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1、第八章第八章 生殖毒理学生殖毒理学反应停事件反应停事件 指外来化学物对雄性和雌性生殖功能或指外来化学物对雄性和雌性生殖功能或能力的损害和对后代的有害影响。能力的损害和对后代的有害影响。 生殖毒性生殖毒性 表现为外源化学物对生殖过程的影响。表现为外源化学物对生殖过程的影响。包括：包括：生殖器官及内分泌系统的变化。生殖器官及内分泌系统的变化。对性周期和性行为的影响。对性周期和性行为的影响。对生育力和妊娠结局的影响等。对生育力和妊娠结局的影响等。 指应用毒理学方法研究外源化学物对生殖系指应用毒理学方法研究外源化学物对生殖系统损害作用原因、机制和后果，并为防治化学物统损害作用原因、机制和后果，并为防治
2、化学物对人类生殖功能的危害提供依据和措施的一门科对人类生殖功能的危害提供依据和措施的一门科学。学。生殖毒理学生殖毒理学第一节第一节 雄性生殖毒性及其评定雄性生殖毒性及其评定精子的发生过程是在神经精子的发生过程是在神经内分泌调控下进行的：内分泌调控下进行的：黄体生成素：刺激睾丸黄体生成素：刺激睾丸间质细胞发育，分泌雄间质细胞发育，分泌雄性激素，主要是睾酮性激素，主要是睾酮-可可促进精细胞的增殖分化及促进精细胞的增殖分化及维持性功能。维持性功能。卵泡刺激素：促进睾丸卵泡刺激素：促进睾丸内精子的发生。内精子的发生。一、雄性生殖细胞的发生过程一、雄性生殖细胞的发生过程睾丸的功能睾丸的功能: :生成精子
3、生成精子和和合成雄性激素合成雄性激素精子的生成有赖于下丘脑精子的生成有赖于下丘脑垂体垂体睾丸轴睾丸轴 的调节功能。的调节功能。二、雄性生殖系统毒性二、雄性生殖系统毒性雄性生殖雄性生殖系统受损系统受损化学物可直接影响睾丸的功能或化学物可直接影响睾丸的功能或间接影响下丘脑间接影响下丘脑- -垂体垂体- -睾丸轴调睾丸轴调节功能节功能( (一一) )对内分泌功能的影响对内分泌功能的影响调节下丘脑调节下丘脑- -垂体垂体- -睾丸轴的主要反馈机制睾丸轴的主要反馈机制注注：GnRHGnRH：促促性性腺腺激激素素释释放放激激素素；LHLH：黄黄体体生生成成素素；FSHFSH：卵卵泡泡刺刺激激素素；PRLP
4、RL：催催乳乳素素；T T：睾睾酮酮；E2E2：雌雌二二醇醇；GCGC：生生殖殖细细胞胞；SCSC：支支持持细细胞胞；LCLC：间质细胞间质细胞促性腺激素促性腺激素释放激素释放激素黄体生黄体生成素成素卵泡刺卵泡刺激素激素间质间质细胞细胞支持支持细胞细胞生殖生殖细胞细胞( (二二) )对睾丸细胞的影响对睾丸细胞的影响生精细胞生精细胞支持细胞支持细胞间质细胞间质细胞睾丸中主要含有三种细胞：睾丸中主要含有三种细胞：1.1.生精细胞生精细胞(1)(1)对精子发生的影响对精子发生的影响(2)(2)对成熟精子的影响对成熟精子的影响精子精子DNADNA损伤损伤对精子运动的影响对精子运动的影响2.2.支持细胞
5、支持细胞 支持细胞参与构成血支持细胞参与构成血- -睾屏障、维持有利于精睾屏障、维持有利于精子发生适宜的环境，还具有重要的内分泌功能和子发生适宜的环境，还具有重要的内分泌功能和介导生精细胞的凋亡。介导生精细胞的凋亡。3.3.间质细胞间质细胞 细胞受损可直接影响雄性激素的细胞受损可直接影响雄性激素的合成和分泌。合成和分泌。 雄性发育应具备的雄性发育应具备的基本条件为：基本条件为：p正常的内分泌系统。即下丘脑正常的内分泌系统。即下丘脑垂体垂体睾丸分睾丸分泌轴的功能正常。泌轴的功能正常。p精子的成熟、储存及输出。即有正常的睾丸、精子的成熟、储存及输出。即有正常的睾丸、附睾、输精管和尿道。附睾、输精管
6、和尿道。p外生殖器和附属性腺的正常。外生殖器和附属性腺的正常。 外源化学物如影响上述任何一个环节的异常，外源化学物如影响上述任何一个环节的异常，则表现出雄性不育，或称雄性生殖功能障碍则表现出雄性不育，或称雄性生殖功能障碍 。 三、雄性生殖系统损伤后的表现三、雄性生殖系统损伤后的表现（一）男性不育（一）男性不育（二）性功能障碍（二）性功能障碍( (一一) )精液分析精液分析 1. 1. 精液常规分析精液常规分析 （1 1）一般性状检查：精液外观、精液量、）一般性状检查：精液外观、精液量、 精液液化时间及精液的精液液化时间及精液的PHPH值。值。 （2 2）精子计数，精子密度和精子总数。）精子计数
7、，精子密度和精子总数。 （3 3）精子存活率及精子活动力。）精子存活率及精子活动力。三、雄性生殖毒性的检测方法三、雄性生殖毒性的检测方法（4 4）精子形态学检查）精子形态学检查双头畸形精子双头畸形精子双体畸形精子双体畸形精子无定形畸形精子无定形畸形精子2.2.精液的生化分析精液的生化分析 目前常用的指标有：目前常用的指标有：乳酸脱氢酶同工酶乳酸脱氢酶同工酶(LDH)(LDH)：以以 LDH-XLDH-X活性最强。活性最强。 LDH-XLDH-X处于精母细胞、精子细胞和精子线粒体处于精母细胞、精子细胞和精子线粒体中，对精子生成、代谢、获能、活动能力和受中，对精子生成、代谢、获能、活动能力和受精过
8、程均有重要影响。精过程均有重要影响。果糖：果糖：主要由精囊分泌，为精子能量代谢的重主要由精囊分泌，为精子能量代谢的重要来源，为精子活动提供能量。要来源，为精子活动提供能量。酸性磷酸酶：酸性磷酸酶：主要来自前列腺，与精子主要来自前列腺，与精子的活力和代谢有关。的活力和代谢有关。柠檬酸：柠檬酸：来源于前列腺，调节精液来源于前列腺，调节精液Ca2+Ca2+浓度，影响精子的活力。浓度，影响精子的活力。蛋白质：蛋白质：可促进精子活力，保护精子免可促进精子活力，保护精子免受环境因素的损伤。受环境因素的损伤。微量元素：微量元素：对生殖、生殖内分泌功能有对生殖、生殖内分泌功能有重要作用。常用指标有锌、铁、铜、
9、硒重要作用。常用指标有锌、铁、铜、硒等。等。3.3.精子穿透实验精子穿透实验 可用精子穿透去透明带金黄地鼠卵实验综合可用精子穿透去透明带金黄地鼠卵实验综合评价外源化学物对精子受精能量的影响。评价外源化学物对精子受精能量的影响。（二）生殖内分泌检查（二）生殖内分泌检查 睾丸功能主要靠睾丸功能主要靠卵泡刺激素、黄体生卵泡刺激素、黄体生成素和睾酮成素和睾酮来维持和调节。来维持和调节。卵泡刺激素卵泡刺激素(FSH)(FSH)：垂体前叶分泌。作用垂体前叶分泌。作用于生精小管的于生精小管的SertoliSertoli支持细胞，维持生支持细胞，维持生精小管中雄性激素达到一定水平。精小管中雄性激素达到一定水平
10、。黄体生成素黄体生成素(LH)(LH)：垂体前叶分泌。作用垂体前叶分泌。作用于于LeydigLeydig细胞，合成分泌睾酮。细胞，合成分泌睾酮。睾酮：睾酮：睾丸分泌的。生精过程、精子产睾丸分泌的。生精过程、精子产生、性腺的分泌等过程发挥重要作用。生、性腺的分泌等过程发挥重要作用。1.1.睾丸组织学检查睾丸组织学检查 2.2.睾丸标志酶睾丸标志酶（1 1）酶含量和活性随着精子的形成、成熟而增高。）酶含量和活性随着精子的形成、成熟而增高。乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶-X-X：在精母细胞减数分裂、分化和成在精母细胞减数分裂、分化和成熟精子的能量代谢过程中起重要作用。熟精子的能量代谢过程中起重要作用。山梨醇脱
11、氢酶：山梨醇脱氢酶：是睾丸成熟、精子功能和形态完是睾丸成熟、精子功能和形态完善的标志酶，在精子代谢中起重要作用。善的标志酶，在精子代谢中起重要作用。（三）睾丸形态学评价和功能检查（三）睾丸形态学评价和功能检查（2 2）酶含量和活性随着精子的形成、）酶含量和活性随着精子的形成、成熟而降低成熟而降低6-6-葡萄糖磷酸脱氢酶葡萄糖磷酸脱氢酶苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶三磷酸甘油醛脱氢酶三磷酸甘油醛脱氢酶 1 1分离培养分离培养间质细胞的分离：间质细胞的分离：取出生后取出生后16-1816-18天的健康雄天的健康雄性大鼠，在无菌条件下取出睾丸，用生理盐性大鼠，在无菌条件下取出睾丸，用生理盐水冲去血污，剥去
12、白膜。加入消化液在水冲去血污，剥去白膜。加入消化液在3535恒温水浴中消化恒温水浴中消化2020分钟。静置，吸出上清液分钟。静置，吸出上清液过过400400目的网筛，离心，加入一定量的培养液目的网筛，离心，加入一定量的培养液进行培养。进行培养。( (四四) )体外试验体外试验支持细胞的分离：支持细胞的分离：是取曲精管一小段，用胶原是取曲精管一小段，用胶原酶消化酶消化20min(35)20min(35)；去除上清后，加；去除上清后，加0.080.08胶原酶，在胶原酶，在3535水浴消化水浴消化40min40min，过，过200200目不锈目不锈钢网筛，静置，去除上清液。用钢网筛，静置，去除上清液
13、。用McCoys5AMcCoys5A培培养液培养同间质细胞。养液培养同间质细胞。2 2鉴定鉴定(1)(1)用台盼蓝染色计数存活率：一股情况下，用台盼蓝染色计数存活率：一股情况下， 间质细胞和支持细胞，且存活率大于间质细胞和支持细胞，且存活率大于9595。 (2)(2)形态学检查：形态学检查：间质细胞呈现单个的均一分布，细胞核明显。间质细胞呈现单个的均一分布，细胞核明显。支持细胞呈片状，胞质中含脂滴。支持细胞呈片状，胞质中含脂滴。3. 3. 细胞的功能测定：细胞的功能测定：常常通过测定间质细胞分泌的睾酮含常常通过测定间质细胞分泌的睾酮含量和支持细胞中芳烃经化酶的活力来判断受试物是否对量和支持细胞
14、中芳烃经化酶的活力来判断受试物是否对所培养细胞的功能有影响。所培养细胞的功能有影响。 第二节第二节 雌性生殖系统毒性雌性生殖系统毒性 ( (一一) )卵子生成卵子生成 ( (二二) )排卵和受孕排卵和受孕 ( (三三) )内分泌调节内分泌调节 FSH, LH, FSH, LH, GnRHGnRH一、雌性生殖细胞的发生过程一、雌性生殖细胞的发生过程（一）对雌性生殖内分泌功能的影响（一）对雌性生殖内分泌功能的影响 1.1.对下丘脑对下丘脑- -垂体的影响垂体的影响 2.2.对卵巢激素的影响对卵巢激素的影响二、雌性生殖系统毒性二、雌性生殖系统毒性( (二二) )对卵细胞的影响对卵细胞的影响 辐射线：
15、停经，原始生殖细胞对电离辐辐射线：停经，原始生殖细胞对电离辐射最为敏感，极易受损伤。射最为敏感，极易受损伤。二硫化碳二硫化碳(CS(CS2 2) )：影响卵巢，使动物的动：影响卵巢，使动物的动情周期发生改变，受孕能力降低，影响情周期发生改变，受孕能力降低，影响受精卵和胚胎的正常发育。受精卵和胚胎的正常发育。三、雌性生殖系统损伤后的表现三、雌性生殖系统损伤后的表现（一）月经周期异常（一）月经周期异常（二）不孕（二）不孕（三）不良妊娠结局（三）不良妊娠结局（一）卵巢形态学评价和功能检查（一）卵巢形态学评价和功能检查1.1.卵巢形态学评价卵巢形态学评价2.2.卵巢功能评价卵巢功能评价（1 1）实验动
16、物动情周期的观察）实验动物动情周期的观察（2 2）人体月经情况分析）人体月经情况分析四、雌性生殖毒性的检测四、雌性生殖毒性的检测（二）生殖内分泌检查（二）生殖内分泌检查 性激素测定性激素测定 ( (三三) )动物试验动物试验 生殖与发育毒性的复杂性：生殖与发育毒性的复杂性：1.1.在许多不同的生殖与发育阶段都可诱发损害作在许多不同的生殖与发育阶段都可诱发损害作用。用。2.2.损害作用的后果多种多样，可以是结构损伤或损害作用的后果多种多样，可以是结构损伤或功能损伤，也可表现在不同的器官等。功能损伤，也可表现在不同的器官等。3.3.损害作用可表现在出生时，或发育成熟以后，损害作用可表现在出生时，或
17、发育成熟以后，即可在整个生命过程的不同阶段。即可在整个生命过程的不同阶段。一代繁殖试验一代繁殖试验 目的是观察外源化学物对整个生殖过程目的是观察外源化学物对整个生殖过程是否有毒性作用，观察期为一代，即可了解是否有毒性作用，观察期为一代，即可了解受试动物的性腺功能、性周期、交配行为、受试动物的性腺功能、性周期、交配行为、受孕能力、妊娠过程、分娩及哺乳过程。受孕能力、妊娠过程、分娩及哺乳过程。(1)(1)试验动物：多选初成年、未经交配的健康雌性大鼠和试验动物：多选初成年、未经交配的健康雌性大鼠和有生育能力的雄鼠，每组有生育能力的雄鼠，每组6 61010只。只。 (2)(2)剂量与接触受试物时间：剂
18、量与接触受试物时间：剂量范围剂量范围: :包括亚致死剂量包括亚致死剂量( (有毒性反应的量有毒性反应的量) ) 中间剂量中间剂量 无作用剂量无作用剂量接触途径接触途径雌性动物在交配前雌性动物在交配前1515天开始给予受试物，在整个妊娠天开始给予受试物，在整个妊娠和哺乳期皆给予同样剂量。和哺乳期皆给予同样剂量。观察时间分别为两个阶段：观察时间分别为两个阶段： a.a.是在受孕后第是在受孕后第19-2019-20天天: :观察受孕和致畸作用观察受孕和致畸作用. . b. b.是出生后第是出生后第2121天天: :对母鼠授乳情况和幼鼠发育情况进对母鼠授乳情况和幼鼠发育情况进行观察。行观察。(3)(3
19、)观察指标及评价：观察指标及评价： 雌性啮齿类生殖毒性的观察终点雌性啮齿类生殖毒性的观察终点一代或多代繁殖试验的评价指标一代或多代繁殖试验的评价指标在一代繁殖试验中常用的评价指标是受孕率、分娩率、出生存在一代繁殖试验中常用的评价指标是受孕率、分娩率、出生存活率和哺育存活率。活率和哺育存活率。 一代繁殖试验：一代繁殖试验：仅能观察外源化学物对生殖过程仅能观察外源化学物对生殖过程的影响。的影响。 多代繁殖试验：多代繁殖试验：可以观察生殖毒性在子代表现的可以观察生殖毒性在子代表现的不足。同时，在整个生命期内接触受试化学物，更符不足。同时，在整个生命期内接触受试化学物，更符合人类实际生活中长期低剂量接
20、触的情况。例如，食合人类实际生活中长期低剂量接触的情况。例如，食品添加剂、微量金属、农药及环境污染物等可能为长品添加剂、微量金属、农药及环境污染物等可能为长期低剂量接触。多代繁殖拭验中一般多进行两代或三期低剂量接触。多代繁殖拭验中一般多进行两代或三代繁殖试验，特别两代繁殖试验进行较多。代繁殖试验，特别两代繁殖试验进行较多。 2. 2. 多代繁殖试验多代繁殖试验两代繁殖试验两代繁殖试验(1)(1)试验动物：多选成年大鼠，每组试验动物：多选成年大鼠，每组6 61010只。只。 (2) (2) 接触受试物时间：接触受试物时间：F0F0代动物：雄鼠给予受试物代动物：雄鼠给予受试物6060天，雌鼠天，雌鼠1515天后开始交天后开始交配。雌鼠受孕直至哺乳期均给予受试物。配。雌鼠受孕直至哺乳期均给予受试物。F1F1代断奶后代断奶后开始持续给予受试物，直至性成熟开始交配、受孕和开始持续给予受试物，直至性成熟开始交配、受孕和哺乳期。哺乳期。(3)(3)观察指标及评价：观察指标及评价：与一代繁殖试验相同，但应分别计算与一代繁殖试验相同，但应分别计算F0F0代和代和F1F1代的各项代的各项指标。指标。谢谢大家谢谢大家
