析出的过程。程。中性中性盐并不破坏蛋白并不破坏蛋白质的分子构造和性的分子构造和性质，因此，因此，除去中性除去中性盐或减低或减低盐的的浓度，蛋白度，蛋白质就会重新就会重新溶解。溶解。分分级盐析析实现蛋白蛋白质的分的分别纯化。化。在血清中参与硫酸在血清中参与硫酸铵，当，当饱和度和度为50%50%时，
5、血，血洁白蛋白不沉淀，球蛋白析出，白蛋白不沉淀，球蛋白析出，饱和度达和度达55%55%，白蛋白析出。白蛋白析出。 量筒量取量筒量取9 ml9 ml底液底液50 %50 %的的饱和硫酸和硫酸铵溶溶液，用移液管逐滴参与，不断液，用移液管逐滴参与，不断摇摆。4 4 静置静置2 h2 h；4 4 ，13,000 rpm13,000 rpm离心离心20 min20 min，搜集上清，搜集上清，留留0.5 ml0.5 ml样2 2至至1.5 ml1.5 ml离心管，用于离心管，用于测定蛋白定蛋白质含量和含量和电泳；泳；用用5%的的柠檬酸檬酸缓冲液冲液调理理pH至至4.5，用量筒确定上清液，用量筒确定上清液
6、的体的体积，计算参与算参与饱和硫酸和硫酸铵pH4.5的体的体积0.11V；逐滴参与逐滴参与饱和硫酸和硫酸铵pH4.5，振，振荡，4 静置静置2 h；4 ，3,000 rpm离心离心20 min，弃上清，沉淀用，弃上清，沉淀用0.5 mL pH7.4的的柠檬酸檬酸缓冲液溶解，置透析袋中，放入冲液溶解，置透析袋中，放入pH 7.4的的柠檬酸檬酸缓冲液中，冲液中，搅拌透析拌透析过夜至蛋白夜至蛋白质溶液中无溶液中无NH4存在；留存在；留0.1 ml样3至至1.5 ml离心管，用于离心管，用于测定蛋白定蛋白质含量和含量和电泳；泳；NH4的的检测：奈氏：奈氏试剂奈氏反响奈氏反响 奈氏试剂是络盐K2HgI4
7、加KOH的溶液，在无机化学定性分析中，用其检验氨或铵盐砖红色的溶液或沉淀砖红色的溶液或沉淀 二、血洁白蛋白的纯化离子交离子交换柱柱层析：析：离子交离子交换柱的安装柱的安装平衡平衡加加样洗脱洗脱样品搜集品搜集在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间的静电吸引。合力取决于彼此之间的静电吸引。蛋白质混合物的分别可以由改动溶液中盐离子蛋白质混合物的分别可以由改动溶液中盐离子浓度或浓度或pHpH来完成，对离子交换剂结合力最小的来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。本实验采用的本实验采用的DEA
8、EDEAE纤维素离子交换剂纤维素离子交换剂. .层析洗脱，可以采用坚持洗脱液成分不断层析洗脱，可以采用坚持洗脱液成分不断不变的方式洗脱，也可采用改动洗脱的盐不变的方式洗脱，也可采用改动洗脱的盐浓度和或浓度和或pHpH的方式洗脱，后一种方式的方式洗脱，后一种方式又可以分为两种：一种是腾跃式的分段改又可以分为两种：一种是腾跃式的分段改动梯度洗脱，另一种是渐进式的延续动梯度洗脱，另一种是渐进式的延续改动延续洗脱。改动延续洗脱。除硫酸除硫酸铵铵后的白蛋白溶液在后的白蛋白溶液在0.02mol/L pH7.4 0.02mol/L pH7.4 醋酸醋酸铵铵缓缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基冲液的条件下，加到二
9、乙氨乙基DEAE DEAE 一一纤维纤维素素层层析柱上，在此析柱上，在此pH pH 时时，DEAE -DEAE -纤维纤维素素带带有正有正电电荷，荷，它能吸附它能吸附带负电带负电荷的白蛋白、荷的白蛋白、 及及 球蛋白血球蛋白血洁洁白蛋白蛋白等白等电电点点为为4 . 9 4 . 9 ，绝绝大多数。大多数。 及及 球蛋白等球蛋白等电电点均小点均小于于6 6 。随着。随着盐盐离子离子浓浓度的提高，离子交度的提高，离子交换换柱上的柱上的 球蛋白、球蛋白、 球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。DEAE-DEAE-纤维纤维素离子交素离子交换层换层析：析：装柱：将装柱：将层层析柱垂直
10、固定。将析柱垂直固定。将DEAE-DEAE-纤维纤维素装入柱内，素装入柱内，至至8-10cm8-10cm高度，平衡高度，平衡过过夜；夜；洗脱液流速洗脱液流速调调理理为为 1mL/min 1mL/min；上上样样：将透析袋剪开，用移液管：将透析袋剪开，用移液管转转至至层层析柱内，待析柱内，待样样品品进进入凝胶后再参与少量入凝胶后再参与少量缓缓冲液，使冲液，使样样品完全品完全进进入胶入胶内；内；洗脱：采用延洗脱：采用延续续梯度洗脱，用梯度洗脱，用0.020.021.0mol1.0molL L醋酸醋酸醋酸醋酸铵缓铵缓冲液冲液 pH7.4pH7.4 进进展洗脱，搜集；展洗脱，搜集；记录记录出出现现峰峰
11、值值的管号的管号( (样样品品4,)4,)洗脱速度慢，可直接洗脱速度慢，可直接换换B B液液 1.0mol 1.0molL L醋酸醋酸醋酸醋酸铵缓铵缓冲液冲液 五、血五、血洁白蛋白的相白蛋白的相对分子分子质量量测定定 -SDS- -SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳 电泳迁移率与颗粒的电荷、外形、大小电泳迁移率与颗粒的电荷、外形、大小分子量有关，如电荷、外形都一样，那分子量有关，如电荷、外形都一样，那么电泳迁移率只与分子量有关。么电泳迁移率只与分子量有关。SDSSDS的作用：的作用：1.1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级构造，强复原剂巯基乙
12、醇能使白质的二级和三级构造，强复原剂巯基乙醇能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；二硫键断裂，使蛋白质完全变性；2.2.能与变性的蛋白能与变性的蛋白质按比例结合，构成质按比例结合，构成SDS-SDS-蛋白质复合物。蛋白质复合物。SDS-SDS-蛋白质复合物的特点：蛋白质复合物的特点：1. 1. 由于结合大量的由于结合大量的SDSSDS，使蛋白质丧失了原有的电荷形状；使蛋白质丧失了原有的电荷形状；2.2.复合物都是椭圆复合物都是椭圆棒状。棒状。因此在进展电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分因此在进展电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。子量大小。测定各条带的相对迁移测定各条带的相对迁移率，根
13、据知蛋白质分子率，根据知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，以相对迁移率为横坐标，lgMW为纵坐标作规范为纵坐标作规范曲线。根据未知蛋白质曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从规范曲的相对迁移率从规范曲线上查出它们的线上查出它们的lgMW，再换算成蛋白质分子，再换算成蛋白质分子量量测定各条带的相对迁移率，根据知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标为测定各条带的相对迁移率，根据知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标为lgMW为纵坐标作规范曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从规范曲线上查出它们的为纵坐标作规范曲线。根据未知蛋白质的相
14、对迁移率从规范曲线上查出它们的lgMW，再换算成蛋白质分子量，再换算成蛋白质分子量在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：线性关系，符合下式：logMW=K-BxMW为分子为分子量，量，X为迁移率，为迁移率，k、B均为常数均为常数假设将知分子量的规范蛋白质的迁移率对分子量对假设将知分子量的规范蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条规范曲线，未知蛋白质在一样数作图，可获得一条规范曲线，未知蛋白质在一样条件下进展电泳，根据它的电泳迁移率即可在规范条件下进展电泳，根据它的电泳迁移率即可在规范曲线上求得分子量。曲线上求得分子量。计
15、算猪血白蛋白的分子量算猪血白蛋白的分子量 ：logMW=K-Bx规范蛋白质规范蛋白质分子量分子量兔磷酸化酶兔磷酸化酶B97 400牛血洁白蛋白牛血洁白蛋白66 200兔肌动蛋白兔肌动蛋白43 000牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶31 000胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂20 100鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶14 400胶的制胶的制备编号编号溶液称号溶液称号12%分别胶分别胶4%浓缩胶浓缩胶130% Acr 0.8% Bis2.0ml0.33ml2pH 8.9 Tris -HCIpH 8.9 Tris -HCI1.25ml-3pH 6.7 Tris- HCI-0.63ml410%SDS100ul25ul5TE
16、MED2.5ul2.5ul610%AP50ul12.5ul7H2O1.65ml1.5ml总体积总体积约约5 mL约约2.5 mL样品的品的处置置 向向规范蛋白范蛋白质或待或待测样品中按比例参与上品中按比例参与上样缓冲液，充分溶解后，加盖不要密冲液，充分溶解后，加盖不要密闭，置沸水浴，置沸水浴3 min，取出冷至室温。，取出冷至室温。上上样顺序：序：规范蛋白；范蛋白；样品品1；样品品2；样品品3；柱柱层析析顶峰管号的蛋峰管号的蛋白白质样品品4,；加加样量：量：20L.电泳：点泳：点样端端负极，恒极，恒压：开：开场80V，待，待样品品进入分入分别胶后胶后120V。电极极缓冲液：冲液：pH 8.3
17、Tris Gly染色：脱色考染色：脱色考马斯亮斯亮兰R-250，过夜。夜。脱色：先用蒸脱色：先用蒸馏水冲洗凝胶，再用脱色液冰醋水冲洗凝胶，再用脱色液冰醋酸：蒸酸：蒸馏水：甲醇水：甲醇=75：875：50脱色脱色1-3h。 四、考四、考马斯亮斯亮兰法法测定蛋白定蛋白质含量含量考考马斯亮斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕的磷酸溶液呈棕红色，最大色，最大吸收峰在吸收峰在465nm。当它与蛋白。当它与蛋白质结合构成合构成复合物复合物时呈呈蓝色，其最大吸收峰改色，其最大吸收峰改动为595nm，考，考马斯亮斯亮蓝G250 -蛋白蛋白质复合物复合物的高消光效的高消光效应导致了蛋白致了蛋白质定量定量测定的高定的高敏
18、感度敏感度.在一定范在一定范围内，考内，考马斯亮斯亮蓝G250-蛋白蛋白质复复合物呈色后，在合物呈色后，在595nm 下，吸光度与蛋白下，吸光度与蛋白质含量呈含量呈线性关系，故可以用于蛋白性关系，故可以用于蛋白质浓度的度的测定定 操作操作 mL编编编编号号号号0 01 12 23 34 45 57 78 89 9101011111212131314141515规规规规范范范范蛋蛋蛋蛋白白白白0 00.40.40.80.81.21.21.61.62 2 水水水水 2 21.61.61.21.20.80.80.40.40 0考考考考马马马马斯斯斯斯亮亮亮亮蓝蓝蓝蓝5 55 55 55 55 55
19、55 55 55 55 55 55 55 55 55 5规范蛋白液：范蛋白液：50g/ mL；样1、2、3稀稀释100倍倍样1稀稀释600倍倍10 l6ml；样2、3稀稀释200倍倍10 l2ml；各峰稀各峰稀释5-10倍倍10 l6ml按上表加好按上表加好试剂后后摇匀，以匀，以0管管为对照，于照，于595nm处测定光吸收定光吸收值，以，以管做出管做出规范曲范曲线；各；各样品的光吸收品的光吸收值，取平均，取平均值，从从规范曲范曲线中中查出蛋白出蛋白质的的g数。数。 三、血三、血洁白蛋白白蛋白纯度的度的检测- - - - 聚丙聚丙聚丙聚丙烯酰烯酰烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶胺凝胶胺凝胶(PAGE)(PA
20、GE)(PAGE)(PAGE)电电电电泳法泳法泳法泳法A A、胶的制备、胶的制备编号编号溶液称号溶液称号12%分别胶分别胶4%浓缩胶浓缩胶130% Acr 0.8% Bis2.0ml0.33ml2pH 8.9 Tris -HCI1.25ml-3pH 6.7 Tris- HCI-0.63ml4TEMED2.5ul2.5ul510%AP50ul12.5ul6H2O1.65ml1.5ml总体积总体积约约5 mL约约2.5 mLB B 加加样样：各步：各步骤骤留留样样的的样样液；液；层层析后的蛋白峰。析后的蛋白峰。样样品的品的处处置：置：样样品加等量的品加等量的40%40%蔗糖溶液、一滴蔗糖溶液、一滴0.1%0.1%溴酚溴酚蓝蓝。加加样样量：量：20l20l样样品品+ 5(.+ 5(.C C 电电泳：点泳：点样样端端负负极，恒极，恒压压，开，开场场80V80V，待，待样样品品进进入分入分别别胶后胶后120V120V。电电极极缓缓冲液：冲液：pH 8.3 Tris GlypH 8.3 Tris GlyD D 染色：脱色考染色：脱色考马马斯亮斯亮兰兰R-250R-250，过过夜。夜。E E 脱色：先用蒸脱色：先用蒸馏馏水冲洗凝胶，再用脱色液水冲洗凝胶，再用脱色液 冰醋酸：蒸冰醋酸：蒸馏馏水：水：甲醇甲醇=75=75：875875：5050 脱色脱色1h1h。【结结果与分析】果与分析】
