《质粒种类与应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒种类与应用（138页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、克隆载体 基因载体是一类能自我复制的基因载体是一类能自我复制的DNADNA分子，其中的分子，其中的一段一段DNADNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源入外源( (目的目的) DNA) DNA而将目的而将目的DNADNA带入宿主细胞。带入宿主细胞。 常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。基因载体应具备的条件：基因载体应具备的条件：（1 1 1 1）有有有有多多多多种种种种限限限限制制制制性性性性内内内内切切切切酶酶酶酶切切切切点点点点，但但
2、但但每每每每种种种种切切切切口口口口最最最最好好好好只只只只有有有有1 1 1 1个；个；个；个；（2 2 2 2）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；（3 3 3 3）有一定容量；）有一定容量；）有一定容量；）有一定容量；（4 4 4 4）有有有有相相相相当当当当的的的的抄抄抄抄本本本本数数数数，即即即即每每每每个个个个宿宿宿宿主主主主菌菌菌菌可可可可能能能能容容容容纳纳纳纳的的的的最最最最多数。多数。多数。多数。多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传
3、标记遗传标记A Ammp ppolylinker基因载体基因载体载体的功能及特载体的功能及特载体的功能及特载体的功能及特征征征征载体的功能载体的功能载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的为外源基因的扩增或表达提供必要的为外源基因的扩增或表达提供必要的为外源基因的扩增或表达提供必要的条件条件条件条件载体的功能及特载体的功能及特载体的功能及特载体的
4、功能及特征征征征载体应具备的条件载体应具备的条件载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）性）性）性） 具有合适的筛选标具有合适的筛选标具有合适的筛选标具有合适的筛选标记记记记 具有较具有较具有较具有较高的外源高的外源高的外源高的外源DNADNA的载装能的载装能的载装能的载装能力力力力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位具有多种单一的核酸内切酶识别切割位具有多种单一的核酸内切酶识别切割位具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点点点点 具有与特定受
5、体细胞相适应的复制位点或整合具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点位点位点位点 质粒(plasmid) Plasmid Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环独立于细菌染色体外的双链环DNADNA分子。分子。PlasmidchromosomePlasmidchromosome 质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复质粒是生物
6、细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并制、并制、并制、并被稳定遗传的一类核酸分被稳定遗传的一类核酸分被稳定遗传的一类核酸分被稳定遗传的一类核酸分子子子子质粒常见于原核细菌和真质粒常见于原核细菌和真质粒常见于原核细菌和真质粒常见于原核细菌和真菌中菌中菌中菌中绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNADNA型型型型的的的的绝大多数的天然绝大多数的天然绝大多数的天然绝大多数的天然DNADNA质粒具有共价、封闭、环状的分子质粒具有共价、封闭、环状的分子质粒具有共价、封闭、环状的分子质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，结构，结构，结构，即即即即cccDNAcccDNA
7、质粒质粒质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：的分子量范围：的分子量范围：1 - 300 1 - 300 kbkb质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制质粒质粒质粒质粒DNADNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应上的复制子结构决定了质粒与寄主的
8、对应关系关系关系关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为可分为可分为可分为两大复制类型：两大复制类型：两大复制类型：两大复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒 1 - 3 1 - 3 拷贝拷贝拷贝拷贝 stringent stringent plasmidplasmid松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 10 - 60 10 - 60 拷贝拷贝拷贝拷贝
9、stringent stringent plasmidplasmid质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒质粒质粒DNADNA复制复制复制复制启动控制启动控制启动控制启动控制控制复制引物与模板的控制复制引物与模板的控制复制引物与模板的控制复制引物与模板的结合结合结合结合orioriE.coli E.coli ColE1ColE1 plasmidplasmid复制方复制方复制方复制方向向向向roprop（+ +）Rop
10、RopRNA RNA IIIIRNA IRNA I33555533质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制 质粒质粒质粒质粒DNADNA复制复制复制复制启动控制启动控制启动控制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（oriori）的的的的结合结合结合结合PcopPcopcocoppP/OrepP/OreprepreporioriCop
11、CopRepRep质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于存在于存在于存在于一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性，不相容，不相容，不相容，不相容性的质性的质性的质性的质以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒
12、为例：以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此拥有相似的复制子结构，彼此拥有相似的复制子结构，彼此拥有相似的复制子结构，彼此不相容不相容不相容不相容pSC101pSC101、F F、RP4 RP4 拥有相似的复制子结构，彼此拥有相似的复制子结构，彼此拥有相似的复制子结构，彼此拥有相似的复制子结构，彼此不相容不相容不相容不相容p15Ap15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容不相容不相容不相容粒组成粒组
13、成粒组成粒组成不相容性群不相容性群不相容性群不相容性群质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的不相容性：质粒的不相容性：质粒的不相容性：质粒的不相容性：分子机制分子机制分子机制分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种同一种同一种同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数拷贝数控制系统的干扰，致使两种质
14、粒的最终拷贝数不同，不同，不同，不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的自己的自己的自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，恒定，恒定，恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处因此在经
15、过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一于同一于同一于同一细胞内细胞内细胞内细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势势势势质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的可转移性质粒的可转移性质粒的可转移性质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒接合型质粒接合型质粒 能在天然条件下自发地从一
16、个细胞转能在天然条件下自发地从一个细胞转能在天然条件下自发地从一个细胞转能在天然条件下自发地从一个细胞转移到移到移到移到另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如F F、ColCol、RR质粒等质粒等质粒等质粒等如如如如ColCol、RR的其它成员的其它成员的其它成员的其它成员非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合不能在天然条件下独立地发生接合不能在天然条件下独立地发生接合不能在天然条件下独立地发生接合作用作用作用作用值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的
17、是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1ColE1）在接合在接合在接合在接合型质粒型质粒型质粒型质粒的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生DNADNA转移，这个过程由转移，这个过程由转移，这个过程由转移，这个过程由 bom bom 和和和和mob mob 基因决定基因决定基因决定基因决定20060421质粒质粒质粒质粒质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征质粒的基本特征携带特殊的遗传标携带特殊的遗传标携带特殊的遗传标携带特殊的遗传标记记记记野生型的质粒野生型的质粒野生型的质粒野生型的质粒DNADNA上往往携带
18、一个或多个遗传标记基上往往携带一个或多个遗传标记基上往往携带一个或多个遗传标记基上往往携带一个或多个遗传标记基因，这因，这因，这因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、抗生素、重金属离子、毒性阴离子、抗生素、重金属离子、毒性阴离子、抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物有机物有机物有机物物质合成物质合成物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素
19、、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对这些标记基因对这些标记基因对DNADNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义质粒质粒质粒质粒质粒的构建质粒的构建质粒的构建质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的切位点少、遗传标记不理想等缺陷
20、，不能满足克隆载体的切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。建。建。建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：质粒构建的：质粒构建的：质粒构建的：pSC101pSC101 8.8 kb 8.8 kb 拷贝数拷贝数
21、拷贝数拷贝数 5 5 四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因 TcTcrrColE1ColE1 6.5 kb 6.5 kb 拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 20 - 30 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基大肠杆菌内毒素标记基大肠杆菌内毒素标记基大肠杆菌内毒素标记基因因因因 E1E1RSF2124RSF2124 ColE1 ColE1衍生质粒衍生质粒衍生质粒衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基氨苄青霉素抗性标记基氨苄青霉素抗性标记基氨苄青霉素抗性标记基因因因因 ApAprr质粒质粒质粒质粒质粒的分类质粒的分类质粒的分类质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下人
22、工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：几类：几类：几类： 高拷贝质粒高拷贝质粒高拷贝质粒高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因 拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数1000-3000 1000-3000 扩增扩增扩增扩增基因基因基因基因低拷贝质粒低拷贝质粒低拷贝质粒低拷贝质粒 来自来自来自来自pSC101 pSC101 拷贝数小于拷贝数小于拷贝数小于拷贝数小于1010 表达某些毒性基表达某些毒性基表达某些毒性基表达某些毒性基因因因因温敏质粒温敏质粒温敏质粒温敏质粒 在不同温度
23、下表现出拷贝数、整合等不同性在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质质质质测序质粒测序质粒测序质粒测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinkerpolylinker整合质粒整合质粒整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点 便于外源基因的便于外源基因的便于外源基因的便于外源基因的整合整合整合整合穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒 装有针对两
24、种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子 便于基因便于基因便于基因便于基因克隆克隆克隆克隆表达质粒表达质粒表达质粒表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件的元件的元件的元件探针质粒探针质粒探针质粒探针质粒 装有报告基因装有报告基因装有报告基因装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛便于启动子等元件的克隆筛便于启动子等元件的克隆筛便于启动子等元件的克隆筛选选选选 第一阶段（第一阶段（19771977年前）：天然
25、质粒和重组质粒的利用，如年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322pBR322。 第二阶段：第二阶段：增大载体容量增大载体容量（降低载体长度），建立（降低载体长度），建立多克隆位多克隆位点区点区和新的和新的遗传标记遗传标记基因。如基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含T3T3，T7T7，sp6sp6启动子载体，表达型载启动子
26、载体，表达型载体及各种探针型载体。体及各种探针型载体。 发展概况发展概况 pBR322pBR322pBR322pBR322为为为为4.36kb4.36kb4.36kb4.36kb的的的的环环环环状状状状双双双双链链链链DNADNADNADNA，其其其其碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列已已已已经经经经全全全全部部部部清清清清楚楚楚楚。是是是是最最最最早早早早应应应应用用用用于于于于基基基基因因因因工工工工程程程程的的的的载载载载体体体体之之之之一一一一。把把把把pBR322pBR322pBR322pBR322用用用用限限限限制制制制性性性性内内内内切切切切酶酶酶酶切切切切去去去去某某某某片片片片
27、段段段段，换换换换上上上上合合合合用用用用的的的的表表表表达达达达组组组组件件件件，就就就就可可可可以以以以构建成工作所需的新载体。构建成工作所需的新载体。构建成工作所需的新载体。构建成工作所需的新载体。 许许许许多多多多实实实实用用用用的的的的质质质质粒粒粒粒载载载载体体体体都都都都是是是是在在在在pBR322pBR322pBR322pBR322的的的的基基基基础础础础上上上上改改改改建建建建而而而而成成成成。可见其原型质粒在使用上有优点。可见其原型质粒在使用上有优点。可见其原型质粒在使用上有优点。可见其原型质粒在使用上有优点。 pBR322pBR322有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内
28、切有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有酶只有单一切口的位点也多达数十个，单一切口的位点也多达数十个，几乎具几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。的优越条件。此外，此外，pBR322DNApBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分分子质量标准子质量标准。重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制松弛型复制松弛型复制 pBR322pBR322： 氯霉素可扩氯霉
29、素可扩氯霉素可扩氯霉素可扩增增增增拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 50 - 100 / 50 - 100 / cellcell用于基因克隆用于基因克隆用于基因克隆用于基因克隆 抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段插入片段插入片段插入片段AmpAmp平板平板平板平板TetTet平板平板平板平板pUCpUC质粒系列质粒系列 pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。 它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ 基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker. 476bp
30、476bp片段含有片段含有E.coliE.coli的的lacZlacZ基因的基因的 5-5-序列，序列，表达半乳糖苷酶的表达半乳糖苷酶的 片段。片段。 LacZLacZ的上游包括乳的上游包括乳糖操纵子上的启动子糖操纵子上的启动子PlacPlac和操纵基因和操纵基因O O。 lacZlacZ之内是之内是M13M13的多的多功能连接器。功能连接器。三个显著特点：三个显著特点：三个显著特点：三个显著特点： （1 1）分子量更小分子量更小分子量更小分子量更小，仅为，仅为，仅为，仅为2.7KB2.7KB，容纳外源，容纳外源，容纳外源，容纳外源DNADNA量增大；量增大；量增大；量增大；具有具有具有具有更
31、高的拷贝数更高的拷贝数更高的拷贝数更高的拷贝数（每个细胞含（每个细胞含（每个细胞含（每个细胞含500-700500-700个拷贝）。个拷贝）。个拷贝）。个拷贝）。 （2 2）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源DNADNA插入的标记基因插入的标记基因插入的标记基因插入的标记基因LacZLacZ，可利用可利用可利用可利用 - -互补原理进行互补原理进行互补原理进行互补原理进行蓝白筛选。蓝白筛选。蓝白筛选。蓝白筛选。 （3 3）多克隆位点区（多克隆位点区（多克隆位点区（多克隆位点区（MCSMCS）由人工合成的多个单一酶切由人工合成的多个单一酶切由人
32、工合成的多个单一酶切由人工合成的多个单一酶切位点构成。位点构成。位点构成。位点构成。 其其其其MCSMCS区与区与区与区与M13mpM13mp噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使噬菌体载体的相同，可使pUCpUC上克上克上克上克隆的目的基因直接转移到隆的目的基因直接转移到隆的目的基因直接转移到隆的目的基因直接转移到M13mpM13mp载体，进行载体，进行载体，进行载体，进行DNADNA测序测序测序测序和和和和体外突变体外突变体外突变体外突变等研究。等研究。等研究。等研究。重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC
33、18 pUC18 / 19/ 19： 拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 2000 - 3000 / 2000 - 3000 / cellcell用于基因克隆和测用于基因克隆和测用于基因克隆和测用于基因克隆和测序序序序 装有多克隆位点装有多克隆位点装有多克隆位点装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ质粒质粒质粒质粒重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 pUC18 / 19/ 19：正选择标记正选择标记正选择标记正选择标记 lacZ lacZ 的显色原理的显色原理的显色原理的显色
34、原理pUC18pUC18/1/199PlacPlaclacZlacZ MCMCS Sb bb b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 -肽肽肽肽段段段段a a ab b b5-5-溴溴溴溴-4-4-氯氯氯氯-3-3-吲哚基吲哚基吲哚基吲哚基-b bb b-D-D-半乳半乳半乳半乳糖苷糖苷糖苷糖苷X-X-galgalpKOpKO系列系列组成：以组成：以半乳糖激酶（半乳糖激酶（GalkGalk）基因取代基因取代pBR322pBR322的的EcoEcoRI-RI-PvuPvuIIII位点包括位点包括terterr r，. .表达产物催化表达产物催化 Gal + ATP Gal-1-P+
35、ADPGal + ATP Gal-1-P+ADP以以1414C C标记的半乳糖作底物标记的半乳糖作底物, ,检测生成的检测生成的* *Gal-1-PGal-1-P的的放射性。放射性。 在在GalkGalk基因上游插入目的基因，根据基因表达基因上游插入目的基因，根据基因表达产物半乳糖激酶活性，即产物半乳糖激酶活性，即1414C-Gal-l-PC-Gal-l-P的放射性，的放射性，可可定量估算启动子功能的强弱定量估算启动子功能的强弱。 如在如在GalkGalk基因前插入目的基因，与无插入的空基因前插入目的基因，与无插入的空载载pKOpKO比较，并无放射活性的增强，则说明插入片比较，并无放射活性的增
36、强，则说明插入片段不存在有启动子。段不存在有启动子。 重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3ZpGEM-3Z：多拷贝多拷贝多拷贝多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点装有多克隆位点装有多克隆位点装有多克隆位点（MCSMCS）正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ用于外源基因的高效用于外源基因的高效用于外源基因的高效用于外源基因的高效表达表达表达表达 注意：注意：注意：注意：T7T7和和和和SP6SP6启动子特异性地由噬菌
37、体启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNADNA编码的编码的编码的编码的RNARNA聚合聚合聚合聚合2743 2743 bpbpMCMCSSlacZlacZPPT7T7ororiiApAprrpGEM-pGEM-3E3EPPSP6SP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNARNA聚合聚合聚合聚合酶，如：酶，如：酶，如：酶，如：E.coliE.coli BL21 BL21（DE3DE3）等等等等 乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖 乳糖类似物异
38、丙基-D -硫代半乳糖苷（IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。 LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物 蓝白斑试验（蓝白斑试验（IPTG-Xgal IPTG-Xgal 试验试验）诱导物诱导物 Z Y XZ Y X P PO O Z Y XZ Y X P PO O乳糖标志补救（标志补救（标志补救（标志补救（ - - - -半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）lacZAmN2H 片段片段COOHCOOH 片段片段lacZX-galLac ZLac Z蓝色化合物蓝色化合物X-gal（LacZLacZ基因基因 N N端序列）端序列
39、）插入片段插入片段（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ基因基因 C C端序列端序列LacZLacZ酶酶基因克隆时的定向插入基因克隆时的定向插入 插入序列两边的酶切口不同插入序列两边的酶切口不同, ,插入的组件不会插入的组件不会倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿5 533方向正确转录，这种构建方式称为定向插方向正确转录，这种构建方式称为定向插入入。EcoRIHindIIIOriOri复制起复制起点点LacZAPRpUC19质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质
40、粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNADNA： 氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心法法法法 质粒质粒质粒质粒DNADNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙纯度高、周期长、设备要求高、溴乙纯度高、周期长、设备要求高、溴乙纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染锭污染锭污染锭污染碱溶碱溶碱溶碱溶法法法法 质粒质粒质粒质粒DNADNA纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴法法法法 质粒质粒质粒质粒DNADNA纯度、操作周期
41、介于氯化铯法和碱溶纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间法之间法之间法之间质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法： 用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮的缓冲液悬浮的缓冲液悬浮的缓冲液悬浮菌体菌体菌体菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加加加CsClCsCl和溴乙和溴乙和溴乙和溴乙锭锭锭锭超速离心过夜超速离心过夜超速离心过夜
42、超速离心过夜在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取cccDNAcccDNA稀释沉淀稀释沉淀稀释沉淀稀释沉淀cccDNAcccDNAproteinproteins socDNocDNAAL-L-DNADNAcccDNAcccDNARNARNAs s质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化碱溶法：碱溶法：碱溶法：碱溶法： 用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮的缓冲液悬浮的缓冲液悬浮的缓冲液悬浮菌体菌体菌体菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加加加NaOHNaO
43、H和和和和SDSSDS的混合溶液，去膜释放内含物的混合溶液，去膜释放内含物的混合溶液，去膜释放内含物的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染染染染色体色体色体色体DNADNA及大部分蛋白及大部分蛋白及大部分蛋白及大部分蛋白质质质质 离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚- - - -氯仿萃取，去除痕量的氯仿萃取，去除痕量的氯仿萃取，去除痕量的氯仿萃取，去除痕量的蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇
44、或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNADNA用无用无用无用无DNaseDNase的的的的RNaseRNase去除残余的去除残余的去除残余的去除残余的RNARNA cccDNcccDNAAL-DNAL-DNAocDNAocDNAD-DNAD-DNAT-DNAT-DNA质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化沸水浴法：沸水浴法：沸水浴法：沸水浴法： 用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA和和和和Triton X-100Triton X-100的缓冲液悬的缓冲液悬的缓冲液悬的缓冲液悬浮菌体浮菌体浮菌体浮菌体 加溶菌酶裂
45、解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴4040秒秒秒秒钟钟钟钟离心，用无菌牙签挑去沉离心，用无菌牙签挑去沉离心，用无菌牙签挑去沉离心，用无菌牙签挑去沉淀物淀物淀物淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒DNADNA噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染地侵染地侵染地侵
46、染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏中潜伏中潜伏中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNADNA能被开发成为能被开发成为能被开发成为能被开
47、发成为基因工基因工基因工基因工程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增增增增 噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体是是是是比比比比细细细细菌菌菌菌还还还还小小小小得得得得多多多多的的的的微微微微生生生生物物物物，和和和和病病病
48、病毒毒毒毒侵侵侵侵犯犯犯犯真真真真核核核核细细细细胞胞胞胞一一一一样样样样，噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体侵侵侵侵犯犯犯犯细细细细菌菌菌菌，也也也也可可可可以以以以认认认认为为为为它它它它是是是是细细细细菌菌菌菌里里里里的的的的“ “寄寄寄寄生生生生虫虫虫虫” ”。它它它它本本本本身身身身是是是是一一一一种种种种核核核核蛋蛋蛋蛋白白白白，核核核核心心心心是是是是一一一一段段段段DNADNADNADNA，结结结结构构构构上上上上有有有有一一一一个个个个蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质外外外外壳壳壳壳和和和和尾尾尾尾巴巴巴巴，尾尾尾尾巴巴巴巴上上上上的的的的微微微微丝丝丝丝可可可可以以以以把把把把噬噬噬噬菌菌菌
49、菌体体体体的的的的DNADNADNADNA注入细菌内。注入细菌内。注入细菌内。注入细菌内。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l 噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 生物生物生物生物结构结构结构结构l l l l 噬菌体是噬菌体是噬菌体是噬菌体是大肠杆菌的温和型噬大肠杆菌的温和型噬大肠杆菌的温和型噬大肠杆菌的温和型噬菌体菌体菌体菌体l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和由
50、外壳包装蛋白和l l l l- -DNADNA组成组成组成组成 l l l l-DNA-DNA全长全长全长全长4850248502个核个核个核个核苷酸苷酸苷酸苷酸l l l l-DNA-DNA上上上上至少有至少有至少有至少有6161个个个个基因基因基因基因l l l l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 生物生物生物生物结构结构结构结构5 5 TCCAGCGGCGGGTCCAGCGGCGGGGG3333CCCGCCGCTGGA CCCGCCGCTGGA 5 5 COSCOSCOSCOScoscos头部合成基头部合成基头部合成基头部合成基因因因因尾部合成基
51、尾部合成基尾部合成基尾部合成基因因因因溶菌控制基溶菌控制基溶菌控制基溶菌控制基因因因因晚期控制基晚期控制基晚期控制基晚期控制基因因因因DNADNA合成控制合成控制合成控制合成控制基基基基因因因因阻遏基阻遏基阻遏基阻遏基因因因因早期控制基早期控制基早期控制基早期控制基因因因因阻遏基阻遏基阻遏基阻遏基因因因因重组基重组基重组基重组基因因因因删除与整合基删除与整合基删除与整合基删除与整合基因因因因- - DNADNA噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l 噬菌体生物学特性
52、：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 感染感染感染感染周期周期周期周期E.colE.colii吸吸吸吸附附附附LamBLamB受体受体受体受体注注注注入入入入复复复复制制制制包包包包装装装装裂裂裂裂解解解解噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 感染感染感染感染周期周期周期周期体内包体内包体内包体内包装装装装100100个左右的拷个左右的拷个左右的拷个左右的拷贝贝贝贝包装范
53、围为原包装范围为原包装范围为原包装范围为原DNADNA的的的的75 - 75 - 105%105%即即即即 36 - 51 36 - 51 kbkbDDAA包装范围为原包装范围为原包装范围为原包装范围为原DNADNA的的的的75 - 75 - 105%105%即即即即 36 - 51 36 - 51 kbkb噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l 噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性：噬菌体生物学特性： 溶原溶原溶原溶原状态状态状态状态 l l l
54、l噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体感感感感染染染染大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌后后后后，除除除除能能能能裂裂裂裂解解解解细细细细胞胞胞胞外外外外，也也也也可可可可能能能能将将将将其其其其DNADNA直直直直接接接接整整整整合合合合到到到到宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞的的的的染染染染色色色色体体体体DNADNA上上上上，并并并并不不不不产产产产生生生生子子子子代代代代噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体颗颗颗颗粒粒粒粒，这这这这种种种种情情情情况况况况为为为为溶溶溶溶原原原原状状状状态态态态。整整整整合合合合主主主主要要要要由由由由l l l l-DNA-DNA上上上上的的的的cIcI和和和和intint两
55、两两两基基基基因因因因的的的的产产产产物物物物所所所所激激激激活活活活，而而而而这这这这两两两两个个个个基基基基因因因因的的的的开开开开放放放放与与与与关关关关闭闭闭闭又又又又取取取取决决决决于于于于宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞本本本本身身身身的的的的性性性性质质质质。人人人人们们们们可可可可以以以以根根根根据据据据需需需需要要要要改改改改变变变变l l l l-DNA-DNA或或或或宿宿宿宿主主主主细细细细胞胞胞胞的的的的性性性性质质质质，使使使使噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体或处于或处于或处于或处于溶原状态溶原状态溶原状态溶原状态，或处于裂解状态，或处于裂解状态，或处于裂解状态，或处于裂解状
56、态 DNA DNA重组技术一般需要重组技术一般需要重组技术一般需要重组技术一般需要l l l l噬菌体进入溶原状态噬菌体进入溶原状态噬菌体进入溶原状态噬菌体进入溶原状态 噬菌体线性双链噬菌体线性双链噬菌体线性双链噬菌体线性双链DNADNA病毒，具有末端互补的病毒，具有末端互补的病毒，具有末端互补的病毒，具有末端互补的12nt12nt，感染细菌后，感染细菌后，感染细菌后，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长粘端互补成双链环状。全长粘端互补成双链环状。全长粘端互补成双链环状。全长48531bp48531bp，含，含，含，含5050多个基因。多个基因。多个基因。多个基因。噬菌体整个基因组如图所示，可分
57、为三个部分左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。中段：长约20kb，是DNA整合和切出，溶原生长所需的序列。右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及DNA复制起始均在这区域内。左右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。噬菌体基因大致分为噬菌体基因大致分为4 4个区：个区： 结构区结构区结构区结构区A A A A J19J19J19J19个基因，个基因，个基因，个基因，编码头、编码头、编码头、编码头、 尾部蛋白质为尾部蛋白质为尾部蛋白质
58、为尾部蛋白质为结构区结构区结构区结构区, , , ,重组区重组区重组区重组区 attattattatt（attachmentattachmentattachmentattachment）、）、）、）、intintintint（intagrateintagrateintagrateintagrate）及）及）及）及xisxisxisxis（excissionexcissionexcissionexcission），），），），调控区调控区调控区调控区启动子、终止子和启动子、终止子和启动子、终止子和启动子、终止子和N N N N、CICICICI基因，基因，基因，基因， O-R O-R O-R O
59、-R 为为为为裂解区裂解区裂解区裂解区. . . . 噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：缩短长缩短长缩短长缩短长度度度度 野野野野生生生生型型型型l l l l-DNA-DNA包包包包装装装装的的的的上上上上限限限限为为为为5151kbkb，本本本本身身身身长长长长度度度度为为为为48.548.5kbkb，只只只只有有有有当当当当插插插插入入入入的的的的外外外外源源源源DNADNA片片片片段段段段不
60、不不不大大大大于于于于2.52.5kbkb时时时时，才才才才能能能能被被被被包包包包装装装装成成成成有有有有感感感感染染染染力力力力的的的的噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体颗颗颗颗粒粒粒粒。因因因因此此此此缩缩缩缩短短短短野野野野生生生生型型型型l l l l-DNA-DNA的的的的长长长长度度度度，可可可可以以以以提提提提高高高高装装装装载载载载量量量量。其其其其实实实实野野野野生生生生型型型型l l l l-DNA-DNA上上上上约约约约有有有有40-50%40-50%的的的的片片片片段段段段是是是是复复复复制制制制和和和和裂裂裂裂解解解解所所所所非非非非必必必必需需需需的的的的。根根根根据据据据
61、切切切切除除除除的的的的多少，可将多少，可将多少，可将多少，可将l l l l-DNA-DNA分成两大类载体：分成两大类载体：分成两大类载体：分成两大类载体： 插入型载插入型载插入型载插入型载体体体体取代型载取代型载取代型载取代型载体体体体噬菌体及其组件的应用噬菌体及其组件的应用 噬菌体可以噬菌体可以噬菌体可以噬菌体可以容纳较大的目的基因容纳较大的目的基因容纳较大的目的基因容纳较大的目的基因。例如用置换法可。例如用置换法可。例如用置换法可。例如用置换法可去掉长达去掉长达去掉长达去掉长达20kb20kb20kb20kb的的的的DNADNADNADNA，换入相应长度的目的基因。，换入相应长度的目的
62、基因。，换入相应长度的目的基因。，换入相应长度的目的基因。 基因文库构建基因文库构建基因文库构建基因文库构建常使用常使用常使用常使用 载体；载体；载体；载体； 不少先进的质粒应用不少先进的质粒应用不少先进的质粒应用不少先进的质粒应用 组件组件组件组件进行构建。进行构建。进行构建。进行构建。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度缩短长度缩短长度 插入型插入型插入型插入型载体载体载体载体体外
63、包体外包体外包体外包装装装装插入位插入位插入位插入位点点点点体外包体外包体外包体外包装装装装插入片插入片插入片插入片段段段段载体长度载体长度载体长度载体长度 37 37 kbkb插入片段大小：插入片段大小：插入片段大小：插入片段大小：0 - 14 0 - 14 kbkb（51 51 3737）噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：缩短长度缩短长度缩短长度缩短长度 取代型载体（置换型取代型载体（置换型取代
64、型载体（置换型取代型载体（置换型载体）载体）载体）载体）体外包体外包体外包体外包装装装装体外包体外包体外包体外包装装装装插入片插入片插入片插入片段段段段最小装载长度最小装载长度最小装载长度最小装载长度 10 10 kbkb（51 51 2626）载体长度载体长度载体长度载体长度 26 26 kbkb插入片插入片插入片插入片段段段段最大装载长度最大装载长度最大装载长度最大装载长度 25 25 kbkb（36 36 2626）允许外源DNA片段替换非必须DNA片段的载体，称为置换型载体（replacementvectors）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是9-23kb，故而该载体主
65、要用来构建基因组文库。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：删除重复的酶切删除重复的酶切删除重复的酶切删除重复的酶切位点位点位点位点野生型的野生型的野生型的野生型的l l l l-DNA-DNA链上有链上有链上有链上有5 5个个个个EcoRIEcoRI位点和位点和位点和位点和7 7个个个个HindIIIHindIII位点，不位点，不位点，不位点，不利于重组操作，必须删除至利于重组操作，必须删除至利于重组
66、操作，必须删除至利于重组操作，必须删除至1 - 1 - 2 2个个个个同时，为了便于各种来源的同时，为了便于各种来源的同时，为了便于各种来源的同时，为了便于各种来源的DNADNA片段的克隆，还需要片段的克隆，还需要片段的克隆，还需要片段的克隆，还需要增加一增加一增加一增加一些单一的酶切位点些单一的酶切位点些单一的酶切位点些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶增添酶增添酶增添酶位点位点位点位点噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬
67、菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记加装选择标记加装选择标记与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型l l l l-DNA-DNA上缺少合适的选择标记，上缺少合适的选择标记，上缺少合适的选择标记，上缺少合适的选择标记，因此因此因此因此加装加装加装加装选择标记是选择标记是选择标记是选择标记是l l l l-DNA-DNA克隆载体构建的重要内容克隆载体构建的重要内容克隆载体构建的重要内容
68、克隆载体构建的重要内容l l l l-DNA-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两克隆载体上的选择标记主要有下列两克隆载体上的选择标记主要有下列两克隆载体上的选择标记主要有下列两类：类：类：类：免疫功能类标免疫功能类标免疫功能类标免疫功能类标记记记记颜色反应类标颜色反应类标颜色反应类标颜色反应类标记记记记噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记加装选择标记加装选择标记 imm43
69、4imm434imm434imm434基因编码一种阻止基因编码一种阻止基因编码一种阻止基因编码一种阻止l l l l- -噬噬噬噬菌体菌体菌体菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整进入溶菌循环的阻遏物。含有完整进入溶菌循环的阻遏物。含有完整进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记标记标记标记基因的基因的基因的基因的l l l l- -载体进入受体细胞后，建载体进入受体细胞后，建载体进入受体细胞后，建载体进入受体细胞后，建立溶立溶立溶立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；斑；斑；斑；当外源当外源当外源当外源DNADN
70、A插入到标记基因中，基因灭插入到标记基因中，基因灭插入到标记基因中，基因灭插入到标记基因中，基因灭活，活，活，活， l l l l- -重组分子便进入溶菌循环，重组分子便进入溶菌循环，重组分子便进入溶菌循环，重组分子便进入溶菌循环，形成形成形成形成透明斑透明斑透明斑透明斑噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记加装选择标记加装选择标记 lacZlacZlacZlacZ基因编码基因编
71、码基因编码基因编码b b b b- -半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化无色的无色的无色的无色的X-galX-gal生成蓝色化合物。当外源生成蓝色化合物。当外源生成蓝色化合物。当外源生成蓝色化合物。当外源基基基基因插入到因插入到因插入到因插入到lacZlacZ基因中，基因灭活，不基因中，基因灭活，不基因中，基因灭活，不基因中，基因灭活，不能能能能合成蓝色化合物；而空载体合成蓝色化合物；而空载体合成蓝色化合物；而空载体合成蓝色化合物；而空载体l l l l-DNA-DNA则则则则产产产产生蓝色透明斑生蓝色透明斑生蓝色透明斑生蓝色透明斑噬菌体或病毒噬菌体或病毒
72、噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：构建琥珀密码子的构建琥珀密码子的构建琥珀密码子的构建琥珀密码子的突变体突变体突变体突变体 琥琥琥琥珀珀珀珀型型型型突突突突变变变变（supsup) ) ) )是是是是指指指指由由由由CAGCAG（GlnGln）向向向向UAGUAG（stopstop）的的的的突突突突变变变变。大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌的的的的某某某某些些些些菌菌菌菌株株株株含含含含有有有有特特特特异异异异性性性性的的
73、的的校校校校正正正正基基基基因因因因，其其其其编码产物校正编码产物校正编码产物校正编码产物校正tRNAtRNA能专一性地纠正这一突变。能专一性地纠正这一突变。能专一性地纠正这一突变。能专一性地纠正这一突变。将将将将野野野野生生生生型型型型l l l l-DNA-DNA上上上上DD和和和和E E两两两两个个个个头头头头部部部部包包包包装装装装蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的基基基基因因因因中中中中的的的的CAGCAG密密密密码码码码子子子子突突突突变变变变成成成成UAGUAG。当当当当这这这这种种种种l l l l-DNA-DNA进进进进入入入入一一一一般般般般的的的的大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌菌
74、菌菌菌株株株株后后后后，不不不不能能能能合合合合成成成成有有有有活活活活性性性性的的的的头头头头部部部部蛋蛋蛋蛋白白白白，也也也也就就就就不不不不能能能能被被被被包包包包装装装装和和和和裂裂裂裂解解解解细细细细菌菌菌菌，这这这这样样样样就就就就可可可可以以以以阻阻阻阻止止止止有有有有害害害害重重重重组组组组体体体体的的的的生生生生物物物物污污污污染染染染及及及及扩扩扩扩散散散散，而而而而基基基基因因因因工工工工程程程程实实实实验验验验中中中中使使使使用用用用的的的的受受受受体体体体则则则则是是是是具具具具有有有有琥琥琥琥珀珀珀珀型突变体校正功能的菌株型突变体校正功能的菌株型突变体校正功能的菌株
75、型突变体校正功能的菌株 噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l-DNA-DNA载体的主要类型：载体的主要类型：载体的主要类型：载体的主要类型：插入灭活型载插入灭活型载插入灭活型载插入灭活型载体体体体CharonCharon2 2、CharonCharon6 6、l l l lgt11gt11取代型载体取代型载体取代型载体取代型载体l l l lEMBL4EMBL4、l l l lgtgtl l l lc c、l l l lNM762NM762、CharonCharo
76、n4040正选择型载正选择型载正选择型载正选择型载体体体体l l l lEMBL1EMBL1、l l l lL47L47、l l l l10591059野生型的野生型的野生型的野生型的l l l l噬菌体不能在噬菌体不能在噬菌体不能在噬菌体不能在P2P2噬菌体溶源性噬菌体溶源性噬菌体溶源性噬菌体溶源性的细菌中繁殖的细菌中繁殖的细菌中繁殖的细菌中繁殖（SpiSpi+），），），），这种生长抑制表型受这种生长抑制表型受这种生长抑制表型受这种生长抑制表型受l l l l-DNA-DNA上的上的上的上的redred和和和和gamgam两个基因控制。两个基因控制。两个基因控制。两个基因控制。若将外若将外
77、若将外若将外源源源源DNADNA取代取代取代取代redred和和和和gamgam，重组重组重组重组噬菌体便拥有噬菌体便拥有噬菌体便拥有噬菌体便拥有SpiSpi-表型，能在表型，能在表型，能在表型，能在P2P2噬菌噬菌噬菌噬菌体体体体溶源性溶源性溶源性溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑斑斑斑噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l-DNA-DNA重组分子的体外包
78、装：重组分子的体外包装：重组分子的体外包装：重组分子的体外包装：l l l l-DNA-DNA重重重重组组组组分分分分子子子子需需需需在在在在体体体体外外外外人人人人工工工工包包包包装装装装成成成成有有有有感感感感染染染染力力力力的的的的噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体重组颗粒，方可高效导入受体细胞重组颗粒，方可高效导入受体细胞重组颗粒，方可高效导入受体细胞重组颗粒，方可高效导入受体细胞用用用用于于于于体体体体外外外外包包包包装装装装的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质可可可可直直直直接接接接从从从从感感感感染染染染了了了了l l l l噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体的的的的大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌中中
79、中中提提提提取取取取，现现现现已已已已商商商商品品品品化化化化。这这这这些些些些包包包包装装装装蛋蛋蛋蛋白白白白通通通通常常常常分分分分为为为为相相相相互互互互互互互互补补补补的的的的两两两两部部部部分分分分：一一一一部部部部分分分分缺缺缺缺少少少少E E组组组组份份份份，另另另另一一一一部部部部分分分分则则则则缺缺缺缺少少少少DD组组组组份份份份。包包包包装装装装时时时时，当当当当且且且且仅仅仅仅当当当当这这这这两两两两部部部部分分分分包包包包装装装装蛋蛋蛋蛋白白白白与与与与重重重重组组组组l l l l-DNA-DNA分分分分子子子子混混混混合合合合后后后后，包包包包装装装装才才才才能能能
80、能有有有有效效效效进进进进行行行行，任任任任何何何何一一一一种种种种蛋蛋蛋蛋白白白白包包包包装装装装液液液液被被被被重重重重组组组组l l l l-DNA-DNA污污污污染染染染后后后后，均均均均不不不不能能能能被被被被包包包包装装装装成成成成有有有有感感感感染染染染力力力力的的的的噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体颗颗颗颗粒，这也是基于安全而设计的粒，这也是基于安全而设计的粒，这也是基于安全而设计的粒，这也是基于安全而设计的 DNA DNA的体外包装的体外包装 是提高是提高噬菌体噬菌体转染效率转染效率的有效方法的有效方法 在在A A蛋白蛋白（有终止复制功能），（有终止复制功能），E E蛋白蛋白（是包装
81、（是包装蛋白），蛋白），D D蛋白蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组（是插入蛋白）共同作用下使重组体体DNADNA转入头部。转入头部。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l-DNA-DNA及其重组分子的分离纯及其重组分子的分离纯及其重组分子的分离纯及其重组分子的分离纯化：化：化：化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期
82、期期期 加入加入加入加入l l l l噬菌体或重组噬菌体或重组噬菌体或重组噬菌体或重组l l l l噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，3737培养培养培养培养1 1小小小小时时时时 用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养4 -124 -12小时。这时噬菌体颗小时。这时噬菌体颗小时。这时噬菌体颗小时。这时噬菌体颗粒粒粒粒 密度已达密度已达密度已达密度已达101013 13 -10-1014 14 / / L L，大肠杆菌细胞已完全裂解大肠杆菌细胞已完全裂解大肠杆菌细胞已完全裂解大肠杆菌细胞已完全裂解
83、超速离心，沉淀噬菌体超速离心，沉淀噬菌体超速离心，沉淀噬菌体超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放l l l l-DNA-DNA 乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀l l l l-DNA-DNA 噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的 l l l l 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNAl l l l-DNA-DNA作为载体的优点：作为载体的优点：作为载体的优点：作为载体的优点：l l l l-DNA-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆可在体外包装成
84、噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌菌菌菌 l l l l-DNA-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为载体的装载能力为载体的装载能力为25 25 kbkb，远远大于质粒的装远远大于质粒的装远远大于质粒的装远远大于质粒的装载量载量载量载量 重组重组重组重组l l l l-DNA-DNA分子分子分子分子的筛选较为方便的筛选较为方便的筛选较为方便的筛选较为方便 重组重组重组重组l l l l-DNA-DNA分子的提取较为简便分子的提取较为简便分子的提取较为简便分子的提取较为简便 l l l l-DNA-DNA载体适合克
85、隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源DNADNA片段，但不适合片段，但不适合片段，但不适合片段，但不适合表达表达表达表达 外源基因外源基因外源基因外源基因表达载体pET-5a是典型的pET载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入了T7噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体DNADNAM13M13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬
86、菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 生物结构生物结构生物结构生物结构M13M13噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状M13M13 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和正正正正链链链链DNADNA组成组成组成组成 M13M13 DNADNA全长全长全长全长64076407个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸M13 DNAM13 DNA上上上上至少有至少有至少有至少有1010个基因个基因个基因个基因27002700个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子M13M13 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体不裂
87、解宿主细胞，但抑制其生不裂解宿主细胞，但抑制其生不裂解宿主细胞，但抑制其生不裂解宿主细胞，但抑制其生长长长长 M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。M13噬菌体的基因组为单链噬菌体的基因组为单链DNA，由，由6407的碱基组成的碱基组成（GenBank注册号为注册号为V00604）。基因组。基因组90%以以上的序列可编码蛋白质，共上的序列可编码蛋白质，共有有11个编码基因，基因之个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因较大的间隔位于基因和和基因基因以及基
88、因以及基因和基因和基因之间，其间有调节基因表之间，其间有调节基因表达和达和DNA合成的元件。合成的元件。M13噬菌体基因组可编码噬菌体基因组可编码3类蛋白质，包括复制蛋白类蛋白质，包括复制蛋白（基因（基因，和和），形），形态发生蛋白（基因态发生蛋白（基因，和和），结构蛋白（基因），结构蛋白（基因、和和）。基）。基因组因组DNA为正链，按基因为正链，按基因至基因至基因方向合成，与方向合成，与噬菌体的噬菌体的mRNA序列同义。序列同义。M13噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长880nm，直径6-7nm。噬菌体颗粒的核心由2700个基因编码的结构蛋白呈管状排列而成，成熟的基因的产物为由50个氨基酸残基组
89、成的螺旋蛋白。顶端由5个基因和5个基因产物组成，作用于间隔区中的包装信号。5个基因蛋白和5个基因蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。右图是M13噬菌体结构模型。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体DNADNAM13M13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 感染感染感染感染周期周期周期周期+ + DNADNA（+）DNDNAARFDNARFDNARFDNARFDNARFDNARFDNA- - DNADNAI II IVV在宿主细胞内
90、，感染性的单链噬菌体DNA（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链DNA，用于DNA的复制，因此这种双链DNA称为复制型DNA（replicativeformDNA），即RFDNA。通过复制方式，RFDNA进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。单链DNA的酶切和连接是比较困难的，因此M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RFDNA。RFDNA很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒
91、DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体DNADNAM13 DNAM13 DNA载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：III VI I IV II X V VII IX III VI I IV II X V VII IX VIIIVIII野生型野生型野生型野生型M13RF-M13RF-DNADNAIII VI I IV II X V VII IX III VI I IV II X V VII IX VIIIVIIIM13mpM13mp系列载体系列载体系列载体系列载体lacZlacZ polylinkpolylinkere
92、r噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体DNADNAM13 DNAM13 DNA载体的特点：载体的特点：载体的特点：载体的特点：使克隆的使克隆的使克隆的使克隆的DNADNA片段以特定单链的形式输出受体细片段以特定单链的形式输出受体细片段以特定单链的形式输出受体细片段以特定单链的形式输出受体细胞外胞外胞外胞外这在这在这在这在DNADNA定向突变中非常定向突变中非常定向突变中非常定向突变中非常有用有用有用有用M13M13重组分子筛选简重组分子筛选简重组分子筛选简重组分子筛选简便便便便被
93、被被被M13M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混形成混形成混形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊混浊混浊混浊斑的混浊度亦越斑的混浊度亦越斑的混浊度亦越斑的混浊度亦越大大大大 但但但但M13-DNAM13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有载体的最大缺陷是装载量小，只有载体的最大缺陷是装载量小，只有载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 1.5 kbkb噬菌体或病毒噬菌体或病毒
94、噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病物的病物的病物的病 毒基因组毒基因组毒基因组毒基因组DNADNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病性的病性的病性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四毒。按照基因组的结构，可将动
95、植物病毒分成四毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：大类：大类：大类： 单链单链单链单链DNADNA病毒病毒病毒病毒双链双链双链双链DNADNA病毒病毒病毒病毒单链单链单链单链RNARNA病毒病毒病毒病毒双链双链双链双链RNARNA病毒病毒病毒病毒 RNA RNA病毒在自我复制时大多存在相应的病毒在自我复制时大多存在相应的病毒在自我复制时大多存在相应的病毒在自我复制时大多存在相应的DNADNA中间反中间反中间反中间反应物，应物，应物，应物，这些中间体可作为载体进行常规的这些中间体可作为载体进行常规的这些中间体可作为载体进行常规的这些中间体可作为载体进行常规的DNADNA重组。重组。重
96、组。重组。考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌粒粒粒粒 l l l l-DNA-DNA载体和载体和载体和载体和M13-DNAM13-DNA载体的装载量最大分别为载体的装载量最大分别为载体的装载量最大分别为载体的装载量最大分别为25 25 kbkb和和和和1.51.5 kbkb，但在很多情况下，往往需要但在很多情况下，往往需要但在很多情况下，往往需要但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源克隆更大的外源克隆更大的外源克隆更大的外源DNADNA片段，片段，片段，片段， 考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌考斯质粒和噬菌粒
97、载体的构建就是为了进一步提高噬菌考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体体体体DNADNA的装载量。的装载量。的装载量。的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNADNA的的的的长度，长度，长度，长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNADNA与包装有与包装有与包装有与包装有关的序关的序关的序关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体
98、的长度，列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时同时同时同时又能保证重组又能保证重组又能保证重组又能保证重组DNADNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗分子在体外仍被包装成有感染力的颗分子在体外仍被包装成有感染力的颗分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这粒，这粒，这粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒斯质粒斯质粒斯质
99、粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNADNA分子在分子在分子在分子在细胞内细胞内细胞内细胞内不能形成噬菌体颗粒。不能形成噬菌体颗粒。不能形成噬菌体颗粒。不能形成噬菌体颗粒。粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有 cos 序列的质粒。cos序列是噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段DNA，克隆的最大D
100、NA片段可达45kb。有的粘粒载体含有两个cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌粒粒粒粒考斯质粒（考斯质粒（考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒载体的构建：考斯质粒载体的构建：考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的考斯质粒是一类人工构建的考斯质粒是一类人工构建的考斯质粒是一类人工构建的含有含有含有含有19781978年年年年CollinsCollins和和和和HohnHohn发明构发明构发明构发明构建建建建pHC79pHC796400 bp6400 bpTcTcrrl ll l fragme
101、ntfragmentcoscosorioriApAprrPstIPstIBamBamHIHISalISalIl l l l-DNA -DNA coscos序列和序列和序列和序列和质粒复制质粒复制质粒复制质粒复制子的子的子的子的特殊类型的载特殊类型的载特殊类型的载特殊类型的载体体体体coscos site - carrying site - carrying plasmidplasmid1.8 1.8 kbkb的的的的l l l l-DNA-DNA片段片段片段片段 + + pBR322pBR322片段片段片段片段装载范围为装载范围为装载范围为装载范围为31 - 45 31 - 45 kbkb考斯
102、质粒与噬菌考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌粒粒粒粒考斯质粒（考斯质粒（考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：能像能像能像能像l l l l-DNA-DNA那样进行体外包装，并高效转染受那样进行体外包装，并高效转染受那样进行体外包装，并高效转染受那样进行体外包装，并高效转染受体细胞体细胞体细胞体细胞 装载量大（装载量大（装载量大（装载量大（45 45 kbkb）且克隆片段具有一定的大小且克隆片段具有一定的大小且克隆片段具有一定的大小且克隆片段具有一定的大小范围范围范围范围能像质粒那样在受体细胞能像质
103、粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容重组操作简便，筛选容重组操作简便，筛选容重组操作简便，筛选容易易易易不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解受体受体受体受体细胞细胞细胞细胞考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌粒粒粒粒噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmidphagemid or phasmid）噬菌粒载体的特点：噬菌粒载体的特点：噬菌粒载体的特点：噬菌粒载体的特点：噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体噬菌粒是一类人工构
104、建的含有单链噬菌体噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、包装序列、包装序列、包装序列、复制子复制子复制子复制子以及以及以及以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体的载体的载体的载体能像能像能像能像M13-DNAM13-DNA那样体外包装，并高效转染受那样体外包装，并高效转染受那样体外包装，并高效转染受那样体外包装，并高效转染受体细胞体细胞体细胞体细胞 装载量比常规的装载量比常规的装载量比常规的装载量比常规的M13mpM13
105、mp系列要大很多（系列要大很多（系列要大很多（系列要大很多（10 10 kbkb）能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主中自主中自主中自主复制复制复制复制重组操作简便，筛选容重组操作简便，筛选容重组操作简便，筛选容重组操作简便，筛选容易易易易通过克隆双链通过克隆双链通过克隆双链通过克隆双链DNADNA能获得同等长度的单一单能获得同等长度的单一单能获得同等长度的单一单能获得同等长度的单一单链链链链DNADNA考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌粒粒粒粒噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmid
106、phagemid or phasmid）重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119pUC118 / 119pUC118 pUC118 pUC18 pUC18 + + M13M13间隔区间隔区间隔区间隔区 IGIGpUC119 pUC119 pUC19 pUC19 + + M13M13间隔区间隔区间隔区间隔区 IGIG500 500 个拷个拷个拷个拷贝贝贝贝3200 3200 bpbpMCMCS SlacZlacZlacIlacIororiiApAprrM13-M13-MGMGpUC118 / pUC118 / 119119表示表示表示表示M
107、13M13辅助噬菌体辅助噬菌体辅助噬菌体辅助噬菌体DNADNA考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌考斯质粒与噬菌粒粒粒粒噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmidphagemid or phasmid）重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pBluescript pBluescript 体外转录载体体外转录载体体外转录载体体外转录载体pBluescript = pUCpBluescript = pUC + + f1-f1-oriori + + P PT3T3 + + P PT7T72958 2958 bpbpMCMCSSlac
108、ZlacZPPT7T7ororiiApAprrf1-f1-orioripBluescripBluescriptptPPT3T3噬菌体启动子噬菌体启动子噬菌体启动子噬菌体启动子P PT3T3和和和和P PT7T7强化强化强化强化外外外外源基因的转录源基因的转录源基因的转录源基因的转录提取出来的单链提取出来的单链提取出来的单链提取出来的单链DNADNA重组重组重组重组分子分子分子分子在噬菌体在噬菌体在噬菌体在噬菌体RNARNA聚合酶的聚合酶的聚合酶的聚合酶的存存存存在下，又可实现外源基在下，又可实现外源基在下，又可实现外源基在下，又可实现外源基因因因因的体外转的体外转的体外转的体外转录录录录人们设
109、计出一些多功能的质粒载体，这类质粒载体有多克隆位点、-互补、噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号。典型的这类质粒有pBluescriptKS（），这类质粒一般由4个质粒组成一套系统，其差别在于多克隆位点方向相反（根据多克隆位点两端Kpn和Sac的顺序，用KS或SK表示），或单链噬菌体的复制启始方向相反（或者说，引导DNA双链中不同链合成单链DNA，用+或-表示）。pBluescriptKS（）的多克隆位点与pUC18/19的不同，且使用f1噬菌体的复制与包装信号序列。人造染色体载体人造染色体载体人造染色体载体人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往人类、动物、植物的全基因组序
110、列分析往往人类、动物、植物的全基因组序列分析往往人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要需要需要需要克克克克隆数百隆数百隆数百隆数百甚至上千甚至上千甚至上千甚至上千 kb kb 的的的的DNADNA片段，片段，片段，片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体此时考斯质粒和噬菌粒载体此时考斯质粒和噬菌粒载体此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载的装载的装载的装载量也远远不能满足需要。量也远远不能满足需要。量也远远不能满足需要。量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、将细菌接合因子或酵母
111、菌染色体上的复制区、分配区、稳稳稳稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外段的外段的外段的外源源源源DNADNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，体，体，体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的
112、复制并遗它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。传。传。传。 目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：细菌人造染色体细菌人造染色体细菌人造染色体细菌人造染色体（BACBAC）酵母人造染色体酵母人造染色体酵母人造染色体酵母人造染色体（YACYAC）人造染色体载体人造染色体载体人造染色体载体人造染色体载体细菌人造染色体（细菌人造染色体（细菌人造染色体（细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BACBacterial Artificial Chromosomes BA
113、C）细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F F质粒的质粒的质粒的质粒的基础上基础上基础上基础上构建的，其装载量范围在构建的，其装载量范围在构建的，其装载量范围在构建的，其装载量范围在50 - 30050 - 300 kbkb之间之间之间之间各种类型的各种类型的各种类型的各种类型的pBACspBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝贝贝贝pBACspBACs主要适用于：主要适用于：主要适用于：主要适用
114、于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene clustergene cluster）结结结结构构构构构建动植物基因文库构建动植物基因文库构建动植物基因文库构建动植物基因文库F质粒大肠杆菌的F因子是一个约100kb的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（WillettsandSkurray，1987）。虽然F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需
115、。细菌人工染色体是基于大肠杆菌的F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子）的严谨型控制的复制子oriS （Shizuyaetal.1992），一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA ,parB ,和parC ）。BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。20060424真核生物载体电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性，达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。该技术目前一方面应用于细菌、
116、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移，另一方面应用于细胞融合制备杂交细胞和动物克隆等。显微注射技术将外源DNA注入细胞基因枪技术是一种将核酸直接发送至细胞内的物理学方法。PDS-1000/H台式基因枪可以实现对细胞的原位转导；应用于包括培养细胞、组织、器官、植物、动物、细菌和细胞器官等各种不同的目标。穿梭载体（Shuttlevector）是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在E.coli 中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。酵母附加型质粒2um质粒是非常好的克隆载体，它有6kb大小，在酵母细胞中的拷贝数
117、在70-200之间，利用质粒的复制起始位点进行复制，许多酶由寄主细胞提供，质粒中含有编码蛋白质的基因REP1,REP2。2um质粒的问题：选择标记的问题。在实践中，利用酵母的正常的基因，一般是编码氨基酸合成的酶，如LEU2基因编码-异丙基苹果酸脱氢酶，参与丙酮酸向亮氨酸的转化。为了利用LEU氨酸作为选择标记，需要用到一种特殊的寄主，寄主必须是LEU-2营养缺陷体这样的寄主只有在添加亮氨酸的条件下才能生长。质粒中含有LEU-2合成基因，可以在基本培养基上生长。以2um质粒为基础的载体酵母附加质粒来自于2um质粒的载体称为酵母附加载体或者YEps。YEps可以含有完整的2um质粒，也可以只含有2u
118、m质粒的复制起点，如YEp13以后的类型。YEp13是一个穿梭质粒，含有2um质粒的复制起点和选择基因LEU2,YEp13还包含pBR322的完整序列，因此可以在大肠杆菌也可以在酵母中进行选择。YEp的结构YEp整合到酵母染色体上根癌农杆菌Ti质粒几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A.tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumorinducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulenceregion)基因的启动表达，Vir基
119、因的产物将Ti质粒上的一段TDNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链TDNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。TDNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。Ti质粒大约在160240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（regionencodingc
120、onjugation)和Ori区（originofreplication)。T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。T-DNA切除由Vir区编码的特异性内切酶完成，分别在LB和RB的第三个碱基和第四个碱基之间产生缺口，并形成单链T-DNA。T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不对称的，RB顺序与整合有关，而LB无关。T-DNA的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列，但整合位点的特异性尚未确定。植物细胞转化的共整合系统T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr。首先在E
121、.coli中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上，Kmr筛选转化细胞。植物细胞转化的双元系统目前T-DNA转化植物细胞的标准方法是双元系统，即穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。典型的杆状病毒表达系统典型的杆状
122、病毒表达系统是利用大肠杆菌中位点特异的转座或昆虫细胞中的同源重组来产生重组杆状病毒。这些过程要求大量的操作时间，周期长达几周。BaculoDirect杆状病毒表达系统简化了这些过程，节省了大量时间，使你可以比以往任何时候更快地获得杆状病毒表达结果。BaculoDirect系统利用快速、简便的Gateway技术。BaculoDirect线性DNA包含了attR位点，允许与包含有目的基因的Gateway入门克隆进行有效的重组。将entry克隆、BaculoDirect线性DNA和GatewayLRClonase酶混合物稍加混匀，在室温下反应1小时即可。最终的反应混和物中包含有携带目的基因的杆状病毒
123、，可以直接用于转染昆虫细胞（sf9或sf21）。SV40病毒作为载体反转录病毒反转录病毒载体是常用的病毒载体之一。反转录病毒的DNA基因组的两端各有一个长末端重复序列(5LTR和3LTR)，有一个包装病毒颗粒时必需的非编码序列+，同时有三个编码蛋白质的基因gag、pol和env。反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10kb左右，以很高的转染率感染宿主细胞，特别是分裂中的细胞。转入宿主的细胞后，反转录病毒载体随即整合到宿主细胞基因组内，这种整合的位点是随机的。反转录病毒载体在构建时，删去了poi、env基因和gag基因的3端，但保留了病毒颗粒所需的+序列。其目的是在于提高载体的安全性，防止反
124、转录病毒进入宿主细胞后进行增殖并包装成病毒颗粒对宿主细胞造成可能的伤害。这样，在制备反转录病毒载体时，就必须有一个辅助细胞系，这种细胞内有缺陷型病毒可以提供包装用的外壳蛋白，但自身没有包装信号。这样，反转录病毒载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。反转录病载体多半用于基因治疗，由于病毒载体在宿主细胞基因组上随机插入，人们担心会引起不安全的后果，这种载体还在不断改进之中。YAC人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90分钟；含16条
125、染色体，其大小为225-1900kb，总计有14106bp；具真核mRNA的加工活性。人造染色体载体人造染色体载体人造染色体载体人造染色体载体酵母人造染色体（酵母人造染色体（酵母人造染色体（酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YACYeast Artificial Chromosomes YAC）YACYAC载体应含有下列元载体应含有下列元载体应含有下列元载体应含有下列元件：件：件：件： 酵母染色体的端粒序酵母染色体的端粒序酵母染色体的端粒序酵母染色体的端粒序列列列列 酵母人造染色体的构酵母人造染色体的构酵母人造染色体的构酵母人造染色体的构建：建：建：建：
126、pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoREcoRI IURAURA33TETELLBamHBamHIITETELLororiiApAprrTRP1TRP1ARS1ARS1酵母染色体的复制酵母染色体的复制酵母染色体的复制酵母染色体的复制子子子子 酵母染色体的中心粒序酵母染色体的中心粒序酵母染色体的中心粒序酵母染色体的中心粒序列列列列 酵母系统的酵母系统的酵母系统的酵母系统的选择标选择标选择标选择标记记记记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的选择标选择标选择标选择标记记记记YACYAC载体的装载量为载体的装载量为载体的装载量
127、为载体的装载量为350 - 400 350 - 400 kbkb人造染色体载体人造染色体载体人造染色体载体人造染色体载体酵母人造染色体（酵母人造染色体（酵母人造染色体（酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YACYeast Artificial Chromosomes YAC）酵母人造染色体的使酵母人造染色体的使酵母人造染色体的使酵母人造染色体的使用：用：用：用：pYAC4pYAC4CECENNEcoRIEcoRIURAURATELTELBamHBamHIITETELLororiiApAprrTRTRPPARARSSEcoREcoRIIEcoREcoRIIE
128、coREcoRIIBamBamHIHI连连连连接接接接转化酵母转化酵母转化酵母转化酵母菌菌菌菌重组酵母染色重组酵母染色重组酵母染色重组酵母染色体体体体pYAC4：当用 BamH切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的DNA片段。YAC载体的原理性工作流程：对于BamH切割后形成的微型酵母染色体，当用EcoR或Sma切割抑制基因sup4内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化
129、进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。装载了外源DNA片段的重组子导致抑制基因sup4插入失活，从而形成红色菌落；而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源DNA片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了YAC文库。YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达200-500kb，有的可达1Mb以上，甚至达到2Mb。用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因营养缺陷型互补基因和和显性基因显性基因两大类两大类 营养缺陷型互补基因主要有
130、氨基酸和核苷酸生物合成基因，营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：如： LEU LEU、TRPTRP、HISHIS、LYSLYS、URAURA、ADEADE但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难营养缺陷型的互补基因营养缺陷型的互补基因用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白性蛋白显性标记基因显性标记基因 aph aph 氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶抗抗G418G418 cat cat 氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶抗氯霉
131、素抗氯霉素 dhfr dhfr 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤抗氨甲喋呤和磺胺和磺胺 cup1 cup1 铜离子螯合物铜离子螯合物耐受铜离耐受铜离子子 suc2 suc2蔗糖转化酶蔗糖转化酶耐受高浓耐受高浓度蔗糖度蔗糖 ilv2 ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲抗硫酰脲除草剂除草剂标记基标记基因因编码产编码产物物遗传表遗传表型型C用于基因转移的受体菌或细胞3 3基因工程的基本条件基因工程的基本条件各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工
132、程受体受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件受体细胞应具备的条件限制性缺陷型限制性缺陷型限制性缺陷型限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（外切酶和内切酶活性缺陷（外切酶和内切酶活性缺陷（外切酶和内切酶活性缺陷（recBrecB- -，recCrecC- -，hsdRhsdR- -） 重组整合缺陷型重组整合缺陷型重组整合缺陷型重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞用于基因扩增或高效表达的受体细胞用于基因扩增或高效表达的受体细胞用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recArecA- -） 具有
133、较高的转化效率具有较高的转化效率具有较高的转化效率具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型具有与载体选择标记互补的表型具有与载体选择标记互补的表型具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外防止重组细菌扩散污染，生物武器除外防止重组细菌扩散污染，生物武器除外防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特性性性性大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，遗传背景清楚，载体受
134、体系统完备，生长迅速，遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定培养简单，重组子稳定培养简单，重组子稳定培养简单，重组子稳定 适用于外源适用于外源适用于外源适用于外源DNADNA的扩增和克隆、原核生物基因的的扩增和克隆、原核生物基因的的扩增和克隆、原核生物基因的的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是高效表达、基因文库的构建，是高效表达、基因文库的构建，是高效表达、基因文库的构建，是DNADNA重组实验和基因重组实验和基因重组实验和基因重组实验和基因工程的主要受体菌工程的主要受体菌工程的主要受体菌工程的主要受体菌 产结构复杂、种类繁多的内毒产结构复杂、种类繁
135、多的内毒产结构复杂、种类繁多的内毒产结构复杂、种类繁多的内毒素素素素各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特性性性性枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌枯草杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅，生长迅，生长迅，生长迅速，培养简单，不产内毒素速，培养简单，不产内毒素速，培养简单，不产内毒素速，培养简单，不产内毒素 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白适用于原核生物基因的克隆
136、、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌多肽的有效分泌多肽的有效分泌多肽的有效分泌 遗传欠稳定，载体受体系统欠完遗传欠稳定，载体受体系统欠完遗传欠稳定，载体受体系统欠完遗传欠稳定，载体受体系统欠完备备备备各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特性性性性链霉菌链霉菌链霉菌链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素内毒素内毒素内毒素主要用于抗生素生产菌株的改主要用于抗生素生产菌株的改主要用于抗生素生产菌株的改主要用
137、于抗生素生产菌株的改良良良良遗传不稳定，生长相对缓遗传不稳定，生长相对缓遗传不稳定，生长相对缓遗传不稳定，生长相对缓慢慢慢慢各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特性性性性酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 适用于外源适用于外源适用
138、于外源适用于外源DNADNA的扩增、克隆以及真核生物基因的扩增、克隆以及真核生物基因的扩增、克隆以及真核生物基因的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是控的研究，是控的研究，是控的研究，是DNADNA重组实验和基因工程重要的真核性重组实验和基因工程重要的真核性重组实验和基因工程重要的真核性重组实验和基因工程重要的真核性受体菌受体菌受体菌受体菌 内源性蛋白产物种类繁多且含量高内源性蛋白产物种类繁多且含量高内源性蛋白
139、产物种类繁多且含量高内源性蛋白产物种类繁多且含量高各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特性性性性昆虫细胞（家蚕）昆虫细胞（家蚕）昆虫细胞（家蚕）昆虫细胞（家蚕） 具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定相对较快，培养成本低廉，遗传稳定相对较快，培养成本低廉，遗传稳定相对较快，培养成本低廉，遗传稳定 适用于真核生物基因的高效表达适用于真核生物基因的高效表达适用于真核生物基因的高效表达适用于真核生物
140、基因的高效表达 DNADNA重组操作系统欠完善重组操作系统欠完善重组操作系统欠完善重组操作系统欠完善各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特性性性性哺乳动物细胞（中国哺乳动物细胞（中国哺乳动物细胞（中国哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞仓鼠卵巢细胞仓鼠卵巢细胞仓鼠卵巢细胞 CHOCHO） 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统有合适的糖基化修饰系统有合适的糖基化修饰系统有合适的糖基化修饰系统 适用于哺乳类动物
141、和人的基因表达调控研究、基适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是因药物的生产，是因药物的生产，是因药物的生产，是DNADNA重组实验和基因工程的主要哺重组实验和基因工程的主要哺重组实验和基因工程的主要哺重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体乳动物受体乳动物受体乳动物受体 细胞培养条件苛刻，生长缓细胞培养条件苛刻，生长缓细胞培养条件苛刻，生长缓细胞培养条件苛刻，生长缓慢慢慢慢 各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特各种基因工程受体的特性性性性植物细胞（拟南芥菜、烟叶植物细胞
142、（拟南芥菜、烟叶植物细胞（拟南芥菜、烟叶植物细胞（拟南芥菜、烟叶） 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良生产
143、，农作物品质的改良生产，农作物品质的改良生产，农作物品质的改良 遗传操作繁琐遗传操作繁琐遗传操作繁琐遗传操作繁琐 实验室常用的基因工程实验室常用的基因工程实验室常用的基因工程实验室常用的基因工程受体受体受体受体大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌用于接受质粒：用于接受质粒：用于接受质粒：用于接受质粒：C600C600、W3110W3110、HB101HB101、JM83JM83、 JM101JM101（ApApss、TcTcss、CmCmss） 用于接受用于接受用于接受用于接受l l l l-DNA-DNA：LE392LE392、ED8654ED8654 酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞 CHO CHO 毕赤酵母毕赤酵母毕赤酵母毕赤酵母啤酒酵母啤酒酵母啤酒酵母啤酒酵母
