非细胞微生物课件

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1、非细胞微生物特性特性细菌细菌病毒病毒大小大小以以 m m计，一般显微镜观察计，一般显微镜观察以以nmnm计（计（1010-3-3 m m），电子显微镜），电子显微镜观察观察结构结构细胞结构细胞结构非细胞结构非细胞结构核酸核酸RNARNA和和DANDAN二者兼有二者兼有只有只有RNARNA或或DNADNA二者之一二者之一提纯的核酸提纯的核酸无感染性无感染性有感染性有感染性人工培养人工培养用无生命培养用无生命培养用活细胞培养用活细胞培养增殖方式增殖方式横分裂，不依赖宿主细胞横分裂，不依赖宿主细胞宿主细胞内周期复制宿主细胞内周期复制对抗生素对抗生素敏感敏感不敏感不敏感对干扰素对干扰素不敏感不敏感敏感

2、敏感非细胞型微生物非细胞型微生物- -病毒。病毒。 病毒：超显微的、不具细胞结构的、专性活细胞病毒：超显微的、不具细胞结构的、专性活细胞寄生的微生物。寄生的微生物。一、病毒一、病毒（一）病毒的生物学特征（一）病毒的生物学特征（1）个体非常微小，病毒比细菌更小需要使用电子显）个体非常微小，病毒比细菌更小需要使用电子显微镜（微镜（EM）观察。其测量单位为）观察。其测量单位为nm。病毒一般能通过细菌。病毒一般能通过细菌滤器，其分离方法之一即是将宿主细胞破碎后用细菌滤器过滤器，其分离方法之一即是将宿主细胞破碎后用细菌滤器过滤，病毒存在于滤液中。滤，病毒存在于滤液中。（2）结构简单，没有细胞结构。其基本

3、结构为一个将）结构简单，没有细胞结构。其基本结构为一个将核酸包裹于蛋白质中的粒子，故单个病毒又称病毒粒子。核酸包裹于蛋白质中的粒子，故单个病毒又称病毒粒子。病毒的化学组成相对简单，基本的成分是核酸和外壳中病毒的化学组成相对简单，基本的成分是核酸和外壳中的蛋白质。的蛋白质。一个病毒粒子只含一种核酸。即仅含一个病毒粒子只含一种核酸。即仅含DNA或或RNA中的中的一种。至今从未在一个病毒粒子中发现两种核酸。一种。至今从未在一个病毒粒子中发现两种核酸。 （3）高度寄生性，只能在活细胞内利用宿主细胞的代谢）高度寄生性，只能在活细胞内利用宿主细胞的代谢系统，进行自身核酸的复制和所需蛋白质的合成。系统，进行

4、自身核酸的复制和所需蛋白质的合成。病毒缺乏独立代谢能力。病毒粒子中只含有必需的极少病毒缺乏独立代谢能力。病毒粒子中只含有必需的极少的酶，没有酶系。病毒在宿主细胞内自我复制所需要的原料、的酶，没有酶系。病毒在宿主细胞内自我复制所需要的原料、大多数酶、核糖体、细胞器等都由宿主细胞提供。大多数酶、核糖体、细胞器等都由宿主细胞提供。病毒在活的宿主细胞内病毒为专性寄生，会自我复制；病毒在活的宿主细胞内病毒为专性寄生，会自我复制；在细胞外却呈现出无代谢的颗粒状态，无生命特征。在细胞外却呈现出无代谢的颗粒状态，无生命特征。 （4）特殊的抵抗力）特殊的抵抗力病毒对甘油脱水有强的抵抗力，对绝大多数对抗生素不敏感

5、。病毒对甘油脱水有强的抵抗力，对绝大多数对抗生素不敏感。病毒对热、射线、化学消毒剂抵抗力弱。病毒对热、射线、化学消毒剂抵抗力弱。 （5 5）每一种病毒只含一种核酸）每一种病毒只含一种核酸病毒只含有一种核酸，不是病毒只含有一种核酸，不是DNADNA就是就是RNARNA，有的病毒还，有的病毒还不还有核酸。除了病毒以外，其他的微生物都含有两不还有核酸。除了病毒以外，其他的微生物都含有两种核酸。种核酸。（6 6）在离体条件下，病毒没有生命特性。）在离体条件下，病毒没有生命特性。当病毒离开宿主，不表现生命特征，义无生命的生物当病毒离开宿主，不表现生命特征，义无生命的生物大分子状态存在，但具有侵染活性，一

6、旦进入宿主细大分子状态存在，但具有侵染活性，一旦进入宿主细胞，就表现生命特性。胞，就表现生命特性。 病毒的分类：病毒的分类： （1）根据病毒所寄生的生物和细胞的种类来对病毒进行）根据病毒所寄生的生物和细胞的种类来对病毒进行分类：分类： 微生物病毒、植物病毒、昆虫病毒、脊椎动物病毒。微生物病毒、植物病毒、昆虫病毒、脊椎动物病毒。（2）根据病毒核酸成分分类：）根据病毒核酸成分分类： DNA病毒；病毒；RNA病毒。病毒。 （3）根据病毒的化学组成分类）根据病毒的化学组成分类真病毒（通常称作病毒）：至少含有核酸和蛋白质两种真病毒（通常称作病毒）：至少含有核酸和蛋白质两种 组分。组分。亚病毒：只含有一种

7、核酸或蛋白质，包括：亚病毒：只含有一种核酸或蛋白质，包括： 类病毒：只含具有独立侵染性的类病毒：只含具有独立侵染性的RNA组分。组分。 拟病毒：只含不具有独立侵染性的拟病毒：只含不具有独立侵染性的RNA组分。组分。 朊病毒朊病毒:只含单一蛋白质组分。只含单一蛋白质组分。v病毒的形态大小是病毒分类鉴定的标准之一。 v多数病毒呈球形或近似球形，杆状，丝状，少数可为子弹状、砖块状，噬菌体可呈蝌蚪状。v病毒个体微小，常以nm表示，其大小相差悬殊。较大的痘病毒直径约300nm，近似于最小的原核微生物，如用姬姆萨、维多利亚蓝、荧光染料或镀银等方法染色处理后，在光学显微镜下可以观察到。而较小的口蹄疫病毒颗粒

8、很小，直径约1022nm。病毒能通过细菌过滤器，其大小大多在20300nm范围内，超过了普通光学显微镜的分辨能力，必须用电子显微镜才能观察到。 1、病毒的大小与形态、病毒的大小与形态微生物的大小比较葡萄球菌(1000nm） 牛痘病毒300250nmABCDEFG立克次体450nm衣原体390nmA、大肠杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体 ( 65 95nm )B、腺病毒、腺病毒 (70nm )C、脊髓灰质炎病毒、脊髓灰质炎病毒 (30nm )D流行性乙型脑炎流行性乙型脑炎 病毒病毒( 40nm ) E、卵蛋白分子、卵蛋白分子 (10nm )F、流感病毒、流感病毒 ( 100nm )G、烟草花叶病毒、烟

9、草花叶病毒病毒的大小差别很大，单个病毒粒子的形状可分为病毒的大小差别很大，单个病毒粒子的形状可分为砖形、砖形、弹状、球形、蝌蚪形、杆状弹状、球形、蝌蚪形、杆状。球形的病毒，事实上为近似球状的二十面体，如腺病毒。球形的病毒，事实上为近似球状的二十面体，如腺病毒。杆状病毒如烟草花叶病毒；杆状病毒如烟草花叶病毒；复杂形状，某些噬菌体，其头部为球状，尾部呈杆状，复杂形状，某些噬菌体，其头部为球状，尾部呈杆状，整体呈蝌蚪状，是两种基本形状的复合；整体呈蝌蚪状，是两种基本形状的复合；另一类如痘病毒，其形状呈卵圆形或砖形。另一类如痘病毒，其形状呈卵圆形或砖形。病毒的基本形态：病毒的基本形态：病毒的两种基本形

10、态病毒的两种基本形态 2.2.弹弹状状3.3.球球形形4.4.蝌蚪蝌蚪形形5.5.杆杆形形2、病毒的化学组成、病毒的化学组成病毒病毒主要由核酸和蛋白质两种基本成分组成主要由核酸和蛋白质两种基本成分组成； 核核酸位于病毒粒子的中心部分（酸位于病毒粒子的中心部分（core，称为核心）；核，称为核心）；核酸的外面包裹的蛋白质部分称衣壳（酸的外面包裹的蛋白质部分称衣壳（capsid，又称壳，又称壳体），衣壳由许多相同的壳粒组成。体），衣壳由许多相同的壳粒组成。有些大型病毒在衣壳外还有一层由脂质、蛋白质有些大型病毒在衣壳外还有一层由脂质、蛋白质和糖类组成的包膜。和糖类组成的包膜。病毒粒子结构模式图病毒粒

11、子结构模式图壳粒壳粒衣壳衣壳核心（核样物）核心（核样物）核衣壳核衣壳包膜包膜包膜病毒包膜病毒包膜子粒包膜子粒3、病毒的结构和化学组成、病毒的结构和化学组成衣壳和壳粒衣壳和壳粒衣壳：由众多的结构单元壳粒（衣壳：由众多的结构单元壳粒（capsomer）蛋白组成病）蛋白组成病毒外壳；毒外壳；壳粒：由一条或多条多肽链组成的蛋白单元；壳粒的排列壳粒：由一条或多条多肽链组成的蛋白单元；壳粒的排列具有高度的对称性。具有高度的对称性。壳粒以螺旋对称排列，则病毒外观为杆状；壳粒以二十面壳粒以螺旋对称排列，则病毒外观为杆状；壳粒以二十面体对称排列，则病毒外观为二十面体（球状）。体对称排列，则病毒外观为二十面体（球

12、状）。功能：功能：对内部的核酸有保护功能；对内部的核酸有保护功能；和病毒吸附到宿主细胞表面的受体有关；和病毒吸附到宿主细胞表面的受体有关；有些衣壳蛋白质是酶，如破坏细菌细胞壁的溶菌酶、反转有些衣壳蛋白质是酶，如破坏细菌细胞壁的溶菌酶、反转录病毒中的反转录酶等。录病毒中的反转录酶等。核心核心一种病毒只含有一种核酸一种病毒只含有一种核酸DNADNA病毒：只含病毒：只含DNADNA核酸的病毒；核酸的病毒；RNARNA病毒：只含病毒：只含RNARNA核酸的病毒。核酸的病毒。植物病毒大多数为植物病毒大多数为RNARNA病毒病毒动物病毒一部分为动物病毒一部分为RNARNA病毒，一部分为病毒，一部分为DNA

13、DNA病毒，病毒，噬菌体则基本上为噬菌体则基本上为DNADNA病毒。病毒。大多数病毒只含有一个核酸分子，即只含一条核酸链。大多数病毒只含有一个核酸分子，即只含一条核酸链。正链（正链（+ +）：对单链核酸的）：对单链核酸的RNARNA或或DNADNA病毒，若病毒核酸病毒，若病毒核酸的碱基序列与的碱基序列与mRNAmRNA是一致的，则病毒核酸称为正链（是一致的，则病毒核酸称为正链（+ +）；）；负链（负链（- -）：对单链核酸的）：对单链核酸的RNARNA或或DNADNA病毒，若病毒核酸病毒，若病毒核酸的碱基序列与的碱基序列与mRNAmRNA互补，则病毒核酸称为负链（互补，则病毒核酸称为负链（-

14、-）。）。包膜包膜某些病毒还具有包膜（某些病毒还具有包膜（envelopeenvelope）。）。具有上述二十面体和杆状两种形状的病毒中，皆有一部具有上述二十面体和杆状两种形状的病毒中，皆有一部分种类在衣壳的外面还有一个称为包膜的结构。分种类在衣壳的外面还有一个称为包膜的结构。组成成分为脂类、蛋白质、糖类。组成成分为脂类、蛋白质、糖类。包膜是病毒以出芽的方式穿过宿主细胞的质膜、核膜或包膜是病毒以出芽的方式穿过宿主细胞的质膜、核膜或内质网膜的过程中而获得的。内质网膜的过程中而获得的。包膜的结构和细胞膜类似，也为脂质双层结构。包膜的结构和细胞膜类似，也为脂质双层结构。功能：功能：对内部的衣壳和核酸

15、有保护作用。对内部的衣壳和核酸有保护作用。包膜中的蛋白质及糖蛋白与病毒的吸附专一性、抗原性包膜中的蛋白质及糖蛋白与病毒的吸附专一性、抗原性密切相关，有的还具有酶活性。密切相关，有的还具有酶活性。核心：核酸 基因组genome 决定病毒遗传、变异 和复制壳粒capsomere 衣壳capsid 保护、介导、抗原性包膜envelope，包膜子粒peplomere（刺突spike） 保 护、介导、抗原性噬菌体噬菌体番茄黄化花叶病毒（番茄黄化花叶病毒（Tomato yellow mosaic virus, TYMV）烟草花叶病毒（简称烟草花叶病毒（简称TMV）病毒的结构图病毒的结构图病毒的结构和化学组

16、成（续）病毒的结构和化学组成（续）核核衣衣壳壳核心核心衣壳衣壳 衣壳粒衣壳粒 核心核心( (核酸核酸) ) 包膜包膜 包膜病毒包膜病毒 裸病毒裸病毒刺突刺突 衣壳衣壳 capsid capsid噬菌体结构示意图噬菌体结构示意图病毒的结构图（续）病毒的结构图（续）4、病毒的增殖、病毒的增殖病毒的增殖，表现为并无个体的生长过程，只有两种基病毒的增殖，表现为并无个体的生长过程，只有两种基本成分的合成和装配，即核酸复制、蛋白质合成，再将二者本成分的合成和装配，即核酸复制、蛋白质合成，再将二者装配成核蛋白（病毒粒子）。装配成核蛋白（病毒粒子）。病毒复制一般可以分为吸附、侵人及脱壳、核酸复制、病毒复制一般

17、可以分为吸附、侵人及脱壳、核酸复制、蛋白质合成装配及释放五个阶段。蛋白质合成装配及释放五个阶段。以噬菌体为例研究病毒的增殖；以噬菌体为例研究病毒的增殖；噬菌体（噬菌体（phage）：即感染细菌的病毒。）：即感染细菌的病毒。是由于宿主细菌的结构简单，易培养和操纵，影响因素是由于宿主细菌的结构简单，易培养和操纵，影响因素少。少。 吸附吸附吸附是指病毒以其特殊结构与宿主细胞表面的特异受体发吸附是指病毒以其特殊结构与宿主细胞表面的特异受体发生的特异性（专一性）结合；生的特异性（专一性）结合；噬菌体的结合部位为尾丝尖端的蛋白质；噬菌体的结合部位为尾丝尖端的蛋白质；噬菌体具有非常强的感染专一性，即噬菌体对

18、宿主菌的寄噬菌体具有非常强的感染专一性，即噬菌体对宿主菌的寄生具有高度专一性；生具有高度专一性；植物病毒没有专门的吸附结构，在植物细胞表面也没有病植物病毒没有专门的吸附结构，在植物细胞表面也没有病毒的特异性受体，所以植物病毒感染的专一性不强；毒的特异性受体，所以植物病毒感染的专一性不强；动物病毒的感染专一性则介于噬菌体和植物病毒之间。动物病毒的感染专一性则介于噬菌体和植物病毒之间。 侵入及脱壳侵入及脱壳噬菌体吸附和侵入菌体细胞的过程噬菌体吸附和侵入菌体细胞的过程 噬菌体的侵入方式为注射式。如大肠杆菌噬菌体的侵入方式为注射式。如大肠杆菌T4T4噬菌体侵入噬菌体侵入细胞的基本过程为：细胞的基本过程

19、为：大肠杆菌大肠杆菌T4T4噬菌体先吸附在大肠杆菌的细胞壁上，然后噬菌体先吸附在大肠杆菌的细胞壁上，然后尾丝收缩，使尾管接触细胞壁，尾管中含有的溶菌酶使大肠尾丝收缩，使尾管接触细胞壁，尾管中含有的溶菌酶使大肠杆菌细胞壁中的肽聚糖分解，在细胞壁上产生一个孔；杆菌细胞壁中的肽聚糖分解，在细胞壁上产生一个孔；最后，尾管收缩，将病毒的最后，尾管收缩，将病毒的DNADNA或或RNARNA注入细菌的细胞质注入细菌的细胞质中，蛋白质衣壳则留在细胞壁外。中，蛋白质衣壳则留在细胞壁外。侵入及脱壳（续）侵入及脱壳（续）动物病毒的侵入方式主要为胞吞等作用。动物病毒的侵入方式主要为胞吞等作用。植物病毒的侵人方式为被动

20、的，即必须通过伤口侵入受损植物病毒的侵人方式为被动的，即必须通过伤口侵入受损伤的细胞。伤的细胞。如昆虫吸食汁液、嫁接、锄草等方式。如昆虫吸食汁液、嫁接、锄草等方式。 生物合成生物合成包括核酸的复制、转录与蛋白质合成。包括核酸的复制、转录与蛋白质合成。RNA病毒在逆转录酶的催化下，以病毒在逆转录酶的催化下，以RNA为模板，合成为模板，合成一条互补的一条互补的DNA链，这种病毒称为链，这种病毒称为逆转录病毒，大多为肿逆转录病毒，大多为肿瘤病毒，它们的基因中可能含有癌基因。瘤病毒，它们的基因中可能含有癌基因。病毒病毒转录出自己的转录出自己的mRNA后，这些后，这些mRNA即开始合成病即开始合成病毒蛋

21、白质，包括催化毒蛋白质，包括催化DNA或或RNA的复制、转录等过程的酶的复制、转录等过程的酶以及组成病毒的结构以及组成病毒的结构蛋白。蛋白。 装配装配病毒核酸的复制和蛋白质的合成分别在寄主细胞的不同病毒核酸的复制和蛋白质的合成分别在寄主细胞的不同部位完成后，将二者整合到一起成为一个完整、成熟的病毒部位完成后，将二者整合到一起成为一个完整、成熟的病毒粒子。粒子。一些结构较复杂的噬菌体，如前述的大肠杆菌一些结构较复杂的噬菌体，如前述的大肠杆菌T4T4噬菌体噬菌体还需进行头部、尾部、尾丝等的装配。还需进行头部、尾部、尾丝等的装配。 释放释放当宿主细胞中有大量的成熟噬菌体后，病毒即转录并合当宿主细胞中

22、有大量的成熟噬菌体后，病毒即转录并合成脂肪酶和溶菌酶，前者水解细菌细胞膜，后者水解细胞壁，成脂肪酶和溶菌酶，前者水解细菌细胞膜，后者水解细胞壁，从而使细胞裂解。从而使细胞裂解。一个宿主细胞可释放一个宿主细胞可释放出出101 000个噬菌体，高者达上万个噬菌体，高者达上万个。个。温和噬菌体：有一些噬菌体在侵入细胞后，并不会导致温和噬菌体：有一些噬菌体在侵入细胞后，并不会导致细菌裂解，它们甚至长期不增殖，而是随宿主细胞的细菌裂解，它们甚至长期不增殖，而是随宿主细胞的DNADNA一道一道复制的噬菌体；复制的噬菌体；烈性噬菌体：有一些噬菌体在侵入细胞后，进行核酸复烈性噬菌体：有一些噬菌体在侵入细胞后，

23、进行核酸复制、蛋白质合成装配并释放出来使宿主细胞裂解，的噬菌体。制、蛋白质合成装配并释放出来使宿主细胞裂解，的噬菌体。 5、 病毒的抵抗力病毒的抵抗力v病毒受理化因素作用后失去感染性，称为灭活。病毒受理化因素作用后失去感染性，称为灭活。（一）物理因素（一）物理因素v病毒一般耐冷怕热。病毒一般耐冷怕热。60加热加热30min，除肝炎病，除肝炎病毒、腺病毒等抵抗力较强的病毒外，多数病毒即毒、腺病毒等抵抗力较强的病毒外，多数病毒即被灭活。在室温下多数病毒只能存活数小时。病被灭活。在室温下多数病毒只能存活数小时。病毒对低温的抵抗力较强，多数病毒在毒对低温的抵抗力较强，多数病毒在47，可，可存活数小时至

24、数日，超低温存活数小时至数日，超低温(-190-70)下可保下可保存数月至数年，经真空冷冻干燥则保存时间更长，存数月至数年，经真空冷冻干燥则保存时间更长，故低温是保存病毒最有效的方法。故低温是保存病毒最有效的方法。 （二）化学因素（二）化学因素v多数病毒对氧化剂敏感，故常用高锰酸钾、多数病毒对氧化剂敏感，故常用高锰酸钾、过氧化氢、漂白粉、碘酊等进行消毒。过氧过氧化氢、漂白粉、碘酊等进行消毒。过氧乙酸对肝炎病毒杀灭作用较强，石炭酸及来乙酸对肝炎病毒杀灭作用较强，石炭酸及来苏等酚类消毒剂仅对少数病毒有效。乙醚、苏等酚类消毒剂仅对少数病毒有效。乙醚、氯仿和去氧胆酸盐等脂溶剂能破坏有包膜的氯仿和去氧胆

25、酸盐等脂溶剂能破坏有包膜的病毒。甲醛能灭活病毒，而保留其抗原性，病毒。甲醛能灭活病毒，而保留其抗原性，故常用于制备灭活疫苗。大多数病毒对甘油故常用于制备灭活疫苗。大多数病毒对甘油的抵抗力强，故常用的抵抗力强，故常用50甘油盐水保存送检甘油盐水保存送检的病毒材料，以抑制细菌的繁殖。的病毒材料，以抑制细菌的繁殖。6 6、病毒的人工培养与分离纯化、病毒的人工培养与分离纯化（1 1）病毒的人工培养）病毒的人工培养 病毒的培养方法包括：病毒的培养方法包括：v寄主接种寄主接种v鸡胚培养鸡胚培养v细胞培养细胞培养、寄主接种法、寄主接种法 动物接种是分离病毒较早应用的方法，本动物接种是分离病毒较早应用的方法，

26、本法在分离病毒方面，现多数已被组织培养法法在分离病毒方面，现多数已被组织培养法所取代，但在某些对其敏感性强的病毒的分所取代，但在某些对其敏感性强的病毒的分离，或科学研究需要制作离，或科学研究需要制作“动物模型动物模型”方面，方面，至今仍有其重要性。此法有两个缺点：至今仍有其重要性。此法有两个缺点： 动动物本身可能带有病毒；物本身可能带有病毒； 许多病毒具有种属许多病毒具有种属特异性。这些不利因素都限制了它在医学微特异性。这些不利因素都限制了它在医学微生物学中应用。生物学中应用。 动物接种 病毒需严格细胞内寄生，培养病毒必须在活病毒需严格细胞内寄生，培养病毒必须在活的动物、鸡胚或细胞内进行。新城

27、疫病毒的动物、鸡胚或细胞内进行。新城疫病毒（NDV）、流感病毒（）、流感病毒（IFV）等对鸡胚培养敏）等对鸡胚培养敏感，因此常用鸡胚接种法分离培养感，因此常用鸡胚接种法分离培养NDV、IFV等。目前对等。目前对IFV的疫苗制备就是在鸡胚培养中的疫苗制备就是在鸡胚培养中进行的。由于进行的。由于NDV、IFV在鸡胚内培养时并不在鸡胚内培养时并不引起明显的鸡胚病变或死亡，常用血凝和血凝引起明显的鸡胚病变或死亡，常用血凝和血凝抑制试验对病毒进行鉴定。抑制试验对病毒进行鉴定。 、病毒的鸡胚接种法、病毒的鸡胚接种法鸡胚培养鸡胚培养：目前主要用于流感病毒的分离培养。目前主要用于流感病毒的分离培养。 气室卵壳

28、壳膜尿囊腔绒毛尿囊膜胚胎羊膜腔卵黄卵白接种方法接种方法 孵育孵育911天左右的鸡胚，在照蛋灯下用蜡天左右的鸡胚，在照蛋灯下用蜡笔标出气室和胎位；笔标出气室和胎位； 鸡胚直立于蛋盘上，气室端向上，按常规鸡胚直立于蛋盘上，气室端向上，按常规以碘酒，酒精消毒；以碘酒，酒精消毒； 在避开鸡头和大血管的位置，用磨蛋器在在避开鸡头和大血管的位置，用磨蛋器在气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭消毒；气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭消毒； 用用1ml注射器吸取注射器吸取NDV悬液，针头从气室小悬液，针头从气室小孔刺入（沿胚胎的长轴刺入）孔刺入（沿胚胎的长轴刺入）0.5-1cm深度；深度；此时针头已在尿囊腔中，注入此时

29、针头已在尿囊腔中，注入0.2ml病毒悬液；病毒悬液； 拔出针头，用镊子将小胶布蘸取酒精烧灼后拔出针头，用镊子将小胶布蘸取酒精烧灼后封闭小孔，置于封闭小孔，置于3536温箱内培养，其中翻温箱内培养，其中翻动两次，用照蛋灯检视一次，动两次，用照蛋灯检视一次，36小时后置小时后置-20冰箱冰箱20分钟后，无菌操作收获尿囊液。分钟后，无菌操作收获尿囊液。鸡鸡胚胚的的检检卵卵 从冰箱中取出鸡胚，用碘酒、酒精消毒气室部从冰箱中取出鸡胚，用碘酒、酒精消毒气室部位；位； 用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的卵壳；用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的卵壳； 用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸取尿囊用无菌的毛细吸管插

30、入尿囊腔中轻轻吸取尿囊液液(避免血管破裂避免血管破裂)，置于无菌中号试管中；，置于无菌中号试管中； 获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制试验获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制试验（定性），判断病毒的增殖情况并对病毒进行（定性），判断病毒的增殖情况并对病毒进行鉴定；同时做无菌实验。鉴定；同时做无菌实验。 尿囊液的收获尿囊液的收获、病毒的细胞接种法、病毒的细胞接种法细胞制备的操作步骤细胞制备的操作步骤 在在DMEM和和Hanks 液中以液中以1的量加入双抗；的量加入双抗； 取出两只无菌平皿，待用；取出两只无菌平皿，待用； 碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵壳；碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵壳

31、； 大镊子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室外卵壳；大镊子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室外卵壳； 用无菌镊子小心撕破卵膜，取出鸡胚置于盛有用无菌镊子小心撕破卵膜，取出鸡胚置于盛有Hanks 液的平皿中。小心去头、内脏、爪，洗涤后液的平皿中。小心去头、内脏、爪，洗涤后置于盛有置于盛有Hanks 液的平皿中，再充分洗涤液的平皿中，再充分洗涤2次；次； 取出洗净的组织块置于青霉素瓶中，用无菌取出洗净的组织块置于青霉素瓶中，用无菌眼科剪刀将其剪成约眼科剪刀将其剪成约0.51mm3的小块（约的小块（约250次）此时体积约次）此时体积约0.5ml；用；用Hanks 液洗涤液洗涤两次；两次； 加入加入1.0胰酶，配

32、成终浓度为胰酶，配成终浓度为0.25%，并调，并调节节pH至约至约7.68.0（肉眼观为肉红色）。盖（肉眼观为肉红色）。盖上瓶塞，写好标记；上瓶塞，写好标记； 将上述青霉素瓶置于将上述青霉素瓶置于37水浴中约水浴中约1530min，其间缓慢摇匀以充分消化；，其间缓慢摇匀以充分消化； 消消化化结结束束后后，稍稍沉沉淀淀，缓缓慢慢吸吸出出上上清清，用用Hanks 液液小小心心洗洗涤涤沉沉淀淀23次次，尽尽量量减减少少胰胰酶酶的的残残留留量量，然然后后加加入入DMEM液液约约5ml，吸吸管管充充分分吹吹打打，使使细细胞胞充充分分分分散散。吸吸上上清清；重重复复操操作作34次次，收收集集细细胞胞上上清

33、清，并并加加入入足足量量的的小小牛牛血血清清（终终浓浓度度为为10）； 将上述制备好的细胞悬液移至细胞瓶中，将上述制备好的细胞悬液移至细胞瓶中，5ml/瓶。瓶。 细胞消化后轻轻摇细胞消化后轻轻摇晃，呈云雾状，表晃，呈云雾状，表示消化良好示消化良好。（2）病毒的分离纯化）病毒的分离纯化 病毒的分离纯化利用了病毒的多种性质。毒病毒的分离纯化利用了病毒的多种性质。毒粒主要成份为蛋白质，通常比正常细胞的组分粒主要成份为蛋白质，通常比正常细胞的组分稳定，而且具有表面蛋白。因此，许多用于分稳定，而且具有表面蛋白。因此，许多用于分离蛋白质和细胞器的技术也可用于病毒的分离。离蛋白质和细胞器的技术也可用于病毒的

34、分离。其中，应用得最为广泛的四种技术是：其中，应用得最为广泛的四种技术是：v差速和密度梯度离心；差速和密度梯度离心；v病毒沉淀法；病毒沉淀法；v杂质变性法；杂质变性法；v细胞组分的酶消化法。细胞组分的酶消化法。 v 差速和密度梯度离心 原材料原材料 裂解裂解 悬浮液或匀浆悬浮液或匀浆 高速离心高速离心 比病毒重的物质弃去比病毒重的物质弃去 上清液弃去上清液弃去 含病毒的上清液含病毒的上清液 低速离心低速离心 病毒和大的颗粒病毒和大的颗粒 高速离心高速离心 粗病毒粗病毒 浓度梯度蔗糖溶液浓度梯度蔗糖溶液 病病 毒纯品毒纯品 20冷冻冷冻 病毒沉淀法病毒沉淀法v 和多种蛋白质的纯化一样，可用浓缩的

35、硫酸盐和多种蛋白质的纯化一样，可用浓缩的硫酸盐沉淀法纯化病毒。首先，加入饱和硫酸铵使浓度沉淀法纯化病毒。首先，加入饱和硫酸铵使浓度达到恰好低于病毒被沉淀析出的水平。去除析出达到恰好低于病毒被沉淀析出的水平。去除析出的杂质再加入硫酸铵，析出的病毒沉淀离心收集。的杂质再加入硫酸铵，析出的病毒沉淀离心收集。对硫酸铵敏感的病毒则可用聚乙二醇沉淀法纯化。对硫酸铵敏感的病毒则可用聚乙二醇沉淀法纯化。杂质变性法杂质变性法v 与正常的细胞组分相比较，病毒往往不易变性。与正常的细胞组分相比较，病毒往往不易变性。热处理或改变热处理或改变pH可使杂质变性沉淀，从而纯化病可使杂质变性沉淀，从而纯化病毒。由于某些病毒还

36、能耐受丁醇和氯仿等有机溶毒。由于某些病毒还能耐受丁醇和氯仿等有机溶剂的处理，所以利用有机溶剂处理不仅可以使杂剂的处理，所以利用有机溶剂处理不仅可以使杂质蛋白变性沉淀，还能抽提出提纯材料中的脂。质蛋白变性沉淀，还能抽提出提纯材料中的脂。细胞组分的酶消化法 v 因为病毒比游离的核酸和蛋白质更耐受核酸酶和蛋白酶的降解，所以通过酶促降解法可以将多种病毒材料中的细胞蛋白和核酸除去。例如，核酸核糖酶和胰蛋白酶常可降解细胞的核糖核酸和蛋白质，但不能降解毒粒。 二、病毒的干扰现象与干扰素二、病毒的干扰现象与干扰素 （一）干扰现象（一）干扰现象 两种病毒同时或短时间内先后感染同一细胞两种病毒同时或短时间内先后感

37、染同一细胞时，其中一种病毒可以抑制另一种病毒增殖的现时，其中一种病毒可以抑制另一种病毒增殖的现象，称为病毒的象，称为病毒的干扰现象干扰现象。v干扰现象可发生于异种病毒之间，也可发生于同干扰现象可发生于异种病毒之间，也可发生于同种异型病毒间，甚至灭活的病毒可干扰同株的活种异型病毒间，甚至灭活的病毒可干扰同株的活病毒，如脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗病毒，如脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗I型可干扰型可干扰、型。通常是死病毒干扰活病毒，先进入细型。通常是死病毒干扰活病毒，先进入细胞的病毒排斥、干扰后进入的病毒，数量多的、胞的病毒排斥、干扰后进入的病毒，数量多的、增殖快的病毒干扰数量少的、增殖慢的病毒，这增殖快的

38、病毒干扰数量少的、增殖慢的病毒，这多见于异种病毒之间。多见于异种病毒之间。 （二）干扰素v产生干扰现象的原因主要是宿主细胞感染病毒产生干扰现象的原因主要是宿主细胞感染病毒后诱生了干扰素，它能保护宿主细胞免受另外后诱生了干扰素，它能保护宿主细胞免受另外病毒的感染。病毒的感染。 1、干扰素的种类、干扰素的种类v干扰素干扰素(interferon，IFN)是由大多数脊椎动物是由大多数脊椎动物细胞受病毒或其他因子细胞受病毒或其他因子(诱导剂诱导剂)诱导产生的低诱导产生的低分子蛋白质。分子蛋白质。v根据干扰素的来源，人细胞诱生的干扰素有根据干扰素的来源，人细胞诱生的干扰素有、和和三种类型。三种类型。 2

39、 2、干扰素的性质、干扰素的性质v干扰素是一组糖蛋白分子。分子量约干扰素是一组糖蛋白分子。分子量约15000-2500015000-25000，是可溶性的，无毒，抗原性很弱的物质；对蛋白分解是可溶性的，无毒，抗原性很弱的物质；对蛋白分解酶酶( (如胰蛋白酶如胰蛋白酶) )敏感，但对脂酶和核酸酶不敏感；此敏感，但对脂酶和核酸酶不敏感；此外，外，干扰素还具有下列特性干扰素还具有下列特性；无抗病毒特异性，即无抗病毒特异性，即有广谱抗病毒作用，也就是说，一种病毒诱生的干扰有广谱抗病毒作用，也就是说，一种病毒诱生的干扰素可对多种病毒起作用；素可对多种病毒起作用；干扰素有高度种属特异性，干扰素有高度种属特

40、异性，如人或灵长类动物细胞产生的干扰素才能对人细胞发如人或灵长类动物细胞产生的干扰素才能对人细胞发挥抗病毒作用，而对其他动物的细胞无作用；挥抗病毒作用，而对其他动物的细胞无作用；干扰干扰素有抑制细胞分裂、分化及成熟的作用，可用于肿瘤素有抑制细胞分裂、分化及成熟的作用，可用于肿瘤的治疗；的治疗；干扰素有活化巨噬细胞及抑制细胞内寄生干扰素有活化巨噬细胞及抑制细胞内寄生物的作用；物的作用；干扰素的抗病毒作用与抗体不同，它不干扰素的抗病毒作用与抗体不同，它不是直接杀死或中和病毒，而是干扰素与细胞相互作用，是直接杀死或中和病毒，而是干扰素与细胞相互作用，而是产生抗病毒蛋白质这一介质抑制病毒蛋白的合成。而

41、是产生抗病毒蛋白质这一介质抑制病毒蛋白的合成。 3、干扰素的诱生与抗病毒机理、干扰素的诱生与抗病毒机理 图 干扰素作用模式图 4、干扰素的作用、干扰素的作用v病毒感染时，产生的干扰素可阻止、中断病毒增殖，病毒感染时，产生的干扰素可阻止、中断病毒增殖，从而中断发病；若疾病已经发生，在产生足够保护从而中断发病；若疾病已经发生，在产生足够保护性抗体之前，干扰素可使机体恢复健康。在防治病性抗体之前，干扰素可使机体恢复健康。在防治病毒性疾病方面，可通过调节疫苗用量或分期接种疫毒性疾病方面，可通过调节疫苗用量或分期接种疫苗，避免产生干扰现象，使之达到预期的免疫效果。苗，避免产生干扰现象，使之达到预期的免疫

42、效果。例如两次预防接种之间要间隔足够的时间。例如两次预防接种之间要间隔足够的时间。 v干扰素有广泛的抗病毒作用，现已作为一种抗病毒干扰素有广泛的抗病毒作用，现已作为一种抗病毒药物在临床上使用，但存在着来源困难和不易纯化药物在临床上使用，但存在着来源困难和不易纯化等问题。这些问题正逐渐由基因工程和单克隆抗体等问题。这些问题正逐渐由基因工程和单克隆抗体的应用得到解决。的应用得到解决。 三、病毒的致病性三、病毒的致病性（一）病毒感染的途径（一）病毒感染的途径v病毒侵入机体的途径与细菌类似，其侵入途病毒侵入机体的途径与细菌类似，其侵入途径有：径有：呼吸道感染，如流感病毒、麻疹病呼吸道感染，如流感病毒、

43、麻疹病毒等；毒等；消化道感染，如肠道病毒、甲型肝消化道感染，如肠道病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等；炎病毒、脊髓灰质炎病毒等；经胎盘或产经胎盘或产道感染，如风疹病毒、乙型肝炎病毒等；道感染，如风疹病毒、乙型肝炎病毒等；接触感染，如艾滋病毒等；接触感染，如艾滋病毒等；媒介昆虫叮咬媒介昆虫叮咬感染，如流行性乙型脑炎病毒、登格热病毒感染，如流行性乙型脑炎病毒、登格热病毒等；等；动物咬伤感染，如狂犬病毒。动物咬伤感染，如狂犬病毒。 （二）病毒感染的类型（二）病毒感染的类型v隐性感染与显性感染隐性感染与显性感染 v先天感染与后天感染先天感染与后天感染 （三）病毒的致病机理（三）病毒的致病机理 v病毒

44、对细胞的直接致病作用病毒对细胞的直接致病作用 v机体的免疫应答引起的免疫病理作用机体的免疫应答引起的免疫病理作用 v病毒感染与肿瘤病毒感染与肿瘤 （四）常见致病性病毒（四）常见致病性病毒 v1、呼吸道病毒、呼吸道病毒 v2、肠道病毒、肠道病毒 v3、肝炎病毒、肝炎病毒v4、人类免疫缺陷病毒、人类免疫缺陷病毒v5、SARS病毒病毒四、四、 噬菌体噬菌体（一）噬菌体的形态结构（一）噬菌体的形态结构 侵染原核生物的病毒称为噬菌体。侵染原核生物的病毒称为噬菌体。蝌蚪形噬菌体的头部呈蝌蚪形噬菌体的头部呈球形、二十面体对称，球形、二十面体对称，由蛋白质外壳包绕核心由蛋白质外壳包绕核心(DNA或或RNA)组

45、成。尾组成。尾部是噬菌体与宿主菌体部是噬菌体与宿主菌体细胞接触的部分，由尾细胞接触的部分，由尾领、尾髓、尾鞘、尾板、领、尾髓、尾鞘、尾板、尾刺和尾丝组成尾刺和尾丝组成。 图蝌蚪形噬菌体模式图（二）噬菌体的繁殖（二）噬菌体的繁殖 病毒粒子并无个体的生长过程，而只有其两种基病毒粒子并无个体的生长过程，而只有其两种基本成分的合成和装配，即：核酸复制本成分的合成和装配，即：核酸复制+蛋白质合成蛋白质合成生成核蛋白（病毒粒子）。噬菌体的繁殖一般可分生成核蛋白（病毒粒子）。噬菌体的繁殖一般可分五个阶段，即吸附、侵入、增殖（复制与生物合成）五个阶段，即吸附、侵入、增殖（复制与生物合成）、成熟（装配）和裂解（

46、释放）。、成熟（装配）和裂解（释放）。 根据噬菌体与宿主的关系可分为烈性噬菌体和根据噬菌体与宿主的关系可分为烈性噬菌体和温和噬菌体两大类。温和噬菌体两大类。 噬菌斑：由于噬菌体的作用而使布满细菌细胞噬菌斑：由于噬菌体的作用而使布满细菌细胞的菌苔上，出现肉眼可见的一个个透亮的小圆斑。的菌苔上，出现肉眼可见的一个个透亮的小圆斑。 噬菌体效价：每毫升试样中所含的侵染性的噬噬菌体效价：每毫升试样中所含的侵染性的噬菌体粒子数，也即噬菌斑形成单位数。菌体粒子数，也即噬菌斑形成单位数。噬菌体吸附吸附影响因素：噬菌体数量；阳离子；辅助因子；温度。噬菌体装配过程v释放v 细胞裂解释放：当噬菌体成熟时，溶解寄主细

47、胞壁的溶菌酶逐渐增加，致使细胞裂解，从而释放出大量的子代噬菌体。 噬菌体增殖过程（三）一步生长曲线（三）一步生长曲线这种用来测定噬菌体侵染和成熟病毒体释放的时间间隔，并用这种用来测定噬菌体侵染和成熟病毒体释放的时间间隔，并用以估计每个被侵染的细胞释放出来的新的噬菌体粒子的数量的以估计每个被侵染的细胞释放出来的新的噬菌体粒子的数量的生长曲线，称为一步生长曲线。生长曲线，称为一步生长曲线。I.潜伏期隐晦期胞内积累期II.裂解期III.平稳期将低剂量的噬菌体悬液加入敏感细菌的培养液中，使得一个病毒与10-100个细菌细胞相混合。经过短时间的培养使噬菌体吸附在细菌上，再用抗体或稀释去掉未吸附上的噬菌体

48、。用新鲜培养液把经过上述处理的细菌悬液高倍稀释。培养后定时取样，将含有噬菌体的样品与敏感细菌培养物混合培养，计算每个样品在培养基平板表面产生的噬菌斑数目。以培养时间为横坐标，噬菌斑为纵坐标，可以绘出一步生长曲线。（四）溶原细胞（四）溶原细胞 含有温和噬菌体的细胞称为溶原细菌（或溶原含有温和噬菌体的细胞称为溶原细菌（或溶原细胞）。整和在宿主染色体上的噬菌体核酸称为细胞）。整和在宿主染色体上的噬菌体核酸称为前噬菌体。前噬菌体。溶原细菌的特点：溶原细菌的特点：可以自发或人工诱发变为烈性噬菌体；可以自发或人工诱发变为烈性噬菌体； 溶原细胞可失去噬菌体的核酸后复愈；溶原细胞可失去噬菌体的核酸后复愈； 溶

49、细菌对同源噬菌体的感染具有免疫性；溶细菌对同源噬菌体的感染具有免疫性； 某些容原细菌可以合成特殊的代谢产物，如白某些容原细菌可以合成特殊的代谢产物，如白喉杆菌只有在被噬菌体感染后形成容原细菌后才喉杆菌只有在被噬菌体感染后形成容原细菌后才能产生白喉毒素。能产生白喉毒素。温和噬菌体及其溶原化温和噬菌体及其溶原化五、病毒与实践五、病毒与实践1、 病毒在基因工程中的应用病毒在基因工程中的应用v噬菌体作为原核生物基因工程的载体噬菌体作为原核生物基因工程的载体vE.coli的的噬菌体，是目前研究的最为详尽的噬菌体，是目前研究的最为详尽的噬菌体。作为遗传工程载体有很多优点。噬菌体。作为遗传工程载体有很多优点

50、。（1 1）遗传背景十分清楚；）遗传背景十分清楚；（2 2）载有外源遗传因子的重组）载有外源遗传因子的重组噬菌体；噬菌体；（3 3）宿主范围狭窄，使用安全。）宿主范围狭窄，使用安全。（4 4）-DNA-DNA的两端具有的两端具有1212核苷酸组成的粘性末核苷酸组成的粘性末端，可用以构建科斯质粒；端，可用以构建科斯质粒；（5 5）噬菌体及由他构建成的载体感染效率几噬菌体及由他构建成的载体感染效率几乎达到乎达到100%100% 。v动物动物DNA病毒作为动物基因工程的载体病毒作为动物基因工程的载体v可作为载体的动物病毒有可作为载体的动物病毒有SV40、人的腺病、人的腺病毒、牛乳头瘤病毒、痘苗病毒载

51、体及毒、牛乳头瘤病毒、痘苗病毒载体及RNA病病毒等，以毒等，以SV40研究最多。研究最多。v 植物病毒作为基因遗传共的载体植物病毒作为基因遗传共的载体v目前研究最多的是花椰菜花叶病毒。目前研究最多的是花椰菜花叶病毒。v昆虫昆虫DNA病毒作为镇和翁五基因工程的载体病毒作为镇和翁五基因工程的载体v昆虫杆状病毒的许多优点：昆虫杆状病毒的许多优点：（1）具有在细胞核内复制的）具有在细胞核内复制的DNA；（2）不侵染脊椎动物，所以对人畜安全；）不侵染脊椎动物，所以对人畜安全；（3）核型多角体蛋白基因表达产物多；）核型多角体蛋白基因表达产物多；（4）外源）外源DNA的插入不影响病毒繁殖，却丧失的插入不影响

52、病毒繁殖，却丧失了形成多角题的能力，因此可以作为重组病毒了形成多角题的能力，因此可以作为重组病毒的选择标记。的选择标记。（5）对外源基因有很大容量，）对外源基因有很大容量，100kb片断。片断。（6）有强启动子作为病毒的晚期启动子，所以）有强启动子作为病毒的晚期启动子，所以任何外源基因产物也不影响病毒的繁殖和传代。任何外源基因产物也不影响病毒的繁殖和传代。2、昆虫病毒用于生物防治、昆虫病毒用于生物防治v昆虫病毒用于生物防治的优点：昆虫病毒用于生物防治的优点：（1）致病力强，使用量少；）致病力强，使用量少；（2）专一性强，安全可靠；）专一性强，安全可靠；（3）抗逆性强，作用长久；）抗逆性强，作用

53、长久；（4）生产简便，成本低廉。）生产简便，成本低廉。3、噬菌体与发酵工业、噬菌体与发酵工业v当发酵液受噬菌体严重污染时会出现的现象：当发酵液受噬菌体严重污染时会出现的现象：（1）发酵周期明显延长；）发酵周期明显延长；（2）碳源消耗缓慢；）碳源消耗缓慢；（3）发酵液变清，镜检有大量异常菌体出现。）发酵液变清，镜检有大量异常菌体出现。（4）发酵产物的形成缓慢或根本不形成；）发酵产物的形成缓慢或根本不形成；（5）用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑；）用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑；（6）用电子显微镜观察时，可见到有无数噬菌体）用电子显微镜观察时，可见到有无数噬菌体粒子存在。粒子存在。v预防

54、噬菌体污染的措施预防噬菌体污染的措施（1）决不使用可疑菌种；）决不使用可疑菌种；（2）严格保持环境卫生；）严格保持环境卫生；（3）决不排放或随便丢弃活菌液；）决不排放或随便丢弃活菌液；（4）注意通气质量；）注意通气质量；（5）加强管道及发酵罐的灭菌；）加强管道及发酵罐的灭菌；（6）不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种；）不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种；（7）严格执行会客制度。）严格执行会客制度。v一旦污染噬菌体，及时采取合理措施一旦污染噬菌体，及时采取合理措施（1）尽快提取产品，产物含量高及时提取或不）尽快提取产品，产物含量高及时提取或不加营养并接种抗噬菌体菌种后再继续发酵。加营养并接种抗噬菌体菌种后再继续发酵。（2）使用药物抑制。在谷氨酸发酵中，加入某）使用药物抑制。在谷氨酸发酵中，加入某些金属螯合剂可抑制噬菌体的吸附和侵入；些金属螯合剂可抑制噬菌体的吸附和侵入；加入加入1-2ug/ml金霉素、四环素或氯霉素等抗金霉素、四环素或氯霉素等抗生素或生素或0.1%-0.2%的吐温的吐温60、20或聚养乙烯或聚养乙烯烷基醚等表面活性剂均可抑制噬菌体的增值烷基醚等表面活性剂均可抑制噬菌体的增值或吸附；或吸附；（3）及时改用抗噬菌体生产菌株。）及时改用抗噬菌体生产菌株。