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1、1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2021/8/261质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个切口两个切口获得获得目的基因目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种4 4、构建过程：、构建过程：基因表达载体基因表达载体2021/8/262复习复习: : 基因工程的基本操作步骤基因工程的基本操作步骤提取目的基因提取目的基因目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的表达和检测目的基因的表达和检测2021/8/263 基因工程的基本操作程序基
2、因工程的基本操作程序主要包括五个步骤：主要包括五个步骤：1 1）获取目的基因）获取目的基因2 2）制备重组）制备重组DNADNA分子分子3 3）转化受体细胞）转化受体细胞4 4）筛选重组细胞）筛选重组细胞5 5）实现功能表达）实现功能表达2021/8/264一、目的基因的获取一、目的基因的获取: :主要指的是主要指的是编码蛋白质编码蛋白质的结构基因的结构基因2 2、目前常用获取方法、目前常用获取方法：1 1 、目的基因：、目的基因：1)1)、从、从基因文库基因文库中获取中获取2)2)、利用、利用PCRPCR技术技术扩增扩增3)3)、利用、利用人工合成人工合成方法方法2021/8/265从从基因
3、文库中基因文库中获取：目的基因获取：目的基因、基因文库、基因文库: : 将含有将含有某种生物不同基因某种生物不同基因的许多的许多DNADNA片片断，导入到断，导入到受体菌的群体受体菌的群体中中储存储存，各个受体，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。菌分别含有这种生物的不同基因。2021/8/266基因文库的构建模式图基因文库的构建模式图 通过对通过对受体受体菌菌的的培养培养而而储储存大量存大量目的基目的基因因2021/8/267基因文库基因文库: :基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（c DNAc DNA文库文库）2021/8/268如何从基因文库中得到所需要的基因如何从基因文库中
4、得到所需要的基因依据：依据：目的基因的有关信息目的基因的有关信息如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性2021/8/269利用利用PCRPCR技术技术扩增：目的基因扩增：目的基因）技术的原理：）技术的原理：）获取的前提：）获取的前提：DNADNA双链复制双链复制）PCRPCR技术过程：技术过程：要有一段要有一段已知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列，以，以便根据这一序列合成便根据这一序列合成引物引物变性、复性、延伸，变性、复性
5、、延伸， 结果结果: :数量呈数量呈n n扩增扩增2021/8/26105 5/ /3 3/ /GGGGTCTC3 3/ /5 5/ /GAGACCCC5 5/ /3 3/ /引物引物GGGG变性变性复性复性延伸延伸1.目的基因目的基因DNA受热变性，解链；受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；3.合成链在合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。聚合酶作用下进行延伸。5 5/ /3 3/ /AGAG引物引物利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因2021/8/2611利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因2021/8/2612反转录法反转录法根据已知
6、的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成人工合成：目的基因人工合成：目的基因）使用范围：）使用范围：基因较小，核苷酸序列又已知基因较小，核苷酸序列又已知，可以人工合成，可以人工合成）具体方法：）具体方法：2021/8/26132021/8/2614二、（二、（2525）基因表达载体的构建：）基因表达载体的构建：核心核心1 1 、表达载体的组成：、表达载体的组成：复制原点复制原点+ +启动子启动子+ +目的基因目的基因+ +终止子终止子+ +标记基因等标记基因等2 2 、表达载体的功能：、表达载体的功能：1 1）使目的基因在受体细胞中）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并能遗传稳定存在，并能遗传2
7、 2）使目的基因能够）使目的基因能够表达和发挥表达和发挥作用作用2021/8/2615 位于位于基因首端基因首端，是，是RNARNA聚合酶识别和结合聚合酶识别和结合的的部位，部位，驱动驱动基因基因转录出转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质启动子：启动子：终止子：终止子：位于位于基因的尾端基因的尾端，能终止，能终止DNADNA的转录的转录 为了为了鉴别受体细胞鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞而将含有目的基因的细胞筛选筛选出来出来标记基因：标记基因：2021/8/2616质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口
8、两个切口两个切口获得获得目的基因目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种4 4、构建过程：、构建过程：基因表达载体基因表达载体2021/8/2617三、将目的基因导入受体细胞：三、将目的基因导入受体细胞：1 1、转化、转化 ： 目的基因进入目的基因进入受体细胞受体细胞内，并且在受体细内，并且在受体细胞内维持胞内维持稳定稳定和和表达表达的过程的过程2021/8/26182 2、常见的几种转化方法：、常见的几种转化方法：导入植物细胞：导入植物细胞：导入动物细胞：导入动物细胞：导入微生物细胞：导入微生物细胞：农杆菌转化法（农杆菌转化法（最常用最
9、常用）显微注射技术（显微注射技术（最常用、最有效最常用、最有效）利用感受态细胞与重组质粒利用感受态细胞与重组质粒混合混合基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法2021/8/26191 1）、目的基因导入植物细胞：）、目的基因导入植物细胞：（1 1）农杆菌：）农杆菌： 农杆菌转化法农杆菌转化法 易感染易感染双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物，对，对大多数单大多数单子叶植物子叶植物无感染力，植物受伤时伤口处分泌大无感染力，植物受伤时伤口处分泌大量的量的酚类化合物酚类化合物，会，会吸引吸引农杆菌。农杆菌。2021/8/2620（2 2）转化程序：）转化程序：目的基因目的基因TiTi质粒上的质
10、粒上的 T TDNADNA插入插入植物细胞植物细胞农杆菌农杆菌染色体染色体DNADNA上上维持稳定维持稳定和表达和表达并整并整合到合到导入导入感染感染同时同时T-T-DNADNA导入导入2021/8/26212021/8/2622）、目的基因导入动物细胞：）、目的基因导入动物细胞：（1 1）转化程序：）转化程序： 显微注射技术显微注射技术目的基因目的基因表达载体表达载体提纯提纯显微注射显微注射取卵取卵受精卵受精卵新性状的新性状的动物动物导入导入发育发育2021/8/2623）、目的基因导入微生物细胞：）、目的基因导入微生物细胞：（1 1）原核生物特点：）原核生物特点： 繁殖快、多为单细胞，遗传
11、物质相对较少等。繁殖快、多为单细胞，遗传物质相对较少等。应用最广泛的是：应用最广泛的是：大肠杆菌大肠杆菌（）转化程序：（）转化程序： CaCa2+2+处理细胞处理细胞形成形成将重组表达载体溶于缓将重组表达载体溶于缓冲液冲液感受态细胞感受态细胞混合混合完成转化完成转化2021/8/2624( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测：检测：检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否上是否插入了目的基因插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质利用：利用：DNADNA分子
12、杂交技术分子杂交技术利用：分子杂交技术利用：分子杂交技术利用：抗原抗体杂交利用：抗原抗体杂交2021/8/2625鉴定：鉴定：如：抗虫、抗病特性的鉴定、活性鉴定等如：抗虫、抗病特性的鉴定、活性鉴定等利用个体生物学水平利用个体生物学水平( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定2021/8/26261 1、为为了了培培育育节节水水高高产产品品种种，科科学学家家将将大大麦麦中中与与抗抗旱旱节节水水有有关关的的基基因因导导入入小小麦麦，得得到到转转基基因因小小麦麦，其其水分利用率提高了水分利用率提高了20%20%。这项技术的遗传学原理是。这项技术的遗传学原理是 A A基因重组基因重组
13、B B基因突变基因突变 C C基因复制基因复制 D D基因分离基因分离A A2021/8/26272 2、利利用用苏苏云云金金芽芽孢孢杆杆菌菌的的抗抗虫虫基基因因培培育育的的抗抗虫虫棉棉是否成功，最好检测是否成功，最好检测 A A是否有抗生素产生是否有抗生素产生 B B是否有目的基因表达是否有目的基因表达 C C是否有抗虫的性状出现是否有抗虫的性状出现 D D是否能分离到目的基因是否能分离到目的基因 C C2021/8/26283 3、水水母母发发光光蛋蛋白白由由236236个个氨氨基基酸酸构构成成，其其中中天天冬冬氨氨酸酸、甘甘氨氨酸酸和和丝丝氨氨酸酸构构成成发发光光环环，现现已已将将这这种
14、种蛋蛋白白质质的的基基因因作作为为生生物物转转基基因因的的标标记记，在在转转基基因因技技术术中中，这种蛋白质的作用是这种蛋白质的作用是A A促使目的基因导入受体细胞促使目的基因导入受体细胞 B B促使目的基因在受体细胞内复制促使目的基因在受体细胞内复制C C使目的基因容易被检测出来使目的基因容易被检测出来 D D使目的基因容易成功表达使目的基因容易成功表达C C2021/8/26294 4、根据、根据mRNAmRNA的信息推出获取目的基因的方法是的信息推出获取目的基因的方法是 A A、用、用DNADNA探针测出目的基因探针测出目的基因 B B、用、用mRNAmRNA探针测出目的基因探针测出目的
15、基因 C C、用、用mRNAmRNA反转录形成目的基因反转录形成目的基因 D D、用、用PCRPCR技术扩增技术扩增mRNAmRNAC C2021/8/26305 5、获获取取目目的的基基因因的的方方法法有有多多种种，下下列列不不属属于于目目的的基因获取方法的是基因获取方法的是A A、从基因组文库中获取、从基因组文库中获取B B、从、从cDNAcDNA文库中获取文库中获取 C C、从含目的基因生物细胞中获取、从含目的基因生物细胞中获取D D、利用、利用PCRPCR技术获取技术获取C C2021/8/26316 6、下下列列高高科科技技成成果果中中，根根据据基基因因重重组组原原理理进进行行的的是
16、是 ( (多选多选) )A A、我我国国科科学学家家袁袁隆隆平平利利用用杂杂交交技技术术培培育育出出超超级级水水稻。稻。 B B、我我国国科科学学家家将将苏苏云云金金杆杆菌菌的的某某些些基基因因转转移移到到棉棉花体内，培育出抗虫棉。花体内，培育出抗虫棉。 C C、我我国国科科学学家家通通过过返返回回式式卫卫星星搭搭载载种种子子培培育育出出太太空椒。空椒。 D D、我国科学家通过体细胞克隆技术培育出克隆牛、我国科学家通过体细胞克隆技术培育出克隆牛ABAB2021/8/26328 8、不属于目的基因与运载体结合过程的是（、不属于目的基因与运载体结合过程的是（ ） A A、用一定的限制酶切割质粒露出
17、黏性末端、用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端 B B、用同种限制酶切割目的基因露出黏性末端、用同种限制酶切割目的基因露出黏性末端C C、将切下的目的基因的片段插入到质粒切口处、将切下的目的基因的片段插入到质粒切口处 D D、将重组、将重组DNADNA导入到受体细胞进行扩增导入到受体细胞进行扩增D D2021/8/26339 9、下列实例属于基因工程的是（、下列实例属于基因工程的是（ ）将鸡的将鸡的DNADNA分子的某个片段整合到小鼠的分子的某个片段整合到小鼠的DNADNA分子分子中中 将抗药菌的某个基因引入到草履虫的细胞内将抗药菌的某个基因引入到草履虫的细胞内将鼠的骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞
18、融合成杂将鼠的骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞交瘤细胞 将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系 A A、 B B、 C C、 D D、C C2021/8/26341111、下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（、下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（ ） A A、重组、重组DNADNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体运载体B B、所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸、所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列序列C C、选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌、选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为
19、细菌繁殖快繁殖快D D、只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表、只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达达C C2021/8/26357 7、下下列列有有关关基基因因工工程程技技术术的的叙叙述述，正正确确的的是是（ ） A A、重重组组DNADNA技技术术所所用用的的工工具具酶酶是是限限制制酶酶、连连接接酶酶和和运载体运载体B B、所所有有的的限限制制酶酶都都只只能能识识别别同同一一种种特特定定的的核核苷苷酸酸序列序列C C、选选用用细细菌菌作作为为重重组组质质粒粒的的受受体体细细胞胞是是因因为为细细菌菌繁殖快繁殖快D D、只只要要目目的的基基因因进进入入了了受受体体细细胞胞就就能能成成功
20、功实实现现表表达达C C2021/8/26368 8、下列关于基因工程的叙述，正确的是（、下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ） A A、基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因、基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因B B、细菌质粒是基因工程常用的运载体、细菌质粒是基因工程常用的运载体C C、通通常常用用一一种种限限制制酶酶处处理理含含目目的的基基因因的的DNADNA，用用另另一种处理运载体的一种处理运载体的DNADNAD D、为为培培育育成成抗抗除除草草剂剂的的作作物物新新品品种种，导导入入抗抗除除草草剂基因时只能以受精卵为载体剂基因时只能以受精卵为载体B B2021/8/2637 科学家通
21、过基因工程的方法培育抗虫棉时，科学家通过基因工程的方法培育抗虫棉时，需从苏云金芽孢杆菌中提取出抗虫基因，需从苏云金芽孢杆菌中提取出抗虫基因，“放入放入”棉花的细胞中与棉花结合起来并发挥作用，回答：棉花的细胞中与棉花结合起来并发挥作用，回答：1 1）从苏云金芽孢杆菌中切割抗虫基因所用的工具）从苏云金芽孢杆菌中切割抗虫基因所用的工具是是 ，此工具主要存在于，此工具主要存在于_中，其特中，其特点是点是: : _ _ 。限制酶限制酶微生物微生物 一种限制酶只能识别一种特定的核苷一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点切割酸序列，并在特定的切点切割2021/8/26382 2）苏云金芽孢杆
22、菌中一个）苏云金芽孢杆菌中一个DNADNA分子上有许多基因，分子上有许多基因，获得抗虫基因的具体做法是：用获得抗虫基因的具体做法是：用 酶将苏云酶将苏云金芽孢杆菌的金芽孢杆菌的 切成许多片段，然后将这些片切成许多片段，然后将这些片段分别段分别 _ _ ，再通过，再通过 _导入不同的受体细胞中，让它们在各导入不同的受体细胞中，让它们在各个不同的受体细胞中大量个不同的受体细胞中大量 ，从中找出含有，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把目的基因的细胞，再用一定的方法把_ _ _ _ 分离出来。分离出来。3 3）进行基因工程操作一般要经过的四个步骤是：）进行基因工程操作一般要经过的四个步骤是：
23、 ； ； ； 。限制酶限制酶DNADNA与运载体结合与运载体结合运载体运载体复制复制带有目的基因的带有目的基因的DNADNA片段片段目的基因的获取；目的基因的获取； 基因表达载体的构建；基因表达载体的构建； 将目的基因导入受体细胞；将目的基因导入受体细胞； 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定2021/8/26391212、19971997年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的的基因与大肠杆菌的DNADNA分子重组，并且在大肠杆分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据右下图回答问题。菌中表达成功。请据右下图回答问题。1)1)此图是采取此图
24、是采取 合成基合成基因的方法获取因的方法获取 基因的基因的过程。过程。2)2)图中图中DNADNA是以是以_ 为模板，形成单链为模板，形成单链DNADNA，在，在酶的作用下合成双链酶的作用下合成双链DNADNA，从而获得了所需要的目的从而获得了所需要的目的基因。基因。人工人工目的目的 控制胰岛控制胰岛素合成的信使素合成的信使RNARNA2021/8/2640(3) (3) 图中图中代表代表 ，它往往含，它往往含_ 基因，以便对目的基因的检测。基因，以便对目的基因的检测。(4) (4) 图中图中表示表示 _ _ ，为使，为使此过程顺利进行，一般须将大肠杆菌用此过程顺利进行，一般须将大肠杆菌用 处
25、处理，以增大其细胞对理，以增大其细胞对 _ _ 。（5 5）图中）图中表示表示 随大肠杆菌的繁殖随大肠杆菌的繁殖而进行增殖，此目的基因在大肠杆菌内表达的标志而进行增殖，此目的基因在大肠杆菌内表达的标志是是_ 。重组重组DNADNA分子分子标记标记将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞钙离子钙离子外围外围DNADNA分子的吸收分子的吸收目的基因目的基因大肠杆菌能产生人的胰岛素大肠杆菌能产生人的胰岛素2021/8/26411010、现在人们已经实现了分子水平上的遗传物质、现在人们已经实现了分子水平上的遗传物质的重组，下列实例中属于分子水平重组的是（的重组，下列实例中属于分子水平重组的是（ ）A A、将人的凝血因子的基因导入到羊的乳腺细胞、将人的凝血因子的基因导入到羊的乳腺细胞中表达中表达 B B、水稻基因组精细图的绘制、水稻基因组精细图的绘制C C、白菜与甘蓝的体细胞杂交、白菜与甘蓝的体细胞杂交 D D、将鼠的骨髓瘤细胞与经过免疫的、将鼠的骨髓瘤细胞与经过免疫的B B淋巴细胞融淋巴细胞融合成杂交瘤细胞合成杂交瘤细胞A A2021/8/2642 刚才的发言，如刚才的发言，如有不当之处请多指有不当之处请多指正。谢谢大家！正。谢谢大家！2021/8/2643部分资料从网络收集整理而来，供大家参考，感谢您的关注！
