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1、细胞培养的个人体会如何做好实验？如何做好实验？ “播下一种习惯，你将收获一种性格；播下一种习惯，你将收获一种性格； 播下一种性格，你将收获一种命运播下一种性格，你将收获一种命运”。 威廉威廉. .詹姆士詹姆士个人体会：个人体会：题外话：题外话： 1、 “养成良好的实验习惯养成良好的实验习惯”。实验前：查资料，计划好，充分准备。实验前：查资料，计划好，充分准备。实验中：认真操作，关键点作好记录。实验中：认真操作，关键点作好记录。 （可写在草稿本上）。（可写在草稿本上）。实验后：整理实验物品，用过的东西要放回原位，实验后：整理实验物品，用过的东西要放回原位， 及时清理垃圾，及时清理垃圾， 抽空根据
2、草稿本详细写下实验记录。抽空根据草稿本详细写下实验记录。 （写在实验记录本上）（写在实验记录本上） 实验其间，听从老师和师兄、师姐的安排和管理！实验其间，听从老师和师兄、师姐的安排和管理！ 2、“养成独立思考、独立解决问题的习惯养成独立思考、独立解决问题的习惯” 全面提高自己的能力，力求能独挡一面。遇到问题，全面提高自己的能力，力求能独挡一面。遇到问题，首先自己想办法去解决。首先自己想办法去解决。3、“养成良好的心态养成良好的心态” “雄心雄心” : 有抱负和理想，做好文章。有抱负和理想，做好文章。 “恒心恒心” ：坚持。：坚持。 “平常心平常心” ：从容淡定，慢而不拖，快而不乱：从容淡定，慢
3、而不拖，快而不乱.4、 “苦干苦干 + + 巧干巧干” 苦干：多练习，熟能生巧。苦干：多练习，熟能生巧。“做做” 巧干：多总结，掌握规律。巧干：多总结，掌握规律。“思思”内容提要1.细胞培养简介2.细胞的复苏和冻存细胞的复苏细胞的冻存3.细胞的换液与传代个人方法无菌操作技术细胞计数和接种体外培养（invitroculture）：是将活体成分或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。可分为器官培养、组织培养、细胞培养三种类型。细胞培养分为原代培养和传代培养。体外培养体外培养简化环境因素、排除了体内实验时一些复杂的因素的影响，利于应用各种物理、化学和生物等外界因素
4、探索和提示细胞生命活动的规律；提供了大量生物性状相同的细胞，特别是人的活细胞材料作为研究对象。经济、便利，解决了不能用人做实验的问题。缺点是无法模拟体内的情况，结果有局限性。细胞培养的特点细胞培养的特点CO2CO2培养箱培养箱细胞培养基本设备细胞培养基本设备定期清洁，换水。定期清洁，换水。拿出细胞及时关好门，保持拿出细胞及时关好门，保持CO2浓度。浓度。短时不用，将光源调至最小，避免短时不用，将光源调至最小，避免 反复开关。反复开关。长时不用，及时关电源。长时不用，及时关电源。使用注意问题：使用注意问题：倒置显微镜倒置显微镜超净工作台超净工作台使用前紫外照使用前紫外照20-3020-30分钟。
5、分钟。使用时别忘关紫外，防止灼伤。使用时别忘关紫外，防止灼伤。定期换水，保持干净的水。定期换水，保持干净的水。使用前检查水位，不足补充纯水。使用前检查水位，不足补充纯水。最好细胞培养专用一个灭菌锅。最好细胞培养专用一个灭菌锅。使用注意问题：使用注意问题：高压灭菌锅高压灭菌锅1.培养瓶、培养管、细胞培养板、蓝盖瓶、吸管；2.离心管、细胞冻存管、1ml、5mlEP管；3.血细胞计数器；4.恒温磁力搅拌器、恒温水浴振荡器；5.刀、剪、镊解剖用具，200目不锈钢网；细胞培养的基本用品细胞培养的基本用品l大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和与血清中浓度相似的营养物质。l
6、选择培养基很重要，不同细胞需要适合的培养基。l常见的培养基有：DMEM、F12、DMEM/F12、1640等。基础培养基血 清l一般是从牛的血液中提取，含有丰富的营养养物质。l常用的胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS),使用前分装50ml离心管，-20保存。注意解冻分装前请混合均匀。l使用时放在4冰箱解冻，需1-2天。完全培养基l血清和基础培养基按一定比例混合，一般配制含10-15%血清的培养基，用于细胞培养。l如取20ml胎牛血清，同时加入180mlDMEM基础培养基，即可配成200ml含10%胎牛的DMEM.1.器皿加洗洁精浸泡数小时后，用自来水冲洗器皿加洗洁精浸泡数小时后
7、，用自来水冲洗9次，次， 然后蒸馏水冲洗然后蒸馏水冲洗3次次。2.烘干：洗干净后烘干。烘干：洗干净后烘干。3.包装：用牛皮纸或布包装。包装：用牛皮纸或布包装。 消毒前贴上灭菌条，条上写明日期、物品、所有者。消毒前贴上灭菌条，条上写明日期、物品、所有者。 可重复利用物品的清洗和灭菌可重复利用物品的清洗和灭菌4.高压高压灭菌灭菌：包装好的器皿装入高压锅内，：包装好的器皿装入高压锅内，121 ， 维持维持30分钟。分钟。5.灭菌后烘干：高压消毒后器皿会被蒸气打湿，要放入灭菌后烘干：高压消毒后器皿会被蒸气打湿，要放入烤箱内烘干备用。烤箱内烘干备用。 注意：泡酸（重铬酸钾注意：泡酸（重铬酸钾120g：浓
8、硫酸：浓硫酸200ml：蒸馏水：蒸馏水 1000ml）浸泡）浸泡12小时。小时。（玻璃器皿第一次洗需要用，以后可以省这一步）。（玻璃器皿第一次洗需要用，以后可以省这一步）。细胞的复苏和冻存细胞的复苏和冻存l细胞复苏与冻存的原则是“慢冻速融”。l复苏细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50。l冻存细胞时，向培养基中加入保护剂二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，减少细胞冰晶的形成。复苏与冻存的原则复苏与冻存的原则1、准备好37水浴烧杯。2、将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入3740水浴中使其在1min内融化。3、无菌条件下打开冻存管
9、，取细胞悬液至离心管中，补加5mL培养液，1600rpm低速离心5min。4、去上清，加入新鲜培养液适量，吹打成细胞悬液，转入培养瓶中，置37培养。复苏的标准方法复苏的标准方法个人方法复苏前，准备好含有5mL培养基的培养瓶，放入37培养箱。1、准备好40水浴烧杯。2、将冻存于液氮中的冻存管取出，还原保存盒放入液氮中。将取出冻存管迅速放入水浴中，迅速摇晃加速其融化，放在水浴中，5min钟内须完成。3、将冻存管放入15mL离心管（剪去底部的旧离心管）中，1500rpm，离心3min。4、从离心管中取出冻存管，小心吸去上清，从培养箱中取出培养瓶，加入37的培养液1mL，吹打30次，转入培养瓶中，置3
10、7培养。1、胰酶消化，加含血清培养基终止，离心。2、去上清，加入冻存液，吹打60次，转入冻存管。3、冻存管放入430分钟-2060分钟-8016-18小时(或隔夜)-投入液氮中。3、或冻存管置于程序降温盒中，放置-80，-投入液氮中。冻存的个人方法冻存的个人方法：附：冻存液个人配方：附：冻存液个人配方： 培养基：血清：培养基：血清：DMSO 普通细胞可用：普通细胞可用： 7份：份： 2份：份： 1份份 细胞脆弱可用：细胞脆弱可用： 5份：份： 份：份： 份份细胞的换液和传代细胞的换液和传代贴壁期潜伏期:5-24h对数生长期:24-96h停止期（衰老期）:96h以上贴壁生长细胞的生长过程贴壁生长
11、细胞的生长过程新鲜培养基新鲜培养基 对数期对数期 停止期停止期 （红）（红） （淡红（淡红 略黄）略黄） （黄）（黄）贴壁生长细胞的换液贴壁生长细胞的换液全换液：完全吸除瓶内旧培养液，向瓶内加入约4-6mL培养液。置37培养，适合于普通细胞。半换液：吸除瓶内一半的旧培养液，向瓶内补加入约3mL培养液。置37培养。适合于生长较慢的细胞。当细胞没有满细胞培养瓶时，而培养基颜色变成略黄当细胞没有满细胞培养瓶时，而培养基颜色变成略黄状态时，说明营养消耗不少，环境酸性较强，为减少状态时，说明营养消耗不少，环境酸性较强，为减少其对细胞损伤，须对细胞补充新鲜培养基。其对细胞损伤，须对细胞补充新鲜培养基。死细
12、胞较多时，需要除掉死细胞。死细胞较多时，需要除掉死细胞。换液时机：换液时机：换液方法：换液方法：1.细胞铺满瓶底80%，吸除瓶内旧培养液，向瓶内加入少量约12mL消化液（一般含胰蛋白酶、EDTA），轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面；2.在37环境下孵育1-2min，把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大。3.加入含血清培养基，终止消化，用弯头吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使之脱落，吹打成细胞悬液。4.转入离心管，1000-2000rpm，离心5min。5.去上清，加入新鲜培养液适量，吹打成细胞悬液，以1：2或1：3的比例接种在新的培养瓶内，置37培养。传代的标
13、准方法传代的标准方法1.细胞铺满瓶底约80%，吸除旧培养液，向瓶内加入600uL胰酶，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍细胞表面；2.吸除胰酶，在培养箱中孵育1-2min，把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大。3.加入新鲜培养液2mL，吹打成细胞悬液，以1：2或1：3的比例接种在新的培养瓶内（已预加新鲜培养基3ml)，置37培养。(比标准方法省2步)传代的个人方法传代的个人方法( (消化消化+ +机械吹打）机械吹打）细节决定成败，要注意的细节很多。细节决定成败，要注意的细节很多。详细的内容可参考详细的内容可参考“细胞培养无菌技术细胞培养无菌技术”PPT、视频、视频。 无菌操作技术
14、（关键技术）个人体会：个人体会：1.1.特别注意特别注意Vulnerable areas，吸管吸取液体时尽量不接吸管吸取液体时尽量不接触瓶口触瓶口。2.2.尽量避免在培养皿和所有瓶口的上方操作。尽量避免在培养皿和所有瓶口的上方操作。3.3.同一根吸管不应连续用于两个不同的液体或细胞系。同一根吸管不应连续用于两个不同的液体或细胞系。4.4.只要吸管接触瓶外面任何地方都要丢弃，换新管。只要吸管接触瓶外面任何地方都要丢弃，换新管。常见细胞污染A:A:正常正常B:B:杆状细菌污染杆状细菌污染C:C:球状细菌污染球状细菌污染D:D:丝状真菌污染丝状真菌污染E:E:酵母污染酵母污染1 1号区号区5 5号区
15、号区细胞计数细胞计数1 1、使用计数板人工计数、使用计数板人工计数2 2、使用自动细胞计数仪电脑计数、使用自动细胞计数仪电脑计数细胞密度细胞密度 = (1+2+3+4) / 4 万个细胞每毫升万个细胞每毫升1 13 34 42 22 2合适细胞密度是实验成功关键合适的细胞培养液体积常用细胞接种密度计算常见问题：常见问题： 现有现有4ml4ml细胞悬液，细胞计数的结果为细胞悬液，细胞计数的结果为110110万个万个/ml/ml，现在要接种到现在要接种到9696孔板中，若每孔孔板中，若每孔2 2万个细胞，请问如何万个细胞，请问如何配制实验所需的细胞悬液配制实验所需的细胞悬液? ?传统算法：传统算法
16、： 本来是本来是9696孔，实际要多预留一些，若多算孔，实际要多预留一些，若多算1010孔的话，共孔的话，共106106孔。孔。 1 1、所需总细胞数：、所需总细胞数：2 2万万 X 106 = 212X 106 = 212万万 2 2、所需总体积：、所需总体积： 就是说要把就是说要把212212万个细胞放入总体积培养基中。万个细胞放入总体积培养基中。 需要取需要取212212万除以万除以110110万个细胞悬液，万个细胞悬液， 补加培养基。混匀后，每孔加入补加培养基。混匀后，每孔加入100ul.100ul.个人体会：个人体会： 所需细胞悬液为：配制的总体积除以稀释倍数即可所需细胞悬液为：配制的总体积除以稀释倍数即可 细胞悬液稀释倍数细胞悬液稀释倍数:110:110万万/ml/ml除以除以2 2万倍万倍 所以需要取所以需要取 除以倍的细胞悬液。除以倍的细胞悬液。 补加培养基。混匀后，每孔加入补加培养基。混匀后，每孔加入100ul.100ul. 原理自己慢慢想！原理自己慢慢想！个人体会：个人体会： 所需所需NGFNGF储存液为：配制的总体积除以稀释倍数即可储存液为：配制的总体积除以稀释倍数即可 所以需要取所以需要取 除以除以200200倍的倍的NGFNGF储存液。储存液。 补加培养基。混匀后，每孔加入补加培养基。混匀后，每孔加入500ul.500ul.
