第十章氨基酸多肽和蛋白质类药品检验

《第十章氨基酸多肽和蛋白质类药品检验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第十章氨基酸多肽和蛋白质类药品检验（152页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第十章第十章 氨基酸、多肽因氨基酸、多肽因子和蛋白质类药品检验子和蛋白质类药品检验第九章第九章 抗生素类药物分析与生物抗生素类药物分析与生物检定法检定法基本要求：基本要求： 掌握氨基酸定性鉴别的方法，熟悉氨基酸特殊杂质及掌握氨基酸定性鉴别的方法，熟悉氨基酸特殊杂质及安全性检查，掌握氨基酸含量测定方法，掌握多肽因安全性检查，掌握氨基酸含量测定方法，掌握多肽因子类药物的定性鉴别方法，熟悉多肽因子类药物的检子类药物的定性鉴别方法，熟悉多肽因子类药物的检查方法，掌握多肽因子类药物生物效价的测定方法，查方法，掌握多肽因子类药物生物效价的测定方法，掌握蛋白质类药物的鉴别和检查方法，掌握蛋白质含掌握蛋白质类

2、药物的鉴别和检查方法，掌握蛋白质含量测定和效价测定方法，了解几种氨基酸、多肽因子量测定和效价测定方法，了解几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析过程。和蛋白质药物的质量分析过程。第九章第九章 抗生素类药物分析与生物抗生素类药物分析与生物检定法检定法基本内容基本内容第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验多肽因子类和蛋白质类药品检验第三节第三节 几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验氨基酸是氨基酸是治疗蛋白质代谢紊乱治疗蛋白质代谢紊乱、蛋白质缺损蛋白质缺

3、损所引起的所引起的一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创制了一些新的生化药物制了一些新的生化药物。如如甲基酪氨酸甲基酪氨酸治疗治疗嗜铬细胞瘤嗜铬细胞瘤氧苯丙氨酸氧苯丙氨酸用于用于类癌瘤综合征类癌瘤综合征偶氮丝氨酸偶氮丝氨酸治疗治疗白血病白血病乙酰羟脯氨酸乙酰羟脯氨酸用于用于治疗类风湿关节炎治疗类风湿关节炎第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验氨基酸为氨基

4、酸为白色晶状体白色晶状体，熔点很高，多在熔融时分解，熔点很高，多在熔融时分解，都能溶解在强酸强碱中都能溶解在强酸强碱中，形成的盐多能溶于水。，形成的盐多能溶于水。氨基酸在氨基酸在等电点等电点（pIpI）时）时溶解度最小溶解度最小，最稳定。，最稳定。中性中性pIpI值在值在5 56.36.3左右。左右。酸性酸性pIpI值在值在2.82.83.23.2左右。左右。碱性氨基酸的碱性氨基酸的pIpI值在值在7.67.610.810.8左右。左右。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验一、氨基酸的定性鉴别一、氨基酸的定性鉴别旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析、旋光度、熔点、溶解度、纸

5、层析、氨基酸自动化分析、气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。1 1、化学鉴别法、化学鉴别法氨基酸的氨基酸的鉴别最常用的方法鉴别最常用的方法是根据所有氨基酸均能与是根据所有氨基酸均能与茚三酮茚三酮显蓝紫色显蓝紫色。采用茚三酮显色法，中国药典（采用茚三酮显色法，中国药典（20102010年）二部对所收年）二部对所收载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。如要对某种氨基酸加以鉴别，可借助于一些如要对某种氨基酸加以鉴别，可借助于一些特定的显特定的显色反应色反应。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（1 1）茚三酮反应

6、茚三酮反应 茚三酮在酸性溶液中与茚三酮在酸性溶液中与- -氨基酸共氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应，最后生成紫色热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应，最后生成紫色物质。物质。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）在室温下）在室温下氨基酸与亚硝酸氨基酸与亚硝酸反应，生成反应，生成氮气氮气。在标在标准条件下测定生成氮气体积，即可计算氨基酸的量。准条件下测定生成氮气体积，即可计算氨基酸的量。注：注：生成的氮气只有生成的氮气只有一半来自氨基酸一半来自氨基酸。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（3 3） 第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（4 4）第一节第一

7、节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（5 5）第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（6 6）第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（7 7）第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（8 8）乙醛蒸气接触亚硝基铁氰化钠和二乙胺时蓝紫色乙醛蒸气接触亚硝基铁氰化钠和二乙胺时蓝紫色第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（9 9）组氨酸的）组氨酸的侧链咪唑基侧链咪唑基也能与也能与重氮苯磺酸重氮苯磺酸反应形成反应形成与与PaulyPauly反应相似的化合物，呈棕红色。反应相似的化合物，呈棕红色。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（1010）借助这些特定的显色反应

8、可以对氨基酸进行鉴别。借助这些特定的显色反应可以对氨基酸进行鉴别。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验2 2、光谱鉴别法、光谱鉴别法（1 1）紫紫外外吸吸收收光光谱谱法法 在在2020种种天天然然氨氨基基酸酸中中，只只有有酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸和和苯苯丙丙氨氨酸酸在紫外区有最大吸收在紫外区有最大吸收。酪酪 氨氨 酸酸 的的 max 275nm 275=1.4x103苯苯丙丙氨氨酸酸的的 max257nm 257=2.0x102色色 氨氨 酸酸 的的 max 280nm 280=5.6x1031 1：酪氨酸：酪氨酸2 2：色氨酸：色氨酸3 3：苯丙氨酸。：苯丙氨酸。第一节第一节 氨

9、基酸类药品检验氨基酸类药品检验这这三三种种氨氨基基酸酸可可以以通通过过紫紫外外吸收光谱吸收光谱加以鉴别。加以鉴别。精精密密称称取取酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸、苯丙氢酸各适量苯丙氢酸各适量。用用水水制制成成每每1mL1mL含含20g20g（色色氨氨酸酸）、40g40g（酪酪氨氨酸酸）、200g200g（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）。在在波波长长230230300nm300nm测测定定各各氨氨基酸的吸收光谱基酸的吸收光谱，如右图。，如右图。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）红红外外吸吸收收光光谱谱图图 氨氨基基酸酸在在红红外外区区都都有有特特性性图图谱谱，可可以以通通过过与与标标准

10、准氨氨基基酸酸图图谱谱比比较较作作为为氨氨基基酸酸的的鉴鉴别别依依据。据。用用红红外外分分光光光光度度法法进进行行氨氨基基酸酸鉴鉴别别时时，除除另另有有规规定定外外，通通常常固固体体供供试试品品均均采采用用溴溴化化钾钾片片法法，在在400400667cm667cm-1-1范围范围内测定其吸收图谱。内测定其吸收图谱。所所得得的的吸吸收收图图谱谱各各主主要要吸吸收收峰峰波波长长和和各各吸吸收收峰峰间间的的相相互强度关系互强度关系均应与对照的图谱一致。均应与对照的图谱一致。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验3 3、薄层色谱鉴别法、薄层色谱鉴别法在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨

11、基在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基酸。酸。（1 1）薄层板的制备薄层板的制备第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）十十一一种种氨氨基基酸酸混混合合液液（色色、蛋蛋、亮亮、异异亮亮、甘甘、赖、苏、缬、苯丙、组、精）与赖、苏、缬、苯丙、组、精）与对照液对照液的的制备制备。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（3 3）点点样样、展展开开和和显显色色 吸吸取取混混合合液液和和对对照照液液各各3L3L，分别点于同一薄层板上，分别点于同一薄层板上。以以正正丁丁醇醇- -水水- -异异丁丁酸酸- -醋醋酸酸（505050505 57 7）之之上上层层作作展展开开剂剂

12、，进进行行单单向向三三次次展展开开，展展开开约约15cm15cm，每每次次必必须须待溶剂挥发尽待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开后，再进行下一次展开。喷喷以以显显色色剂剂（吲吲哚哚醌醌1g1g，溶溶于于100mL100mL无无水水乙乙醇醇和和10mL10mL冰醋酸中）置冰醋酸中）置100100干燥干燥5 510min10min至显色完全为止至显色完全为止。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验本本层层析析系系统统中中，由由于于分分离离的的程程度度与与各各种种氨氨基基酸酸显显出出不不同同的的颜颜色色，可可以以区别十一种氨基酸。区别十一种氨基酸。用用茚茚三三酮酮- -硝硝酸酸钠钠试试剂剂亦亦

13、能能显显出出不不同同颜颜色色的的色色斑，且灵敏度较高斑，且灵敏度较高。用用E.MerckE.Merck规规格格微微晶晶纤纤维维素素比比其其他他规规格格的的微微晶晶纤纤维维素素的的分分离离效效果果和和重重现性较好。现性较好。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（3 3）点点样样、展展开开和和显显色色 吸吸取取混混合合液液和和对对照照液液各各3L3L，分别点于同一薄层板上，分别点于同一薄层板上。以以正正丁丁醇醇- -水水- -异异丁丁酸酸- -醋醋酸酸（505050505 57 7）之之上上层层作作展展开开剂剂，进进行行单单向向三三次次展展开开，展展开开约约15cm15cm，每每次次必必

14、须须待溶剂挥发尽待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开后，再进行下一次展开。喷喷以以显显色色剂剂（吲吲哚哚醌醌1g1g，溶溶于于100mL100mL无无水水乙乙醇醇和和10mL10mL冰醋酸中）置冰醋酸中）置100100干燥干燥5 510min10min至显色完全为止至显色完全为止。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验二、氨基酸特殊杂质及安全性检查二、氨基酸特殊杂质及安全性检查1 1、特殊杂质检查、特殊杂质检查氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类的氨基酸的氨基酸。用用薄层色谱法薄层色谱法进行限量检查：将样品配成一定浓度的进行限量检查：

15、将样品配成一定浓度的供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在同一硅胶同一硅胶G G薄板上，一般用薄板上，一般用正丁醇水冰醋酸正丁醇水冰醋酸（3 31 11 1）展开晾干后，喷）展开晾干后，喷茚三酮茚三酮的的丙酮溶液丙酮溶液显色，规定显色，规定供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点，以此限制其他氨基酸的含量。以此限制其他氨基酸的含量。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验氨基酸和有些小分子多肽药物是经过氨基酸和有些小分子多肽药物是经过酶解酶解或或化学方法化学方法裂解大分子蛋白裂解大分子蛋

16、白后经层析或超滤等方法得到的小分子后经层析或超滤等方法得到的小分子物质物质，因此检查是否存在大分子蛋白质非常重要。因此检查是否存在大分子蛋白质非常重要。方法方法：取取适宜浓度适宜浓度的样品溶液，加的样品溶液，加等体积等体积的的2020磺基磺基水杨酸水杨酸溶液，溶液不发生浑浊则判定无蛋白质。溶液，溶液不发生浑浊则判定无蛋白质。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验2 2、安全性检查、安全性检查影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，主要影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，主要为热原的含量。为热原的含量。中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。中国药典所收载的氨基酸基本上都规

17、定了热原检查。采用采用家兔法家兔法，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内观察内，在规定时间内观察家兔体温升高家兔体温升高的情况，以判定的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。供试品中所含热原的限度是否符合规定。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验三、氨基酸含量测定三、氨基酸含量测定1 1、茚三酮法、茚三酮法茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。当当茚三酮茚三酮在在酸性条件酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧下和氨基酸反应时，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚

18、三酮则成化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分子茚三酮进一步缩合生成子茚三酮进一步缩合生成蓝紫色物蓝紫色物，最大吸收值的波，最大吸收值的波长为长为570nm570nm。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验茚三酮反应为一切茚三酮反应为一切-氨基酸氨基酸所共有，反应灵敏，根所共有，反应灵敏，根据反应所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。据反应所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。本法可允许的测定范围是本法可允许的测定范围是0.50.550g50g氨基酸氨基酸。该法又分为该法又分为Yem

19、mYemm法法、RosenRosen法法和和HydrindantinHydrindantin法法。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（1 1）YemmYemm法法 取取样样品品1.0mL1.0mL（含含0.020.020.5mol/L0.5mol/L氨氨基基酸酸），加加枸枸橼橼酸酸缓缓冲冲液液（枸枸橼橼酸酸21g21g溶溶于于100ml100ml水水中中，加加 1.0mol/L1.0mol/L氢氢 氧氧 化化 钠钠 溶溶 液液 200mL200mL， 加加 水水 至至500mL500mL）0.5mL0.5mL，茚茚三三酮酮溶溶液液（茚茚三三酮酮2.5g2.5g溶溶于于50mL50m

20、L甲甲基基溶溶纤纤剂剂中中）0.2mL0.2mL，氰氰化化钾钾溶溶液液（0.01mol/L0.01mol/L氰氰化化钾钾溶溶液液5mL5mL与与25mL25mL甲甲基基溶溶纤纤剂剂混混合合）1.0mL1.0mL，充充分分混混匀匀，沸水浴加热沸水浴加热15min15min，冷却。，冷却。加入加入稀释剂稀释剂3 35mL5mL，于，于570nm570nm波长处测定。波长处测定。按标准曲线计算出含氨基酸的量。按标准曲线计算出含氨基酸的量。如所测氨基酸种类不明时如所测氨基酸种类不明时，可用可用亮氨酸亮氨酸作标准曲线。作标准曲线。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）RosenRose

21、n法法 该法是该法是YemmYemm法的改良。法的改良。取取样样品品1.0mL1.0mL，加加茚茚三三酮酮溶溶液液（茚茚三三酮酮3g3g溶溶于于100mL100mL甲甲基基溶溶纤纤剂剂中中）及及氰氰化化钠钠溶溶液液（氰氰化化钠钠490mg490mg溶溶于于1L1L水水中中，取取该该溶溶液液20mL20mL，加加醋醋酸酸缓缓冲冲液液至至1L1L）各各0.5mL0.5mL，充充分分混混匀匀，沸沸水水浴浴加加热热15min15min，立立即即加加5050（V/VV/V）异异丙醇丙醇，充分搅拌，放冷，比色，计算。，充分搅拌，放冷，比色，计算。（ 3 3） HydrindantinHydrindanti

22、n法法 取取 茚茚 三三 酮酮 20g20g及及 茚茚 烷烷 酮酮（HydrindantinHydrindantin）3g3g溶溶于于750mL750mL甲甲基基溶溶纤纤剂剂及及4mol/L4mol/L醋醋酸酸缓缓冲冲液液（醋醋酸酸钠钠272g272g溶溶于于适适量量水水中中，加加冰冰醋醋酸酸50mL50mL，加加水水至至500mL500mL）250mL250mL中中，混混合合作作为为显显色色指指示示剂剂。取样品取样品1 12mL2mL，加等量显色指示剂，以下操作同上法。加等量显色指示剂，以下操作同上法。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验2 2、三硝基苯磺酸（、三硝基苯磺酸（TNB

23、STNBS）法）法三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。之一。TNBSTNBS在在偏碱性偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成的条件下与氨基酸反应，先形成中间络中间络合物合物（带有等摩尔（带有等摩尔 ），如下式。），如下式。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验中间络合物在光谱下有两个吸收值相近的高峰，分别中间络合物在光谱下有两个吸收值相近的高峰，分别位于位于355nm355nm和和420nm420nm附近。附近。溶液一旦酸化溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯氨基酸，中间络合物转化成三硝基苯氨基酸（TNPTNP氨基酸）

24、，氨基酸），420nm420nm处的吸收值显著下降，而处的吸收值显著下降，而350nm350nm附近的吸收峰则移至附近的吸收峰则移至340nm340nm处处。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验利用利用TNBSTNBS与氨基酸反应的这一特性，可在与氨基酸反应的这一特性，可在420nm420nm处处（偏碱性偏碱性溶液中）或在溶液中）或在340nm340nm（偏酸性偏酸性溶液中）对氨溶液中）对氨基酸进行定量测定。基酸进行定量测定。本法允许的测定范围是本法允许的测定范围是0.050.050.4mol0.4mol氨基酸氨基酸。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验3 3、铜复合物紫外

25、吸收法、铜复合物紫外吸收法在合适的在合适的pHpH值条件下，值条件下，2mol -2mol -氨基酸与氨基酸与1mol1mol铜离子铜离子形成氨基酸形成氨基酸- -铜复合物：铜复合物：第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验此复合物呈此复合物呈蓝色蓝色，除了在，除了在620nm620nm有吸收峰外，在有吸收峰外，在230nm230nm有最大吸收，其摩尔吸收系数在有最大吸收，其摩尔吸收系数在230nm230nm处为处为620nm620nm处的处的100100倍左右倍左右，因此利用氨基酸，因此利用氨基酸- -铜复合物的紫外吸收以铜复合物的紫外吸收以进行氨基酸的微量测定。进行氨基酸的微量测定。

26、本法可允许测定范围是本法可允许测定范围是5050500mol/mL500mol/mL的氨基酸。的氨基酸。适用于蛋白质水解速率和水解程度的测定。适用于蛋白质水解速率和水解程度的测定。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验4 4、甲醛滴定法、甲醛滴定法氨基酸的氨基酸的NHNH3 3+ +基的基的pKpK值常在值常在9.09.0以上以上，不能用一般指示，不能用一般指示剂作酸碱滴定测定。剂作酸碱滴定测定。但但甲醛甲醛可与氨基酸中不带电荷的氨基相互作用，可与氨基酸中不带电荷的氨基相互作用，促使促使NHNH3 3+ +上的氢离子释放上的氢离子释放。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验在在

27、pHpH值中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸上的氨值中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基（或亚氨基）结合，使下述平衡向右移动，促进氢基（或亚氨基）结合，使下述平衡向右移动，促进氢离子释放，使溶液酸度增加。离子释放，使溶液酸度增加。即可即可用用酚酞酚酞作指示剂，以作指示剂，以氢氧化钠氢氧化钠来滴定。来滴定。每释放出每释放出一个氢离子一个氢离子，就相当有，就相当有一个氨基氮一个氨基氮，从滴定，从滴定所用氢氧化钠量可以计算样品中氨基氮含量所用氢氧化钠量可以计算样品中氨基氮含量以及以及氨基氨基酸含量。酸含量。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验5 5、非水溶液滴定法、非水溶液滴定法中国

28、药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药物，除物，除谷氨酸谷氨酸用用氢氧化钠氢氧化钠为标准溶液的酸碱滴定法，为标准溶液的酸碱滴定法，其余均根据其结构特性，采用了其余均根据其结构特性，采用了非水酸碱滴定法非水酸碱滴定法。用用冰醋酸作溶剂冰醋酸作溶剂，高氯酸高氯酸作作标准溶液滴定，电位法或标准溶液滴定，电位法或指示剂法确定终点。指示剂法确定终点。适用于适用于常量氨基酸常量氨基酸的含量测定。的含量测定。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（1 1）直接滴定法直接滴定法 适用于能适用于能溶于冰醋酸溶

29、于冰醋酸的氨基酸。的氨基酸。精精密密称称定定氨氨基基酸酸样样品品约约50mg50mg，溶溶于于20ml20ml冰冰醋醋酸酸中中，加加2 2滴甲基紫指示剂，用高氯酸标准液滴定。滴甲基紫指示剂，用高氯酸标准液滴定。终点为紫色消失，终点为紫色消失，呈现蓝色呈现蓝色，计算，即得。，计算，即得。用用直直接接法法测测定定的的氨氨基基酸酸有有丙丙氨氨酸酸、精精氨氨酸酸、组组氨氨酸酸、亮亮氨氨酸酸、甲甲硫硫氨氨酸酸、苯苯丙丙氨氨酸酸、色色氨氨酸酸、缬缬氨氨酸酸、异异亮氨酸、苏氨酸等。亮氨酸、苏氨酸等。谷谷氨氨酸酸和和门门冬冬氨氨酸酸在在高高氯氯酸酸中中不不溶溶解解，可可将将样样品品溶溶于于2mL2mL甲甲酸酸

30、中中，再再加加20mL20mL冰冰醋醋酸酸，直直接接用用标标准准高高氯氯酸酸溶溶液滴定。液滴定。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）回滴法回滴法 适用于适用于不易溶于冰醋酸不易溶于冰醋酸而能溶于高氯酸而能溶于高氯酸的氨基酸。的氨基酸。精密称定氨基酸样品约精密称定氨基酸样品约30-40mg30-40mg，溶于，溶于5mL5mL高氯酸标准高氯酸标准液中，加液中，加2 2滴甲基紫指示剂，用醋酸钠溶液滴定剩余滴甲基紫指示剂，用醋酸钠溶液滴定剩余的酸，颜色的酸，颜色由黄至绿至蓝至初次呈现不褪色的紫色由黄至绿至蓝至初次呈现不褪色的紫色为为终点，计算，即得。终点，计算，即得。用用回滴法回

31、滴法测定的氨基酸有赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸测定的氨基酸有赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等。等。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验6 6、双波长分光度法、双波长分光度法双双波波长长分分光光光光度度法法的的理理论论基基础础是是差差吸吸光光度度和和等等吸吸收收波波长长。它它 采采 用用 测测 量量 波波 长长 （ 主主 波波 长长 p p, , Primary Primary WavelengthWavelength） 和和 参参 比比 波波 长长 （ 次次 波波 长长 s s, , Second Second WavelengthWavelength）两两个个不不同同波波长长同同时时测测定定

32、一一个个样样品品溶溶液液，可可以以克克服服单单波波长长测测定定的的缺缺点点，提提高高了了测测定定结结果果的的精精密密度和准确度。度和准确度。待待测测溶溶液液在在p p与与s s两两个个波波长长处处测测定定的的差差吸吸光光度度AA与与试样中试样中待测物质的浓度待测物质的浓度C C成成正比正比。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验复复方方氨氨基基酸酸注注射射液液中中，采采用用双双波波长长分分光光光光度度法法测测定定氨氨基基酸酸的的含含量量，可可消消除除共共存存组组分分干干扰扰原原理理，不不经经分分离离直直接接测测定，操作简便、准确。定，操作简便、准确。色色氨氨酸酸测测定定波波长长280n

33、m280nm，酪酪氨氨酸等吸收波长酸等吸收波长303nm303nm。酪酪氨氨酸酸测测定定波波长长240nm240nm，色色氨氨酸等吸收波长酸等吸收波长292nm292nm。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验7 7、导数分光光度法、导数分光光度法在一定条件下，溶液组分在一定条件下，溶液组分的吸光度对波长的吸光度对波长的的微分值微分值与组分浓度仍保持线性关与组分浓度仍保持线性关系系，利用利用吸光度导数光谱吸光度导数光谱可以可以定量测定组分定量测定组分含量含量，称为导数分光光度法。称为导数分光光度法。导数光谱数值测定有三种导数光谱数值测定有三种方法：方法：切线法切线法，峰谷法峰谷法，峰零

34、法峰零法。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验根根据据紫紫外外吸吸收收光光谱谱选选定定导导数数光光谱谱波波长长范范围围（应应包包含含被被测组分的最大吸收波长）测组分的最大吸收波长）。按按导导数数分分光光光光度度法法测测定定被被测测混混合合组组分分的的一一阶阶、二二阶阶和和三阶三阶导数光谱导数光谱。选取选取其中能其中能排除干扰排除干扰组分干扰的组分干扰的导数光谱导数光谱。在在被被测测组组分分的的最最大大吸吸收收波波长长处处用用切切线线法法（或或峰峰谷谷法法、峰零法）量得的峰零法）量得的振幅值振幅值D D与与标准品浓度标准品浓度做做标准曲线标准曲线。测测定定样样品品在在最最大大吸吸收收波

35、波长长下下的的振振幅幅值值D D，代代入入回回归归方方程，计算样品浓度。程，计算样品浓度。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验用用二二阶阶导导数数光光谱谱法法测测定定复复方方氨氨基基酸酸中中色色氨氨酸酸含含量量，浓浓度度范范围围在在9-45gml9-45gml-1-1时时, , 呈呈良良好好线线性性。平平均均回回收率收率100.43%, RSD 100.43%, RSD 为为0.44%0.44%。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验8 8、酰胺氮测定法、酰胺氮测定法双羧基氨基酸双羧基氨基酸（谷氨酰胺、天（门）冬酰胺）的侧链（谷氨酰胺、天（门）冬酰胺）的侧链上含有酰胺基。上含

36、有酰胺基。酰胺基上的氮酰胺基上的氮比较容易释放，在较温比较容易释放，在较温和或短时间的水解条件下，即可释放完全。和或短时间的水解条件下，即可释放完全。RCONHRCONH2 2+2H+2H2 2O RCOOH+NHO RCOOH+NH4 4OHOH氨被释放氨被释放出来，经过弥散，出来，经过弥散，吸收于吸收于中央室含有指示剂中央室含有指示剂的的酸溶液酸溶液中。中。反应完全后，直接在中央室用反应完全后，直接在中央室用标定过的盐酸滴定标定过的盐酸滴定，即，即可标出可标出酰胺氮酰胺氮的含量，间接可求出氨基酸的含量。的含量，间接可求出氨基酸的含量。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验9 9、酸

37、碱滴定法、酸碱滴定法赖氨酸（赖氨酸（lysinelysine）片中赖氨酸的测定）片中赖氨酸的测定取取本本品品2020片片，精精密密称称定定，研研细细，精精密密称称取取适适量量（约约相相当当于于赖赖氨氨酸酸0.15g0.15g）置置烧烧杯杯中中，加加水水25mL25mL，滴滴加加氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L），用用酸酸度度计计调调节节至至pHpH值值为为7.07.0，加加入入预预先先调调节节至至pHpH值值9.09.0的的甲甲醛醛溶溶液液15mL15mL，搅搅匀匀，再再用用氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L）滴滴定定至至pHpH值值为

38、为9.09.0，并持续，并持续30s30s。按按加加入入甲甲醛醛液液后后所所耗耗用用氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L）体体积积计计算算，每每毫毫升升氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L）相相当当于于9.132mg9.132mg的的C C6 6H H1414N N2 2O O2 2HClHCl。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验1010、HPLCHPLC对于各种复方氨基酸制剂中氨基酸的含量测定，目前对于各种复方氨基酸制剂中氨基酸的含量测定，目前较多地采用了高效液相色谱法（较多地采用了高效液相色谱法（HPLCHPLC）。）。因大多

39、数氨基酸因大多数氨基酸没有紫外吸收没有紫外吸收，不能用紫外检测器测，不能用紫外检测器测定。为改善被测物的检测特性，提高检测灵敏度，需定。为改善被测物的检测特性，提高检测灵敏度，需进行进行化学衍生化化学衍生化。衍生方式包括衍生方式包括柱后衍生法柱后衍生法和和柱前衍生法柱前衍生法。柱后衍生法是将样品经离子交换柱分离后进行衍生柱后衍生法是将样品经离子交换柱分离后进行衍生；柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行HPLCHPLC分分离离。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验衍生衍生可可改善被测物的检测特性改善被测物的检测特性，且且可可改变分离选择特改变

40、分离选择特性，经衍生化的氨基酸可用性，经衍生化的氨基酸可用紫外紫外或或荧光检测器荧光检测器检测。检测。据文献报道，用据文献报道，用邻苯二甲醛邻苯二甲醛柱前衍生和荧光检测的反柱前衍生和荧光检测的反相高效液相色谱法测定复方氨基酸注射剂中氨基酸含相高效液相色谱法测定复方氨基酸注射剂中氨基酸含量，量，检测限检测限为为pgpg水平水平。用用异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯柱前衍生紫外检测反相柱前衍生紫外检测反相HPLCHPLC定量测定定量测定植物中氨基酸含量，检测限植物中氨基酸含量，检测限8.11-13.3pmol/L8.11-13.3pmol/L。用用亚硝酸亚硝酸衍生化，紫外检测的反相衍生化，紫外检测的反相H

41、PLCHPLC定量测定人体定量测定人体内的内的乙酰半胱氨酸乙酰半胱氨酸，检测限为，检测限为170nmol170nmol。用用N-N-芘基马来酰亚胺修饰芘基马来酰亚胺修饰N-N-乙酰半胱氨酸乙酰半胱氨酸，用荧光检，用荧光检测的反相测的反相HPLCHPLC测定，定量限为测定，定量限为32nmol32nmol。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验1111、其他仪器分析方法、其他仪器分析方法其他一些仪器分析方法也可用于氨基酸的含量测定。其他一些仪器分析方法也可用于氨基酸的含量测定。如杜鸣等在荧光计上附加如杜鸣等在荧光计上附加互相垂直的偏振片互相垂直的偏振片消除溶剂消除溶剂散射光的影响和苯丙氨

42、酸的干扰，用散射光的影响和苯丙氨酸的干扰，用偏振荧光光度法偏振荧光光度法同时测定氨基酸注射液及动植物浸出液中酪氨酸和色同时测定氨基酸注射液及动植物浸出液中酪氨酸和色氨酸的含量。氨酸的含量。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验蛋白质和多肽因子是生物体内广泛存在的生化物质，具蛋白质和多肽因子是生物体内广泛存在的生化物质，具多种生理功能，是一大类非常重要的生化药物。多种生理功能，是一大类非常重要的生化药物。蛋白质蛋白质是呈两性解离的电解质，其离子基因除末端氨基是呈两性解离的电解质，其离子基因除末端氨基和末端羧基外，还有侧链上的酸性或碱性基团，各种蛋和末端羧基外，还有

43、侧链上的酸性或碱性基团，各种蛋白质分子有各自的白质分子有各自的等电点等电点，在等电点时蛋白质的溶解度，在等电点时蛋白质的溶解度最小，稳定性差，易从溶液中沉淀析出。最小，稳定性差，易从溶液中沉淀析出。蛋白质对水亲和力很大，在可水溶液中形成亲水胶体。蛋白质对水亲和力很大，在可水溶液中形成亲水胶体。蛋白质分子构象受热、超声波、紫外光照射等物理因素蛋白质分子构象受热、超声波、紫外光照射等物理因素和酸、碱、重金属、有机溶剂等因素的影响而变化和酸、碱、重金属、有机溶剂等因素的影响而变化。蛋白质蛋白质变性变性后后失去生物活性和结晶能力失去生物活性和结晶能力，同时黏度、溶，同时黏度、溶解度、沉降系数和扩散系数

44、也会发生变化。解度、沉降系数和扩散系数也会发生变化。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验多肽因子类药物多肽因子类药物指分子量不算太大的，在体内含量极指分子量不算太大的，在体内含量极微，但却发挥极大生理作用的一类生物活性物质。微，但却发挥极大生理作用的一类生物活性物质。其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素、白细胞其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素、白细胞介素、胸腺肽、转移因子等和通过现代基因工程技术介素、胸腺肽、转移因子等和通过现代基因工程技术生产的药品如重组人干扰素、重组白细胞介素、重组生产的药品如重组人干扰素、重组白细胞介素、重组乙肝疫苗等。乙肝疫苗等

45、。天然来源天然来源的多肽因子药物（如胸腺肽、转移因子等）的多肽因子药物（如胸腺肽、转移因子等）其分析方法与蛋白质类药物的分析方法基本相同其分析方法与蛋白质类药物的分析方法基本相同。以以基因工程重组技术生产基因工程重组技术生产的多肽因子类药物分析方法的多肽因子类药物分析方法与蛋白质类药物的分析方法差异较大。与蛋白质类药物的分析方法差异较大。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验一、多肽因子类药物的定性鉴别一、多肽因子类药物的定性鉴别基因重组多肽因子类药物的基因重组多肽因子类药物的鉴别鉴别主要采用主要采用SDS-PAGESDS-PAGE法法和和免疫印迹法免疫印迹法。

46、1 1、SDS-PAGESDS-PAGE法法用用SDS-PAGESDS-PAGE鉴别生物样品必须是该品有鉴别生物样品必须是该品有极纯的标准对极纯的标准对照品照品，通过电泳结果的对比，确定所测样品是否与标，通过电泳结果的对比，确定所测样品是否与标准品有准品有相同的迁移率相同的迁移率，从而鉴别该品。，从而鉴别该品。缺点缺点：必须有标准品；：必须有标准品；凝胶中多肽凝胶中多肽需需保留生物活性，保留生物活性，或能或能够复性够复性，或电泳前可将检测配基，或电泳前可将检测配基与待与待测多肽共价测多肽共价交联交联。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验2 2、蛋白质蛋白质免疫

47、印迹免疫印迹电泳电泳法（转移电泳、法（转移电泳、western blotwestern blot）原原理理：借借助助聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶技技术术，将将生生物物活活性性物物质质高高效效分分离离，分分离离后后的的样样品品可可以以原原位位、定定量量驱驱动动或或吸吸印印在在另另一一种种固固相相载载体体（通通常常用用醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜，简简称称NCNC膜膜）上上，能能保保持持原原有有的的生生物物活活性性，可可以以进进行行各各种种生生物物检检测测、免疫识别、扫描、积分和保存。免疫识别、扫描、积分和保存。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（1 1）基本操

48、作）基本操作 分分3 3个部分个部分：聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳；转转移电泳移电泳（即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸上上）；检测或鉴定检测或鉴定薄膜上的薄膜上的多肽条带多肽条带。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 先将先将待待分离样品进行凝胶电泳分离样品进行凝胶电泳分离。分离。凝胶可用凝胶可用琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶，也可用，也可用聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶，可以，可以是是均一均一的，也可用的，也可用梯度梯度凝胶，凝胶缓冲体系中可含有凝胶，凝胶缓冲体系中可含有各种各种变性剂变性剂，如，如SDSSDS、LDSLDS、尿素等，可进行、尿素等，可

49、进行单向或双单向或双向电泳向电泳，也可用，也可用等电聚焦电泳等电聚焦电泳。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验转移电泳转移电泳 将将湿湿醋酸纤维素（醋酸纤维素（NCNC）薄膜薄膜紧贴紧贴凝胶凝胶，凝，凝胶与薄膜之间胶与薄膜之间不能有气泡不能有气泡，否则在气泡所在部位的条，否则在气泡所在部位的条带将不能转移，在带将不能转移，在NCNC膜和凝胶的另一侧放上膜和凝胶的另一侧放上两层湿滤两层湿滤纸纸，也，也不能有气泡不能有气泡，再在两边，再在两边贴上海绵贴上海绵，最后用，最后用塑料塑料网框架网框架夹紧，插入夹紧，插入电泳槽电泳槽，根据凝胶中样品，根据凝胶中样品所带电荷

50、所带电荷的性质的性质，决定有，决定有NCNC膜的一边是靠近膜的一边是靠近正极正极还是靠近还是靠近负极负极一侧。一侧。电泳条件取决于凝胶类型、转移装置和蛋白质本身性电泳条件取决于凝胶类型、转移装置和蛋白质本身性质等。一般采用质等。一般采用低电压低电压和和低电流低电流（2mA/cm2mA/cm2 2以内以内）。）。缓冲液中一般含有缓冲液中一般含有2020的甲醇或乙醇的甲醇或乙醇，其作用主要是，其作用主要是保持凝胶的几何形状。保持凝胶的几何形状。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验检测或鉴定检测或鉴定 NC NC膜膜借助借助非共价键非共价键吸附蛋白质吸附蛋白质，经转

51、移，经转移后蛋白质条带就固定在后蛋白质条带就固定在NCNC膜上，膜上，完全保留完全保留凝胶中的凝胶中的蛋蛋白谱白谱，可，可直接直接用考马斯亮蓝、氨基黑用考马斯亮蓝、氨基黑10B10B等等染色染色。如果利用蛋白质生物活性，或用蛋白质生物探针来检如果利用蛋白质生物活性，或用蛋白质生物探针来检测，就要测，就要先用先用1 13 3的牛血清蛋白的牛血清蛋白或血红蛋白，或或血红蛋白，或非离子去垢剂非离子去垢剂（0.30.3吐温吐温-20-20）等）等处理处理NCNC纸纸，以封闭以封闭NCNC纸上未吸附蛋白质区域，使其不再能吸附蛋白质。纸上未吸附蛋白质区域，使其不再能吸附蛋白质。使用非离子去垢剂比较经济，但

52、有可能把使用非离子去垢剂比较经济，但有可能把NCNC纸上的某纸上的某些蛋白质洗掉，同时还要将些蛋白质洗掉，同时还要将NCNC纸反复洗涤以去除变性纸反复洗涤以去除变性剂，剂，第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验使蛋白质使蛋白质恢复恢复到天然态或生物到天然态或生物活性活性，然后再与检测探，然后再与检测探针保温。针保温。如用如用Con ACon A（伴刀豆球蛋白（伴刀豆球蛋白A A）检测糖蛋白，用检测糖蛋白，用抗体抗体检检测其特异性的测其特异性的抗原抗原，用，用激素激素检测其检测其特异受体特异受体，用，用底物底物检测特异的检测特异的酶酶等。等。如如探针探针本身具有本

53、身具有放射性放射性（如（如125125I I标志标志Con ACon A），或），或连连有有酶酶（如酶标抗体），或（如酶标抗体），或荧光探针荧光探针，那么反应后应，那么反应后应彻底彻底洗涤洗涤，可立即进行，可立即进行放射自显影放射自显影，或与，或与底物底物来反应，或来反应，或紫外灯下观察荧光。紫外灯下观察荧光。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验二、多肽因子类药物的检查二、多肽因子类药物的检查1 1、分子量检查、分子量检查常用还原型常用还原型SDS-PAGESDS-PAGE法检查分子量，用量约法检查分子量，用量约1g1g。也可采用也可采用凝胶过滤法，例如凝胶过

54、滤法，例如SephadecxSephadecx系列（系列（G-75G-75，- -100100）；waters 1waters 16060，125125，250250；Backman TSK Backman TSK 2000SW2000SW，3000SW3000SW，4000SW4000SW。凝胶过滤凝胶过滤是测定是测定完整蛋白质分子完整蛋白质分子的分子量，而的分子量，而SDS-SDS-PAGEPAGE是测定是测定蛋白质亚基蛋白质亚基的分子量，的分子量，同时同时用这用这二种方法二种方法测定同一蛋白质的分子量，可以方便地判断样品蛋白测定同一蛋白质的分子量，可以方便地判断样品蛋白质是否是寡聚蛋白质

55、。质是否是寡聚蛋白质。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验2 2、肽图分析、肽图分析肽肽图图分分析析是是指指用用酶酶解解或或化化学学降降解解蛋蛋白白质质后后，对对生生成成的的肽段肽段进行分离、分析的技术。进行分离、分析的技术。（1 1）蛋蛋白白质质的的裂裂解解方方法法 酶酶解解法法 应应用用蛋蛋白白酶酶裂裂解解蛋蛋白白质质，利利用用各各种种蛋蛋白白酶酶对对蛋蛋白白质质分分子子肽肽键键作作用用的的特特异异性性。如如胰胰蛋蛋白白酶酶作作用用于于碱碱性性氨氨基基酸酸（精精氨氨酸酸和和赖赖氨氨酸酸）的的羧羧基基端端，酶酶解解有有时时不不完完全全，在在此此情情况况下下，

56、可可加加一一些些变变性性剂剂（4mol4mol尿尿素素）；或或用用还还原原剂剂DTTDTT还还原原，再再用用烷烷化化剂剂（碘碘代代乙乙酸酸）烷烷化化成成羧羧甲甲基基半半胱胱氨氨酸酸，它它能能很很好好地地和和方便地进行氨基酸定量分析。方便地进行氨基酸定量分析。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验化学裂解法化学裂解法 最常用的是最常用的是溴化氰裂解法溴化氰裂解法。溴化氰作用。溴化氰作用于于MetMet羧基端羧基端和其次一个氨基酸形成的肽键，如和其次一个氨基酸形成的肽键，如-干干扰素含扰素含4 4个个MetMet，经溴化氰作用后生成，经溴化氰作用后生成5 5个肽段。

57、个肽段。其他化学裂解法还有其他化学裂解法还有BNPs-3-BNPs-3-甲基吲哚甲基吲哚，N N- -氰代琥珀酸氰代琥珀酸亚胺亚胺等作用于等作用于Try-xTry-x键键；2-2-硝基硝基-5-5-硫氰基苯甲酸作用于硫氰基苯甲酸作用于x-Cysx-Cys键键；羟胺作用于羟胺作用于Asp-GluAsp-Glu键键；稀酸（吡唑醋酸）作用于稀酸（吡唑醋酸）作用于Asp-ProAsp-Pro键键。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（2 2）肽肽图图分分析析 最最早早称称为为FingerprintingFingerprinting（指指纹纹术术），用在用在镰形细胞贫血

58、症镰形细胞贫血症研究中研究中。将将HbAHbA（血血红红蛋蛋白白A A）和和HbSHbS（血血红红蛋蛋白白S S）的的分分别别用用胰胰蛋蛋白白酶酶酶酶解解，然然后后将将它它们们分分别别进进行行电电泳泳，再再转转动动9090进行纸层析进行纸层析。IngramIngram用用此此法法观观察察到到HbAHbA和和HbSHbS之之间间有有一一个个肽肽斑斑点点上上的的差差别别，进进一一步步的的肽肽顺顺序序分分析析指指出出这这仅仅是是珠珠蛋蛋白白链链第第6 6位位上上一一个个氨氨基基酸酸残残基基的的差差别别，HbAHbA中中为为GluGlu（谷谷氨氨酸酸），HbSHbS中为中为ValVal（缬氨酸缬氨酸）

59、。）。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验肽图分析最常用的方法有肽图分析最常用的方法有SDS-PAGESDS-PAGE电泳法电泳法、高效液相高效液相色谱法（色谱法（HPLCHPLC）和和毛细管电泳法毛细管电泳法（CECE）。）。HPLCHPLC主要是用主要是用反相柱反相柱，根据肽段的长短和疏水性来分，根据肽段的长短和疏水性来分离，如果亲水性太强，则难于在柱上滞留而达不到分离，如果亲水性太强，则难于在柱上滞留而达不到分离效果；如果肽的疏水性很强，又难于洗脱下来，而离效果；如果肽的疏水性很强，又难于洗脱下来，而CECE法则可避免这些缺点。法则可避免这些缺点。第二节

60、第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验3 3、等电点测定、等电点测定等电点是蛋白质的物理化学常数，它表示蛋白质的带等电点是蛋白质的物理化学常数，它表示蛋白质的带电性质。电性质。一般采用一般采用凝胶等电聚焦电泳凝胶等电聚焦电泳技术测定等电点。技术测定等电点。4 4、紫外吸收、紫外吸收不同的蛋白质分子都有其特定的紫外吸收，对于某种不同的蛋白质分子都有其特定的紫外吸收，对于某种蛋白质或多肽来说，它的蛋白质或多肽来说，它的最大吸收波长是固定最大吸收波长是固定的。的。紫外吸收光谱紫外吸收光谱是检查蛋白质的一个重要指标。是检查蛋白质的一个重要指标。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质

61、类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验5 5、纯度、纯度基基因因工工程程产产品品蛋蛋白白质质纯纯度度是是一一项项重重要要指指标标，但但它它也也是是一项相对的指标，需一项相对的指标，需根据实际要求而定根据实际要求而定。蛋蛋白白质质纯纯度度一一般般是是指指是是否否含含有有其其他他杂杂蛋蛋白白，而而不不包包括括盐、缓冲液离子、盐、缓冲液离子、SDSSDS等小分子在内。等小分子在内。目目前前较较常常用用的的是是HPLCHPLC法法（包包括括凝凝胶胶过过滤滤、各各种种反反相相HPLCHPLC、离离子子色色谱谱、疏疏水水色色谱谱等等）、非非还还原原SDS-PAGESDS-PAGE凝凝胶电泳法胶电泳法、毛细

62、管电泳法毛细管电泳法（CECE）、）、等电聚焦电泳等电聚焦电泳，此外也应用一些化学方法，观察末端是否均一。此外也应用一些化学方法，观察末端是否均一。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验至至少少应应用用两两种种以以上上的的方方法法，而而且且是是两两种种不不同同分分离离机机理理的方法来判定蛋白质的纯度才比较可靠。的方法来判定蛋白质的纯度才比较可靠。常常发发现现某某一一样样品品在在凝凝胶胶过过滤滤中中是是纯纯的的，而而在在离离子子色色谱谱中却分辨为二个组分，反之亦然。中却分辨为二个组分，反之亦然。又又如如一一种种样样品品用用凝凝胶胶过过滤滤法法和和SDS-PAGES

63、DS-PAGE电电泳泳证证明明是是纯纯的，但这仍不充分，因为这的，但这仍不充分，因为这两两者者机理相同机理相同。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验6 6、N N- -端氨基酸序列测定端氨基酸序列测定测定蛋白质或多肽的氨基酸序列测定蛋白质或多肽的氨基酸序列是鉴别蛋白质的重要是鉴别蛋白质的重要指标。指标。5050年代初，年代初，EdmanEdman采用采用异硫氰苯酯异硫氰苯酯（Phenylisothio Phenylisothio CyanateCyanate，简称，简称PITCPITC，EdmanEdman试剂）首先建立了测定蛋试剂）首先建立了测定蛋白质的氨基

64、酸序列的方法。白质的氨基酸序列的方法。19681968年年，EdmanEdman研制成功研制成功自动顺序仪自动顺序仪（SecluencerSecluencer）。）。近年来，又有高度自动化、微量化的精确灵敏的气液近年来，又有高度自动化、微量化的精确灵敏的气液顺序仪问世。顺序仪问世。在各种测定蛋白质氨基酸序列方法中，在各种测定蛋白质氨基酸序列方法中，EdmanEdman降解法降解法仍仍是最为准确、可靠的方法。是最为准确、可靠的方法。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（1 1）原理）原理 Edman Edman试剂的化学反应，试剂的化学反应，从从蛋白质的多肽链蛋

65、白质的多肽链的的N N- -端进行降解端进行降解，一次一次只去掉只去掉一个氨基酸残基一个氨基酸残基，经过，经过反复循环反应，能依次得到一系列反复循环反应，能依次得到一系列苯氨基硫甲酰氨基苯氨基硫甲酰氨基酸酸（PTH-PTH-氨基酸），分析鉴定氨基酸），分析鉴定PTH-PTH-氨基酸氨基酸就可得到从就可得到从肽肽N N- -端开始的氨基酸序列。端开始的氨基酸序列。主要反应分为三步：主要反应分为三步：偶合偶合 蛋白质多肽链蛋白质多肽链N N- -端氨基酸与端氨基酸与PITCPITC在在无氧无氧条件下，条件下，在在pH 8-9pH 8-9的缓冲液中进行的缓冲液中进行偶合偶合，生成，生成苯基硫代氨甲酰

66、苯基硫代氨甲酰基肽衍生物基肽衍生物。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验裂裂解解 苯苯基基硫硫代代氨氨甲甲酰酰基基肽肽的的衍衍生生物物与与无无水水三三氟氟醋醋酸酸反反应应，释释放放出出N N- -端端的的氨氨基基酸酸，产产生生苯苯胺胺噻噻唑唑啉啉酮酮 （anilinothiazolinoneanilinothiazolinone，ATZATZ）衍衍生生物物和和减减少少一一个个残残基的多肽链。基的多肽链。转转位位 生生成成的的ATZATZ衍衍生生物物极极不不稳稳定定，必必须须迅迅速速转转化化成成苯苯基基乙乙内内酰酰硫硫脲脲- -氨氨基基酸酸（Phenylthio

67、hydantionPhenylthiohydantion，简简称称PTHPTH）后，进行鉴定。）后，进行鉴定。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（2 2）样样品品的的处处理理 首首先先必必须须将将蛋蛋白白质质样样品品进进行行解解聚聚成成一条多肽长链分子一条多肽长链分子。如如果果测测定定的的样样品品分分子子中中含含有有二二硫硫键键，必必须须将将二二硫硫键键用用氧氧化化还还原原法法拆拆开开，得得到到含含半半胱胱氨氨酸酸的的肽肽链链还还必必须须加加以以保护保护，避免二硫键重新聚合。，避免二硫键重新聚合。含含亚亚基基的的蛋蛋白白质质分分子子，需需将将亚亚基基拆拆开开

68、、纯纯化化、分分别别测测量。量。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验蛋白质多肽链的蛋白质多肽链的N N- -端必须是游离基团端必须是游离基团。有有些些蛋蛋白白质质N N- -端端被被乙乙酰酰基基（CHCH3 3COCO）封封闭闭，如如乙乙酰酰细细胞色素胞色素C C、乙酰烟草花叶病毒等。乙酰烟草花叶病毒等。有有的的蛋蛋白白质质N N- -端端为为环环谷谷氨氨酸酸（pyroglutamic pyroglutamic acidacid），如如兔兔IgGIgG的的重重链链、许许多多活活性性多多肽肽等等，都都不不能能直直接接用用EdmanEdman法降解。法降解。第二节

69、第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验影影响响偶偶合合反反应应的的因因素素 必必须须严严格格控控制制pHpH在在8-98-9；过过碱碱会会导导致致PITCPITC与与一一级级胺胺、二二级级胺胺反反应应，从从而而影影响响PTH-PTH-氨氨基基酸鉴定；偏酸将导致偶合反应不完全。酸鉴定；偏酸将导致偶合反应不完全。严严格格控控制制在在无无氧氧条条件件下下进进行行；氧氧化化将将导导致致二二硫硫磺磺酸酸副副产物的生成，及色氨酸被氧化而使反应终止。产物的生成，及色氨酸被氧化而使反应终止。用用高高纯纯度度缓缓冲冲液液，各各种种试试剂剂也也必必须须经经过过再再纯纯化化；杂杂质质中中含

70、含醛醛会会造造成成氨氨基基被被反反应应，以以及及形形成成SehiffSehiff碱碱使使蛋蛋白白质质多多肽肽链链产产生生不不纯纯的的联联结结肽肽，而而造造成成肽肽链链氨氨基基酸酸序序列列测定中断。测定中断。控控制制反反应应时时间间及及温温度度；延延长长反反应应时时间间和和提提高高温温度度，都都将导致副反应增加而影响测定。将导致副反应增加而影响测定。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（3 3）检检测测 过过去去常常用用薄薄层层层层析析法法进进行行鉴鉴定定检检查查，但但该该法法操作非常复杂，时间长，灵敏度和精确度都很差。操作非常复杂，时间长，灵敏度和精确度都很差

71、。近近年年来来，大大部部分分实实验验均均采采用用高高效效液液相相法法鉴鉴定定PTH-PTH-氨氨基基酸，它既可定性又可定量，是目前酸，它既可定性又可定量，是目前最精确最精确的方法。的方法。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验7 7、外源、外源DNADNA含量测定含量测定基因工程产品在生产过程中，可能会因操作不当将基因工程产品在生产过程中，可能会因操作不当将DNADNA片段代入样品中，所以必须对样品进行片段代入样品中，所以必须对样品进行外源残留外源残留DNADNA含含量量测定测定。一般规定残余一般规定残余DNADNA含量含量每个剂量小于每个剂量小于100pg10

72、0pg。通常用通常用改进的改进的SouthernSouthern杂交法，又称为斑点杂交（杂交法，又称为斑点杂交（Dot Dot blotblot），即，即直接直接将被测样品将被测样品点点于于醋酸纤维素膜醋酸纤维素膜上使之上使之成为斑点，然后与探针成为斑点，然后与探针DNADNA进行杂交进行杂交，最后最后与标准与标准DNADNA同样操作的结果同样操作的结果对比对比，以确定残余外原，以确定残余外原DNADNA的含量。的含量。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验标记标记DNADNA常用常用放射性核素标记放射性核素标记，利利用用放射自显影技术放射自显影技术进进行定量测

73、定。行定量测定。近年来，近年来，试剂盒试剂盒为实验带来了更大的方便。为实验带来了更大的方便。例如，例如，BOEHTINGER MANNHEIMBOEHTINGER MANNHEIM公司出品的公司出品的地高辛标记地高辛标记的的DNADNA标记检测试剂盒标记检测试剂盒，它是通过，它是通过无放射标记无放射标记的的地高辛地高辛与与标记的标记的DNADNA结合经杂交而形成的结合经杂交而形成的有颜色或荧光有颜色或荧光的检测物的检测物质。质。地高辛与地高辛与dUTPdUTP经强碱作用形成新的复合物经强碱作用形成新的复合物DIG-11-UDPDIG-11-UDP标记物，该标记物与膜上的被检测标记物，该标记物与

74、膜上的被检测DNADNA杂交显色而被测杂交显色而被测定。定。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验残余残余DNADNA的测定方法：的测定方法：（1 1）样样品品 DNADNA标标准准品品（一一般般采采用用发发酵酵用用的的工工程程菌菌DNADNA稀稀释释）：10ng/mL10ng/mL、1ng/mL1ng/mL、100pg/mL100pg/mL、1pg/mL1pg/mL。将待测样品用将待测样品用蛋白酶蛋白酶K K，3737消化消化4h4h。（2 2）DNADNA变变性性 将将样样品品置置沸沸水水浴浴中中加加热热2min2min，然然后后迅迅速速置冰水中冷却。置冰水

75、中冷却。（3 3）点点样样 将将经经变变性性处处理理的的样样品品点点于于干干燥燥的的醋醋酸酸纤纤维维素膜素膜上（上（1L/1L/点点），紫外灯下照射），紫外灯下照射5min5min。（4 4）预预杂杂交交 将将膜膜置置于于塑塑料料袋袋内内，加加入入10mL10mL标标准准杂杂交交液液，封口，封口，6868孵育过夜。孵育过夜。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（5 5）杂杂交交 塑塑料料袋袋内内加加入入标标的的探探针针DNADNA 50L50L，6868孵孵育育6h6h。（6 6）洗膜、孵育、封闭、漂洗。）洗膜、孵育、封闭、漂洗。（7 7）在）在10mL10m

76、L检测平衡液中检测平衡液中平衡平衡膜膜5min5min。（8 8）在在10mL10mL新新鲜鲜配配制制的的显显色色液液中中，孵孵育育至至膜膜显显色色完完全全为止。为止。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验8 8、残余、残余IgGIgG含量测定含量测定有些基因工程蛋白质在工业生产中用有些基因工程蛋白质在工业生产中用单克隆抗体亲和单克隆抗体亲和层析法层析法进行纯化，而在层析过程中，可能会有少量单进行纯化，而在层析过程中，可能会有少量单克隆抗体被洗脱下来而混在纯化液中克隆抗体被洗脱下来而混在纯化液中。这些单克隆抗体为异体大分子蛋白，如果这些单克隆抗体为异体大分子蛋白

77、，如果混入混入样品样品，会给患者使用造成强烈过敏反应，因此必须进行单克会给患者使用造成强烈过敏反应，因此必须进行单克隆抗体检查（隆抗体检查（一般规定应小于一般规定应小于100ng/100ng/支支）。）。免疫球蛋白（免疫球蛋白（IgGIgG）的测定方法有多种。用于）的测定方法有多种。用于定性分定性分析析的有的有SDS-PAGESDS-PAGE、等电聚焦电泳等电聚焦电泳和和免疫学方法免疫学方法；用于；用于定量分析定量分析的有的有蛋白定量蛋白定量（抗原定量抗原定量）。）。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验测定基因工程干扰素中的残余测定基因工程干扰素中的残余IgG

78、IgG的方法：的方法：（1 1）将将羊羊抗抗鼠鼠IgGIgG用用包包被被液液稀稀释释至至10g/mL10g/mL，每每孔孔加加100L100L，3737保温保温2h2h或或44过夜。过夜。（2 2）每孔加）每孔加100L100L封闭液封闭液封闭封闭，3737保温保温30min30min。（3 3）将将标标准准IgGIgG稀稀释释成成100ng/mL100ng/mL、50ng/mL50ng/mL、25ng/mL25ng/mL、12.5ng/mL12.5ng/mL、6.25ng/mL6.25ng/mL、3.125ng/mL3.125ng/mL、1.563ng/mL1.563ng/mL的的溶液，每孔

79、加溶液，每孔加100L100L。（4 4）样品每孔）样品每孔加加100L100L，3737保温保温2h2h。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（5 5）将将HRP-HRP-羊羊抗抗鼠鼠IgGIgG以以1 1800800稀稀释释后后，每每孔孔100L100L，3737保温保温30min30min。（6 6）将将4mg4mg邻邻苯苯二二胺胺溶溶于于10mL10mL底底物物缓缓冲冲液液中中，加加3030过过氧化氢氧化氢15L15L，摇匀，每孔，摇匀，每孔100L100L，3737保温保温30min30min。（7 7）每孔加）每孔加2mol/L2mol/L硫酸溶液

80、硫酸溶液50L50L，终止终止反应。反应。（8 8）用酶标仪）用酶标仪测测ODOD492492值，计算残余值，计算残余IgGIgG含量。含量。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验三、多肽因子类药物生物效价的测定三、多肽因子类药物生物效价的测定生物制剂或生化制剂因受外界因素影响（温度、湿度、生物制剂或生化制剂因受外界因素影响（温度、湿度、时间、生产过程的各环节等）而易导致其生物活性降时间、生产过程的各环节等）而易导致其生物活性降低或全部丧失而失去药理作用，所以除要测定其含量低或全部丧失而失去药理作用，所以除要测定其含量外，还要外，还要测定其生物学活性测定其生物学

81、活性以确定其是否以确定其是否具有体内或具有体内或体外作用体外作用。1 1、免疫学测定法、免疫学测定法主要是采用主要是采用ELISAELISA定量测定样品的量定量测定样品的量。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验2、细胞病变抑制法、细胞病变抑制法该该法法主主要要用用于于干干扰扰素素的的效效价价测测定定。一一般般采采用用CPE（细细胞致病效应）抑制胞致病效应）抑制为基础的为基础的抑制微量测定法抑制微量测定法。（1）材料准备）材料准备 测定细胞测定细胞 人羊膜细胞人羊膜细胞Wish株。株。攻攻击击病病毒毒 选选用用水水泡泡性性口口腔腔炎炎病病毒毒（VSV）作作为为攻

82、攻击击病病毒毒，使使用用前前先先在在选选定定测测定定细细胞胞上上滴滴定定其其CCID50，以以感感染染24h后后引引起起测测定定细细胞胞出出现现“+”cpe的的病病毒毒稀稀释释度度为为1个个CCID50，该该病病毒毒的的滴滴度度为为稀稀释释度度的的倒倒数数乘乘10，单单位为位为CCID50/mL。完全培养液完全培养液 MEM MEM培养液添加培养液添加1010牛血清。牛血清。测定培养液测定培养液 MEMMEM培养液添加培养液添加7 7牛血清。牛血清。攻毒培养液攻毒培养液 MEMMEM培养液添加培养液添加3 3牛血清。牛血清。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验

83、（2 2）操操作作 铺铺板板 弃弃去去WishWish细细胞胞培培养养瓶瓶中中培培养养液液，用用PBSPBS洗洗2 2次次后后消消化化和和收收集集细细胞胞，用用完完全全培培养养液液配配成成约约2525万万3535万万个个细细胞胞/mL/mL的的细细胞胞悬悬液液，接接种种于于9696孔孔培培养养板上，每孔板上，每孔100L100L，3737，5 5COCO2 2，培养培养4 46h6h。制制备备标标准准溶溶液液 取取1 1支支标标准准品品用用测测定定培培养养液液稀稀释释至至1000U/mL1000U/mL。制制备备样样品品溶溶液液 将将待待测测样样品品用用测测定定培培养养液液稀稀释释至至1000

84、U/mL1000U/mL。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验另另取取9696孔孔细细胞胞培培养养板板一一块块，每每孔孔加加入入150L150L测测定定培培养养液。液。在在A6A6、A7A7各各孔孔中中每每孔孔加加入入50L50L标标准准溶溶液液，在在A2A2、A3A3、A4A4、A5A5、A6A6、A7A7、A8A8、A9A9、A10A10、A11A11各各孔孔中中每每孔孔加加入入50L50L各待检样品各待检样品，每个待检样品做，每个待检样品做2 2个复孔个复孔。自自A A行取行取5050至至H H行作行作4 4倍稀释，每孔留倍稀释，每孔留150L150L余

85、液。余液。加样加样 取取项的细胞培养板，将项的细胞培养板，将项制备的溶液移入项制备的溶液移入该细胞培养板中，该细胞培养板中，每孔每孔100L100L，3737，5 5COCO2 2，培养培养181824h24h。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验制制备备病病毒毒液液 攻攻击击剂剂量量为为100 100 TCIDTCID5050，取取保保存存的的VSVVSV用用攻毒培养液稀释至工作浓度。攻毒培养液稀释至工作浓度。功功毒毒 取取制制备备好好的的细细胞胞培培养养板板，弃弃去去上上清清，加加入入病病毒毒液液，每每孔孔100L100L，3737，5 5COCO2 2，

86、培培养养24h24h（镜镜检检标标准溶液的准溶液的5050病变点在病变点在D D或或E E行）。行）。染染色色，脱脱色色，以以630nm630nm为为参参比比波波长长，在在570nm570nm波波长长处处测测定定吸收度。吸收度。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（3 3）结结果果计计算算 采采用用计计算算机机程程序序或或直直线线回回归归计计算算法法进进行计算处理。行计算处理。分分别别计计算算各各试试验验样样品品的的半半效效稀稀释释倍倍数数（即即从从样样品品溶溶液液至至相相当当于于标标准准品品5050最最大大效效应应点点的的稀稀释释倍倍数数），并并按按下式计算

87、：下式计算：第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验3 3、3 3H-TdRH-TdR掺入同位素法掺入同位素法原原理理：通通过过比比较较待待测测样样品品与与标标准准品品之之间间对对检检测测细细胞胞促促增殖能力的强弱增殖能力的强弱来确定待测样品的活性。来确定待测样品的活性。在在测测试试液液中中加加入入由由3 3H H标标定定的的胸胸腺腺嘧嘧啶啶（3 3H-TdRH-TdR，为为细细胞胞增增殖殖过过程程中中DNADNA合合成成的的必必备备物物质质），3 3H-TdRH-TdR掺掺入入量量就代表了细胞增殖能力的强弱就代表了细胞增殖能力的强弱。3 3H-TdRH-TdR用

88、用同位素液闪计数仪同位素液闪计数仪来测定。来测定。该方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好等优点。该方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好等优点。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（1 1）CTLL-2CTLL-2细细胞胞短短期期培培养养3 3H-TdRH-TdR掺掺入入法法 取取传传代代第第2-3d2-3d、生生长长旺旺盛盛的的CTLL-2CTLL-2细细胞胞，用用RPMI RPMI 16401640培培养养液液将将细细胞胞洗洗两两次次后后，用用含含1010小小牛牛血血清清、510510-5-5mol/L mol/L 2-2-巯巯基乙醇基乙醇的的RPMI 16

89、40RPMI 1640培养液配成培养液配成1101105 5/mL/mL细胞悬液细胞悬液。用用9696孔孔细细胞胞培培养养板板，每每孔孔中中加加入入100L100L不不同同稀稀释释度度的的待待测测样样品品，同同时时设设置置培培养养液液对对照照和和各各种种浓浓度度的的标标准准品品对照，再向各孔中加入对照，再向各孔中加入100L100L的的CTLL-2CTLL-2细胞细胞。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验置置3737、5 5COCO2 2孵孵箱箱中中培培养养18h18h或或24h24h，然然后后每每孔孔中中加加入入50L50L的的18.5kBq 18.5kBq

90、 3 3H-TdRH-TdR，继续培养，继续培养4 46h6h。用用多多头头细细胞胞收收集集仪仪收收集集细细胞胞，用用液液闪闪计计数数仪仪检检测测细细胞胞的的3 3H-TdRH-TdR掺掺入入值值，通通过过比比较较待待测测样样品品与与标标准准品品使使细细胞胞掺入掺入3 3H-TdRH-TdR量的多少量的多少计算计算样品的样品的活性活性。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（2 2）鼠鼠脾脾细细胞胞增增殖殖检检测测法法 无无菌菌取取C57BL/6C57BL/6小小鼠鼠脾脾脏脏制制成成单单细细胞胞悬悬液液，以以（0.50.51.01.0）10107 7/mL/mL

91、细细胞胞浓浓度度悬悬浮浮于于含含有有5 5小小牛牛血血清清、510510-5-5mol/L mol/L 2-2-巯巯基基乙乙醇醇、2.5g/mL ConA2.5g/mL ConA的的RPMI 1640RPMI 1640培养液中培养培养液中培养484872h72h。离离 心心 （ 1500r/min1500r/min、 10min10min） ， 弃弃 去去 上上 清清 后后 加加 入入0.05mol/L 0.05mol/L -甲甲基基甘甘露露糖糖苷苷，置置4040温温育育45min45min，然然后后用用HanksHanks液液将将细细胞胞洗洗两两次次，用用含含1010小小牛牛血血清清、510

92、510-5-5mol/L mol/L 2-2-巯巯基基乙乙醇醇、0.1mol/L 0.1mol/L -甲甲基基甘甘露露糖糖苷的苷的RPMI 1640RPMI 1640培养液配制成培养液配制成2102106 6/mL/mL细胞悬液细胞悬液。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验用用9696孔孔细细胞胞培培养养板板，每每孔孔加加入入100L100L不不同同稀稀释释度度的的待待测测样样品品，同同时时设设置置培培养养液液对对照照和和各各种种浓浓度度的的标标准准品品对对照照，再向各孔中加入，再向各孔中加入100L100L的细胞悬液的细胞悬液。置置3737、5 5COCO2

93、 2孵孵箱箱中中培培养养18h18h，然然后后每每孔孔中中加加入入50L50L的的18.5kBq 18.5kBq 3 3H-TdRH-TdR，继续培养，继续培养4 46h6h。用用多多头头细细胞胞收收集集仪仪收收集集细细胞胞，用用液液闪闪计计数数仪仪检检测测细细胞胞的的3 3H-TdRH-TdR掺掺入入值值，通通过过比比较较待待测测样样品品与与标标准准品品使使细细胞胞掺入掺入3 3H-TdRH-TdR量的多少量的多少计算计算样品的样品的活性活性。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（3 3）AndoAndo氏氏微微量量测测定定法法 取取肝肝素素抗抗凝凝全全血血

94、，经经Ficoll-Ficoll-HypaqueHypaque密密度度梯梯度度离离心心，取取单单个个核核细细胞胞，用用含含1010小小牛牛血血清清的的RPMI RPMI 16401640培培养养液液配配成成5105105 5/ml/ml细细胞胞悬悬液液，置置3737、5 5COCO2 2孵孵箱箱中中培培养养1010天天后后，用用HanksHanks液液将将细细胞胞洗洗两两次次，用用含含1010小小牛牛血血清清的的RPMI RPMI 16401640培培养养液液配配成成2102105 5/mL/mL细胞悬液细胞悬液。用用9696孔孔细细胞胞培培养养板板，每每孔孔加加入入100L100L不不同同稀

95、稀释释度度的的待待测测样样品品，同同时时设设置置培培养养液液对对照照和和各各种种浓浓度度的的标标准准品品对对照照，再向各孔中加入，再向各孔中加入100L100L的的细胞悬液细胞悬液。置置3737、5 5COCO2 2孵孵箱箱中中培培养养4d4d，然然后后每每孔孔中中加加入入74kBq 74kBq 3 3H-TdRH-TdR，继继续续培培养养4h4h后后，收收集集细细胞胞，用用液液闪闪计计数仪数仪检测细胞的检测细胞的3 3H-TdRH-TdR掺入值，掺入值，计算计算样品的样品的活性活性。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验4 4、微量酶检测法（、微量酶检测法（M

96、TTMTT）法）法该法通过比较待测样品该法通过比较待测样品刺激检测细胞增殖能力刺激检测细胞增殖能力的的强弱强弱来确定样品的活性。来确定样品的活性。细胞增殖反映能量代谢活跃，可产生大量的能量，供细胞增殖反映能量代谢活跃，可产生大量的能量，供合成多种大分子物质和细胞分裂所需，合成多种大分子物质和细胞分裂所需，细胞能量代谢细胞能量代谢的水平的水平与与细胞合成细胞合成DNADNA水平基本平行水平基本平行，因此，测定细，因此，测定细胞能量代谢的水平可以间接地反映细胞的增殖情况。胞能量代谢的水平可以间接地反映细胞的增殖情况。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验四甲基偶氮唑

97、盐四甲基偶氮唑盐3-3-（4,5-dimethyhhiazol-2-y14,5-dimethyhhiazol-2-y1）- -2,5-di-phenyhetrazolium bromide2,5-di-phenyhetrazolium bromide，MTTMTT 是一种淡是一种淡黄色的可溶性化合物，活细胞特别是增殖期的细胞可黄色的可溶性化合物，活细胞特别是增殖期的细胞可通过线粒体能量代谢过程中的通过线粒体能量代谢过程中的琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶的作用的作用使使淡黄色的淡黄色的MTTMTT分解产生分解产生蓝色结晶状蓝色结晶状FormazanFormazan沉积于细沉积于细胞内或细胞周围，而且胞

98、内或细胞周围，而且FormazanFormazan的量与细胞的增殖程的量与细胞的增殖程度呈正比度呈正比，FormazanFormazan经异丙醇作用后可溶解显色经异丙醇作用后可溶解显色。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验MosmanMosman等等（19831983）根根据据上上述述原原理理首首创创了了MTTMTT比比色色分分析析法法用于用于检测能够刺激细胞增殖的生物样品的活性检测能够刺激细胞增殖的生物样品的活性。（1 1）主主要要试试剂剂 MTTMTT溶溶液液 将将MTTMTT按按5mg/mL5mg/mL浓浓度度溶溶解解于于PBSPBS中，过滤除菌后，置中

99、，过滤除菌后，置44下避光保存。下避光保存。酸化异丙醇酸化异丙醇 含含0.04mol/L0.04mol/L盐酸的异丙醇。盐酸的异丙醇。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（2 2）方方法法 用用含含1010小小牛牛血血清清的的RPMI RPMI 16401640培培养养液液将将检检测测细细胞胞（例例如如CTLL-2CTLL-2或或Con Con A A活活化化的的小小鼠鼠脾脾细细胞胞）配配成成5105105 5/mL/mL细胞悬液细胞悬液。向向9696孔孔细细胞胞培培养养板板的的每每孔孔加加入入100L100L上上述述细细胞胞悬悬液液，再再取取100L100L

100、不不同同稀稀释释度度的的待待测测样样品品和和各各种种浓浓度度的的标标准准品品对对照照品品分分别别加加入入各各孔孔中中，每每个个稀稀释释度度3 3个个复复孔孔，并并同时设置培养液对照孔。同时设置培养液对照孔。置置3737、5 5COCO2 2孵箱中孵箱中培养培养48h48h。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验离离心心（1500r/min1500r/min、5min5min），从从各各孔孔中中轻轻轻轻吸吸取取100L100L上上清清液液，弃弃去去，各各孔孔再再加加入入10L 10L MTTMTT溶溶液液，置置3737、5 5COCO2 2孵箱中孵育孵箱中孵育4

101、46h6h。各各孔孔中中加加入入100L100L酸酸化化异异丙丙醇醇，并并充充分分混混合合，静静置置数数分钟，让形成的分钟，让形成的FormazanFormazan充分溶解充分溶解。在在酶酶标标仪仪上上选选择择检检测测波波长长590nm590nm、参参考考波波长长630nm630nm测测定定ODOD值值，将将待待测测上上清清的的ODOD值值与与标标准准品品ODOD值值比比较较，即即得得待待测样品的测样品的活性活性。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（3 3）MTTMTT法的优点法的优点与与3 3H-TdRH-TdR掺入法相比，掺入法相比，MTTMTT法操作简

102、便，测定时间大法操作简便，测定时间大大缩短（特别是一次性测定大量样品时），而且避免大缩短（特别是一次性测定大量样品时），而且避免了使用放射性同位素和购置昂贵的设备，所需试剂仅了使用放射性同位素和购置昂贵的设备，所需试剂仅是是MTTMTT和酸化异丙醇和酸化异丙醇。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（4 4）应注意的问题）应注意的问题 酸化异丙醇后要在酸化异丙醇后要在1h1h内进行测内进行测定定，如，如1h1h内无法测定，可将未加酸化异丙醇的细胞培内无法测定，可将未加酸化异丙醇的细胞培养板暂放在养板暂放在44中保存，测定前将细胞培养板取出，中保存，测定前将细胞培

103、养板取出，在室温放置数分钟后再加入酸化的异丙醇进行测定。在室温放置数分钟后再加入酸化的异丙醇进行测定。在每孔中含有在每孔中含有1001005000050000个检测细胞个检测细胞时，细胞数与时，细胞数与所测的所测的ODOD值呈正相关。值呈正相关。因为因为酚红可以干扰酚红可以干扰ODOD值值的测定，所以，的测定，所以，MTTMTT法最好法最好选用无酚红的选用无酚红的RPMI 1640RPMI 1640培养液，但这种培养液目前培养液，但这种培养液目前在我国难以购买，可以设置在我国难以购买，可以设置RPMI 1640RPMI 1640培养液培养液对照孔对照孔以排除酚红以排除酚红的影响。的影响。第二节

104、第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（5 5）改改良良MTTMTT法法 为为了了能能更更加加简简便便、快快速速地地一一次次测测定定大大量量样样品品，TadaTada等等（19861986）对对MTTMTT法法在在以以下下几几方方面面进进行行了改良：了改良：将加将加MTTMTT前的培养时间前的培养时间从从48h48h缩短为缩短为24h24h；用用 1010 SDS-0.01mol/L SDS-0.01mol/L HClHCl代代 替替 酸酸 化化 异异 丙丙 醇醇 溶溶 解解FormazanFormazan结结晶晶，避避免免了了人人工工混混匀匀和和异异丙丙醇醇引引起起

105、的的小小牛牛血清沉淀现象；血清沉淀现象；省省掉掉离离心心，弃弃上上清清的的过过程程，可可在在溶溶解解FormazanFormazan结结晶晶后后5 5天天内内测测定定ODOD590590值值而而变变异异值值很很小小，而而常常规规MTTMTT法法需需在在1h1h内比色测定。内比色测定。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验5 5、红细胞生成素（、红细胞生成素（EPOEPO）体外活性测定法（）体外活性测定法（ELISAELISA测定测定法）法）3 3H-TdRH-TdR掺入法体外测定掺入法体外测定EPOEPO具有具有简便、可靠、敏感简便、可靠、敏感的的特点，特点，可

106、在可在24h24h内完成，检测灵敏度可达内完成，检测灵敏度可达0.002U/mL0.002U/mL。ELISAELISA试剂盒测定法试剂盒测定法：（1 1）检测所用试剂盒为）检测所用试剂盒为QUANTIKINE IVD EPO ELISA RQUANTIKINE IVD EPO ELISA RD Sastem Inc USAD Sastem Inc USA。（2 2）将）将样品初步稀释样品初步稀释至活性为至活性为2020200mU/mL200mU/mL（采用（采用3 3步步稀释法）。稀释后在微量震荡器上将样品混匀。稀释法）。稀释后在微量震荡器上将样品混匀。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多

107、肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（3 3）按照试剂盒说明书进行操作按照试剂盒说明书进行操作：在微孔板上每孔加在微孔板上每孔加100L EPO100L EPO稀释溶液。稀释溶液。在上述微孔中分别加入在上述微孔中分别加入100L100L不同浓度的标准品及稀不同浓度的标准品及稀释后的样品。释后的样品。用薄膜封闭微孔，将微孔板置于室温孵育用薄膜封闭微孔，将微孔板置于室温孵育2h2h。吸去微孔中的液体，每孔加吸去微孔中的液体，每孔加200L200L结合液。结合液。用薄膜封闭微孔，将微孔板置于室温孵育用薄膜封闭微孔，将微孔板置于室温孵育2h2h。吸去微孔中的液体，每孔加吸去微孔中的液体，每孔加300L30

108、0L清洗液清洗清洗液清洗4 4次。次。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验每孔加每孔加200L200L基底溶液（基底溶液（substrate Solutionsubstrate Solution）（必）（必须在配制后须在配制后15min15min内使用），注意不要加出气泡。内使用），注意不要加出气泡。将微孔板置于室温孵育将微孔板置于室温孵育25min25min。每孔加每孔加100L Substrate Stop Solution100L Substrate Stop Solution终止反应。终止反应。将微孔板置于酶标仪上，在将微孔板置于酶标仪上，在450nm

109、450nm波长处测波长处测ODOD值。值。最后，根据标准品的浓度和最后，根据标准品的浓度和ODOD值求标准曲线方程，计值求标准曲线方程，计算样品的浓度即体外活性。算样品的浓度即体外活性。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验6 6、EPOEPO体内生物学活性测定法（网织红细胞计数法）体内生物学活性测定法（网织红细胞计数法）本本法法以以给给药药小小鼠鼠后后，取取血血涂涂片片计计数数网网织织红红细细胞胞和和红红细细胞胞数数，并并计计算算两两者者的的比比值值并并经经过过统统计计学学处处理理来来计计算算样样品的体内活性。品的体内活性。（1 1）选选择择6 67 7周周，

110、体体重重181820g20g雌雌性性小小鼠鼠，随随机机分分组组，每组每组6 6只。只。（2 2）标标准准品品和和样样品品各各设设3 3个个剂剂量量组组，每每个个剂剂量量组组用用2 2只只鼠。分别做好标志。鼠。分别做好标志。（3 3）将将EPOEPO标标准准品品和和待待测测样样品品分分别别用用生生理理盐盐水水稀稀释释成成30U/mL30U/mL，稀释过程中加，稀释过程中加100L100L白蛋白做保护剂。白蛋白做保护剂。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（4 4）连连续续三三天天给给小小鼠鼠皮皮下下注注射射EPOEPO，剂剂量量分分别别为为2U/2U/只只、4U

111、/4U/只、只、8U/8U/只。只。（5 5）于于第第四四天天由由每每只只小小鼠鼠眼眼眶眶采采血血，分分别别做做涂涂料料片片。滴滴2 23 3滴滴鲜鲜血血于于涂涂有有煌煌焦焦油油兰兰（1 1乙乙醇醇染染液液）的的载载玻玻片片上，混匀，染色数分钟后推片。上，混匀，染色数分钟后推片。（6 6）血血涂涂片片进进一一步步用用瑞瑞氏氏色色素素（1 1600600甲甲醇醇染染液液）复复染染数分钟。数分钟。（7 7）用）用pH 6.8pH 6.8磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液冲洗冲洗干净，自然干净，自然晾干晾干。（8 8）在在显显微微镜镜油油镜镜下下计计数数网网织织红红细细胞胞数数和和红红细细胞胞数数，并并计算两

112、者的比值。计算两者的比值。（9 9）将将上上述述所所得得数数据据进进行行统统计计学学处处理理，计计算算EPOEPO体体内内活活性。性。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验四、蛋白质类药物的鉴别和检查四、蛋白质类药物的鉴别和检查1 1、蛋白质类药物的鉴别、蛋白质类药物的鉴别蛋蛋白白质质类类药药物物可可根根据据其其各各自自的的物物理理、化化学学性性质质、生生理理作用等采用不同的方法进行鉴别。作用等采用不同的方法进行鉴别。（1 1）茚茚三三酮酮反反应应 组组成成蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸都都能能与与茚茚三三酮酮反反应应生生成成紫紫色色化化合合物物，因因此此蛋蛋白白

113、质质也也有有此此反反应应，这这是是蛋蛋白质鉴别的最常用方法。白质鉴别的最常用方法。（2 2）福福林林酚酚反反应应或或双双缩缩脲脲反反应应 这这两两种种常常用用来来测测定定蛋蛋白质的含量，但有时也用于蛋白质的鉴别。白质的含量，但有时也用于蛋白质的鉴别。（3 3）紫紫外外吸吸收收 由由于于组组成成蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸中中，酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸、苯苯丙丙氨氨酸酸在在紫紫外外区区的的光光吸吸收收特特性性，因因此此可可利利用此种特性鉴别蛋白质。用此种特性鉴别蛋白质。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验五、蛋白质含量测定和效价测定五、蛋白质含量测定和效价测定

114、1 1、蛋白质含量测定、蛋白质含量测定蛋蛋白白质质的的定定量量可可用用化化学学方方法法如如凯凯氏氏定定氮氮法法、双双缩缩脲脲法法、福福林林酚酚法法、紫紫外外光光吸吸收收法法来来测测定定；也也可可用用染染色色法法，如如氨氨基基黑黑、考考马马斯斯亮亮蓝蓝测测定定；此此外外还还可可用用荧荧光光激激发发、氯氯胺胺T T、放射性核素计数放射性核素计数等灵敏度较高方法。等灵敏度较高方法。上上述述方方法法中中凯凯氏氏定定氮氮法法、福福林林酚酚法法、紫紫外外光光吸吸收收法法最最为常用，它们操作简单、设备便宜。为常用，它们操作简单、设备便宜。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验

115、（1 1）凯凯氏氏定定氮氮法法 凯凯氏氏定定氮氮法法常常用用来来测测定定有有机机物物的的含含氮氮量。量。原原理理：A A、含含氮氮有有机机物物的的消消化化 当当含含氮氮有有机机物物与与硫硫酸酸共共热热时，分解出氮、二氧化碳、水。时，分解出氮、二氧化碳、水。氮转变出的氨与硫酸化合生成氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵硫酸铵。分分解解反反应应进进行行得得很很慢慢，可可加加入入硫硫酸酸铜铜及及硫硫酸酸钾钾或或硫硫酸酸钠钠促促进进反反应应，其其中中硫硫酸酸铜铜为为催催化化剂剂，硫硫酸酸钾钾或或硫硫酸酸钠钠可提高沸点。可提高沸点。过氧化氢过氧化氢也能加速反应。也能加速反应。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质

116、类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验B B、铵铵离离子子的的生生成成 消消化化完完了了以以后后，在在凯凯氏氏定定氮氮瓶瓶中中加加入入强强碱碱（氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液）消消化化液液，使使硫硫酸酸铵铵分分解解，放放出出氨。氨。用用水水蒸蒸汽汽蒸蒸馏馏法法，将将氨氨蒸蒸入入过过量量的的硼硼酸酸溶溶液液中中，氨氨与与溶溶液液中中的的氢氢离离子子结结合合，生生成成铵铵离离子子，使使溶溶液液中中氢氢离离子子浓度降低。浓度降低。C C、测测定定 用用强强酸酸滴滴定定，直直至至恢恢复复溶溶液液中中原原来来的的氢氢离离子子浓浓度为止。度为止。所用强酸的摩尔数即相当于被测样品中氨的摩尔数所用强酸的摩尔数即相当

117、于被测样品中氨的摩尔数。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验操操作作方方法法 常常用用的的凯凯氏氏定定氮氮法法分分为为常常量量法法和和半半微微量量法法两两种。种。A A、常常量量法法 取取被被测测样样品品适适量量（含含氮氮量量约约252530mg30mg），精精密密称称定定，样样品品如如为为固固体体或或半半固固体体，可可用用滤滤纸纸称称取取，并并连连同同滤滤纸纸置置于于燥燥的的500mL500mL凯氏烧瓶中；凯氏烧瓶中；第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验依

118、依次次加加入入硫硫酸酸钾钾（或或无无水水硫硫酸酸钠钠）10g10g和和硫硫酸酸铜铜粉粉末末0.5g0.5g，再再沿瓶壁缓缓加沿瓶壁缓缓加硫酸硫酸20mL20mL；在在凯凯氏氏烧烧瓶瓶口口放放一一小小漏漏斗斗并并使使烧烧瓶瓶成成4545斜斜置置，用用直直火火缓缓缓缓加加热热，使使溶溶液液的的温温度度保保持持在在沸沸点点以以下下，等等泡泡沸沸停停止止，强强热热至至沸沸腾腾，待待溶溶液液成成澄澄明明的的绿绿色色后后，继续继续加热加热30min30min，放冷。，放冷。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验沿沿瓶瓶壁壁缓缓缓缓加加水水250mL250mL，振振摇摇混混合

119、合，放放冷冷后后加加4040氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液75mL75mL，注注意意使使沿沿瓶瓶壁壁流流至至底底部部，自自成成一一液液层层，加加锌锌粒粒数数粒粒，用用氮氮气气球球将将凯凯氏氏烧烧瓶瓶与与冷冷凝管连接；凝管连接；另另取取2 2硼硼酸酸溶溶液液50mL50mL，置置500mL500mL锥锥形形瓶瓶中中，加加甲甲基基红红- -溴溴甲酚绿甲酚绿混合指示液混合指示液1010滴；滴；第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验将将冷冷凝凝管管下下端端插插入入硼硼酸酸溶溶液液中中，轻轻轻轻摆摆动动凯凯氏氏烧烧瓶瓶使使溶溶液液混混合合均均匀匀，加加热热蒸蒸馏馏，至至接接收收

120、液液总总体体积积为为250mL250mL时时，将将冷冷凝凝管管尖尖端端提提出出液液面面，使使蒸蒸汽汽冲冲洗洗1min1min，用用水水淋淋洗洗尖尖端端后后停止蒸馏；停止蒸馏；馏馏出出液液用用盐盐酸酸滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L）滴滴定定至至溶溶液液由由蓝蓝绿绿色色变变为为灰灰紫紫色色，并将滴定结果用空白试验校正。并将滴定结果用空白试验校正。每每1mL1mL盐盐酸酸滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L）相相当于当于1.401mg1.401mg的的N N。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验B B、半半微微量量法法 图图中中A A为为1

121、000mL1000mL圆圆底底烧烧瓶瓶，B B为为安安全全瓶瓶，C C为为连连有有氮氮气气球球的的蒸蒸馏馏器器，D D为为漏漏斗斗，E E为为直直形形冷冷凝凝管管，F F为为100mL100mL锥锥形形瓶瓶，G G、H H为为橡皮夹。橡皮夹。 连连接接装装置置，A A瓶瓶中中加加水水适适量量与与甲甲基基红红指指示示液液数数滴滴，加加稀稀硫硫酸酸使使成成酸酸性性，加加玻玻璃璃珠珠或或沸沸石数粒石数粒。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验从从D D漏漏斗斗加加水水约约50mL50mL，关关闭闭G G夹夹，开开放放冷冷凝凝水水，煮煮沸沸A A瓶瓶中中的的水水，当当蒸

122、蒸汽汽从从冷冷凝凝管管尖尖端端冷冷凝凝而而出出时时，移移去去火火源源，关关H H夹夹，使使C C瓶瓶中中的的水水反反抽抽到到B B瓶瓶中中，开开G G夹夹，放放出出B B瓶瓶中中的的水水，关关B B瓶瓶及及G G夹夹，将将冷冷凝凝管管尖尖端端插插入入50mL50mL水水中中，使使水水自自冷冷凝凝管管尖尖端端反反抽抽至至C C瓶瓶，再抽至再抽至B B瓶，如上法放出。瓶，如上法放出。如此将如此将仪器洗涤仪器洗涤2 23 3次次。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验取取被被测测样样品品适适量量（含含氮氮量量约约1 12mg2mg），精精密密称称定定，置置干干燥燥的的

123、303050mL50mL凯凯氏氏烧烧瓶瓶中中，加加硫硫酸酸钾钾（或或无无水水硫硫酸酸钠钠）0.3g0.3g与与3030硫硫酸酸铜铜溶溶液液5 5滴滴，再沿瓶壁滴加再沿瓶壁滴加硫酸硫酸2.0mL2.0mL；在在凯凯氏氏烧烧瓶瓶口口放放一一漏漏斗斗，并并使使烧烧瓶瓶成成4545斜斜置置，用用小小火火缓缓缓缓加加热热使使溶溶液液保保持持在在沸沸点点以以下下，等等泡泡沸沸停停止止，逐逐步步加加大大火火力力，沸沸腾腾至至溶溶液液成成澄澄明明的的绿绿色色后后，继继续续加加热热10min10min，放冷，加水放冷，加水2mL2mL。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验取取

124、2 2 硼硼 酸酸 溶溶 液液 10mL10mL， 置置100mL100mL锥锥形形瓶瓶中中，加加甲甲基基红红- -溴溴甲甲酚酚绿绿混混合合指指示示液液5 5滴滴，将将冷凝管尖端插入液面下冷凝管尖端插入液面下；将将凯凯氏氏烧烧瓶瓶中中内内容容物物经经由由D D漏漏斗斗转转入入C C蒸蒸馏馏瓶瓶中中，用用水水少少量量淋洗凯氏烧瓶及漏斗数次淋洗凯氏烧瓶及漏斗数次；加加入入4040氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液10mL10mL，用少量水再洗漏斗数次，用少量水再洗漏斗数次；第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验关关G G夹夹，加加热热A A瓶瓶进进行行蒸蒸汽汽蒸蒸馏馏，至至硼

125、硼酸酸液液开开始始由由酒酒红红色色变变为为蓝蓝绿绿色色时时起起，继继续续蒸蒸馏馏约约10min10min，将将冷冷凝凝管管尖尖端端提提出出液液面面，使使蒸蒸汽汽继继续续冲冲洗洗约约1min1min，用用水水淋淋洗洗尖尖端端后后停停止止蒸馏。蒸馏。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验馏馏 出出 液液 用用 盐盐 酸酸 滴滴 定定 液液（0.01mol/L0.01mol/L）滴滴定定至至溶溶液液由由蓝蓝绿绿色色变变为为灰灰紫紫色色，并并将将滴滴定定结结果果用用空空白白试试验验校校正正（空空白白和和供供试试品品所所得得馏馏出出液液的的容容积积应应基基本本相相同同，约

126、约707075mL75mL）。）。每每1mL1mL盐盐酸酸滴滴定定液液（0.01 0.01 mo1/Lmo1/L）相相当当于于0.1401mg0.1401mg的的N N。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（2 2）双缩脲法双缩脲法 双缩脲法分为常量法和微量法。双缩脲法分为常量法和微量法。常常量量双双缩缩脲脲法法 蛋蛋白白质质含含有有多多个个肽肽键键，因因此此有有双双缩缩脲脲反反应应，在在碱碱性性溶溶液液中中蛋蛋白白质质与与铜铜离离子子形形成成紫紫红红色色化化合合物物，可可在在540nm540nm比比色色测测定定，其其颜颜色色深深浅浅与与蛋蛋白白质质浓浓度度成

127、成正正比比，而而与与蛋蛋白白质质的的分分子子量量及及氨氨基基酸酸组组成成无无关关，该该法法测定范围为测定范围为1 110mg10mg蛋白质蛋白质/mL/mL。双双缩缩脲脲法法常常用用于于需需要要快快速速的的测测定定，硫硫酸酸铵铵不不干干扰扰此此显显色色反反应应，使使其其有有利利于于对对蛋蛋白白质质纯纯化化早早期期步步骤骤的的测测定定。干干扰扰此此测测定定的的物物质质有有TrisTris及及含含氨氨基基酸酸、多多肽肽的的缓缓冲冲液液，以及以及蔗糖、甘油蔗糖、甘油等。等。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验A A、溶溶液液的的配配制制 蛋蛋白白质质标标准准溶溶液液

128、：准准确确量量取取经经真真空空干干燥燥的的标标准准蛋蛋白白质质（牛牛血血清清白白蛋蛋白白），用用水水配配制制成成10mg/mL10mg/mL的的溶溶液液，如如果果蛋蛋白白质质不不易易溶溶解解，可可用用0.05mol/L0.05mol/L氢氢氧氧化化钠溶液配制，也可稍微加热或放置过夜以助溶。钠溶液配制，也可稍微加热或放置过夜以助溶。双双缩缩脲脲试试剂剂 称称取取1.5g1.5g硫硫酸酸铜铜（CuSOCuSO4 45H5H2 2O O），6g6g酒酒石石酸酸钾钾钠钠（NaKCNaKC4 4H H4 4O O6 6HH2 2O O），依依次次溶溶于于500mL500mL水水中中，在在搅搅拌拌下下加加

129、入入300mL 300mL 1010氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液，用用水水稀稀释释1000mL1000mL。通通常常可可以以加加入入1g1g碘碘化化钾钾以以防防止止铜铜离离子子自自动动还还原原形形成成一一价氧化铜沉淀。价氧化铜沉淀。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验所所用用的的蒸蒸馏馏水水应应在在临临用用前前煮煮沸沸以以除除去去所所溶溶解解的的二二氧氧化化碳碳，待冷却后配制。，待冷却后配制。配配好好的的双双缩缩脲脲试试剂剂应应贮贮存存于于塑塑料料瓶瓶中中（或或内内壁壁涂涂以以石石蜡的玻璃瓶中）。蜡的玻璃瓶中）。此此试试剂剂可可长长期期保保存存，若若瓶瓶中中有有黑

130、黑色色沉沉淀淀出出现现，则则应应重重配。配。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验B B、标标准准曲曲线线 取取6 6支支试试管管，分分别别加加入入标标准准蛋蛋白白质质溶溶液液0 0、0.060.06、0.120.12、0.240.24、0.360.36、0.480.48、0.60mL0.60mL，用用水水补补足足至至0.60mL0.60mL，然然一一每每管管各各加加双双缩缩脲脲试试剂剂2.4mL2.4mL，混混匀匀后后在在室室温温（20202525）保保温温15min15min，然然后后在在540nm540nm波波长长处处进进行比色测定。行比色测定。以以溶溶液

131、液中中蛋蛋白白质质浓浓度度为为横横坐坐标标，以以A A540540为为纵纵坐坐标标作作标标准准曲线。曲线。5mg5mg牛血清白蛋白牛血清白蛋白/mL/mL溶液溶液A A540540约为约为0.270.27。该该方方法法标标准准曲曲线线的的线线性性及及重重复复性性较较好好，一一般般要要求求每每次次测测定定样样品品都都要要作作一一次次标标准准曲曲线线以以保保持持标标准准品品和和样样品品测测定系统的一致性，消除操作误差。定系统的一致性，消除操作误差。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验C C、样样品品测测定定 取取样样品品0.6mL0.6mL，同同上上法法操操作作于

132、于540nm540nm波波长长处处测测定定吸吸收收度度，然然后后在在标标准准曲曲线线上上查查得得样样品品的的浓浓度度，即即得。得。注意样品浓度注意样品浓度若超过若超过10mg/mL10mg/mL应做适当稀释应做适当稀释。若若样样品品中中脂脂类类含含量量过过高高，则则在在30min30min后后会会有有雾雾状状沉沉淀淀产产生，故测定须控制在生，故测定须控制在30min30min内完成内完成。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验微微量量双双缩缩脲脲法法 有有些些样样品品中中蛋蛋白白质质含含量量很很少少，在在常常量量双缩脲法测定范围之外，双缩脲法测定范围之外，可可选

133、用微量法进行测定。选用微量法进行测定。该该法法显显色色原原理理与与双双缩缩脲脲法法相相同同，由由于于铜铜与与蛋蛋白白质质复复合合物物的的最最大大吸吸收收峰峰260260280nm280nm，但但在在此此区区域域干干扰扰因因素素及及空空白白吸吸收收都都很很大大，而而选选在在310310330nm330nm测测定定干干扰扰因因素素少少一一些些，但但仍仍比比540nm540nm测测定定灵灵敏敏1010倍倍以以上上，因因此此可可选选用用310nm310nm进进行行比比色色测测定定，测测定定范范围围为为0.10.11.0mg/mL1.0mg/mL；或或用用330nm330nm测定，测定范围为测定，测定范

134、围为0.20.22.0mg/mL2.0mg/mL。干干扰扰此此测测定定的的物物质质包包括括组组氨氨酸酸、丝丝氨氨酸酸、苏苏氨氨酸酸、TrisTris、乙醇胺、硫酸铵、尿素、去垢剂等。、乙醇胺、硫酸铵、尿素、去垢剂等。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验A A、溶溶液液的的配配制制 标标准准蛋蛋白白质质溶溶液液 1.01.0或或2.0mg/mL2.0mg/mL牛牛血清白蛋白溶液。血清白蛋白溶液。微微 量量 双双 缩缩 脲脲 试试 剂剂 称称 取取 173g173g枸枸 橼橼 酸酸 三三 钠钠（NaNa3 3C C6 6H H5 5O O7 72H2H2 2O O

135、）、100g100g无无水水碳碳酸酸钠钠一一起起溶溶于于温温水水中中，称称取取17.3g17.3g硫硫酸酸铜铜（CuSOCuSO4 45H5H2 2O O）溶溶于于100mL100mL水中，两者合并用水稀释至水中，两者合并用水稀释至1000mL1000mL。该试剂可长期保存，若出现黑色沉淀需重配。该试剂可长期保存，若出现黑色沉淀需重配。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验B B、标标准准曲曲线线及及样样品品测测定定 取取7 7支支试试管管分分别别加加入入标标准准蛋蛋白白溶溶液液0 0、0.150.15、0.30.3、0.60.6、0.90.9、1.21.2、1

136、.5mL1.5mL，用用水水补补足足至至1.5mL1.5mL，加加6 6氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液1.5mL1.5mL混混匀匀，再再加加0.15mL0.15mL微微量量双双缩缩脲脲试试剂剂，混混匀匀后后在在室室温温（20202525）保保温温15min15min，然然后后在在310nm310nm或或330nm330nm波波长长处处进进行行比色测定，作标准曲线。比色测定，作标准曲线。1.0mg/mL1.0mg/mL的的牛牛血血清清白白蛋蛋白白溶溶液液的的A A310310约约为为1.041.04，A A330330约为约为0.670.67。C C、样样品品测测定定 取取1.5mL1.5mL样样品品

137、同同上上操操作作，从从标标准准曲曲线线上上查得其浓度。查得其浓度。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（3 3）福福林林酚酚试试剂剂法法 蛋蛋白白质质与与福福林林酚酚试试剂剂反反应应后后形形成成的的化化合合物物可可在在750nm750nm波波长长处处测测定定吸吸收收度度，计计算算蛋蛋白白质质的的含含量量, ,测测定定范范围围为为0.030.030.3mg/mL0.3mg/mL；或或500nm500nm波长处测定，范围为波长处测定，范围为0.050.050.5mg/mL0.5mg/mL。该该法法标标准准曲曲线线线线性性较较差差，样样品品浓浓度度需需按按标标准准曲

138、曲线线校校正。正。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验福福林林酚酚试试剂剂的的已已知知干干扰扰因因素素包包括括TrisTris、HEPESHEPES、MOPSMOPS、MESMES、CAPSTESCAPSTES、CHESCHES、枸枸橼橼酸酸、琥琥珀珀酸酸、谷谷氨氨酸酸、组组氨氨酸酸、甘甘氨氨酸酸、N N- -二二（羟羟乙乙基基）甘甘氨氨酸酸、甘甘氨氨酰酰甘甘氨氨酸酸等等缓缓冲冲液液；EDTAEDTA、EGTAEGTA等等鳌鳌合合剂剂；蔗蔗糖糖、甘甘油油、氨氨基基葡葡萄萄糖糖、果果糖糖、甘甘露露糖糖、鼠鼠李李糖糖、木木糖糖类类山山梨梨醇醇等等糖糖类类；酚酚、二

139、二巯巯基基苏苏糖糖醇醇、巯巯基基乙乙醇醇、谷谷胱胱甘甘肽肽、半半胱胱氨氨酸酸等等还还原原剂剂；汞汞、锰锰、钴钴等等二二价价金金属属离离子子；TritonTriton、TweenTween、LubrolLubrol等等去去垢垢剂剂以以及及乙乙烯烯、乙乙二二醇醇、聚聚乙乙烯烯、吡吡咯咯烷烷酮酮、载载体体两两性性电电解解质质等等。高高浓浓度度的的尿尿素素、盐盐酸酸胍胍、硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠、钾钾盐盐、三三氯氯醋醋酸酸、乙乙醇醇、乙乙醚醚、丙丙酮酮、脂脂类类等等化化合合物物也也对对测定有影响。测定有影响。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验A A、溶溶液液的的配

140、配制制 标标准准蛋蛋白白质质溶溶液液 0.30.3或或0.5mg/mL0.5mg/mL牛牛血清白蛋白溶液。血清白蛋白溶液。福林试剂福林试剂 试剂甲由下述三种溶液配制：试剂甲由下述三种溶液配制：称取称取20g20g无水碳酸钠无水碳酸钠、4g4g氢氧化钠氢氧化钠溶解于溶解于1000mL1000mL水中；水中；称取称取0.2g0.2g硫酸铜硫酸铜溶于溶于20mL20mL水中；水中；称取称取0.4g0.4g酒石酸钾钠酒石酸钾钠溶于溶于20mL20mL水中。水中。测定前将三种溶液按测定前将三种溶液按1001001 11 1混合均匀，即得。混合均匀，即得。混合混合30min30min后使用后使用，混合液只

141、能当天配制。，混合液只能当天配制。三种溶液分开可长期保存。三种溶液分开可长期保存。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验试剂乙（福林试剂）：试剂商店有售。试剂乙（福林试剂）：试剂商店有售。配配制制：在在2L2L的的磨磨口口回回流流装装置置内内加加入入100g100g钨钨酸酸钠钠，25g25g钼酸钠钼酸钠，700mL700mL蒸馏水蒸馏水。50mL 50mL 8585磷磷酸酸及及100mL100mL浓浓盐盐酸酸充充分分混混匀匀后后，以以小小火火回回流流10h10h，再再加加入入150g150g硫硫酸酸锂锂，50mL50mL蒸蒸馏馏水水及及数数滴滴液液体体溴溴，然然

142、后后开开口口继继续续沸沸腾腾15min15min，以以驱驱逐逐过过量量的的溴溴，冷却后定容到冷却后定容到1000mL1000mL，过滤，溶液呈黄绿色。，过滤，溶液呈黄绿色。以以酚酚酞酞为为指指示示剂剂，用用标标准准氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液滴滴定定，使使酸酸度为度为1mol/L1mol/L即得。即得。置于置于棕色瓶棕色瓶中中冰箱冰箱保存。保存。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验B B、标标准准曲曲线线 在在试试管管中中分分别别加加入入标标准准蛋蛋白白质质溶溶液液0 0、0.0250.025、0.050.05、0.0750.075、0.100.10、0.150.

143、15、0.200.20、0.250.25、0.300.30、0.350.35、0.400.40、0.450.45、0.50mL0.50mL，用用水水补补足足到到0.50mL0.50mL，加加试试剂剂甲甲2.5mL2.5mL混混匀匀后后在在室室温温（20202525）放放置置10min10min，再再加加入入0.25mL0.25mL试试剂剂乙乙，立立即即混混匀匀，室室温温放放置置30min30min，然然后后在在500nm500nm或或750nm750nm波波长长处测定吸收度。处测定吸收度。以以标标准准蛋蛋白白质质浓浓度度为为横横坐坐标标，吸吸收收度度为为纵纵坐坐标标作作标准曲线。标准曲线。第二

144、节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验C C、样样品品测测定定 把把稀稀释释至至适适宜宜浓浓度度的的样样品品按按上上述述操操作作进进行测定，测定吸收度通过标准曲线查得样品浓度。行测定，测定吸收度通过标准曲线查得样品浓度。该该法法显显色色时时间间受受温温度度影影响响较较大大，要要注注意意控控制制在在同同一一条件下进行。条件下进行。0.2mg/mL0.2mg/mL牛牛血血清清白白蛋蛋白白溶溶液液的的A A550550约约为为0.330.33，A A750750约约为为0.560.56。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（4 4）紫紫外

145、外吸吸收收法法 280nm280nm光光吸吸收收法法 由由于于蛋蛋白白质质中中酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸残残基基的的苯苯环环含含有有共共轭轭双双键键，因因此此蛋蛋白白质质在在275275280nm280nm波波长长处处有有一一个个紫紫外外吸吸收收高高峰峰，在在一一定定范范围围内内，蛋蛋白白质质溶溶液液在在280nm280nm波波长长处处的的光光吸吸收收度度值（值（A A280280）与其浓度成正比，因此可作定量测定）与其浓度成正比，因此可作定量测定。该法测定范围为该法测定范围为0.010.010.1mg/mL0.1mg/mL。该该法法简简单单、灵灵敏敏、快快速速、不不消消耗耗样样品品，低低浓

146、浓度度的的盐盐类类不不干干扰扰测测定定，因因此此在在蛋蛋白白质质和和酶酶的的生生化化制制备备中中广广泛应用。泛应用。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验由由于于不不同同蛋蛋白白质质中中酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸的的含含量量不不同同、所所处处的的微微环环境境也也不不同同，因因此此不不同同蛋蛋白白质质溶溶液液在在280nm280nm的的光吸收值也不同。光吸收值也不同。据据实实验验数数据据统统计计，浓浓度度为为1mg/mL1mg/mL的的溶溶液液的的18001800种种蛋蛋白白质质在在280nm280nm的的光光吸吸收收值值在在0.30.33.03.0之之间间，平

147、平均均值值为为1.250.511.250.51。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验测测定定方方法法：取取3mL3mL蛋蛋白白质质溶溶液液，以以缓缓冲冲液液作作空空白白对对照照，用用光光径径为为1cm1cm的的石石英英比比色色杯杯，在在280nm280nm波波长长处处测测定定吸吸收度值。收度值。通通常常以以浓浓度度为为1mg/mL1mg/mL的的蛋蛋白白质质溶溶液液的的A A280280为为1.01.0作作为为估算。估算。若若已已知知该该蛋蛋白白质质的的文文献献值值，可可直直接接计计算算出出样样品品溶溶液液中蛋白质的浓度。中蛋白质的浓度。该该方方法法适适用用于

148、于一一般般的的半半定定量量测测定定，也也可可用用于于纯纯蛋蛋白白质的定量测定。质的定量测定。由由于于蛋蛋白白质质的的紫紫外外吸吸收收高高峰峰常常因因pHpH的的改改变变而而有有变变化化，故用紫外吸收法时要注意溶液的故用紫外吸收法时要注意溶液的pHpH值。值。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验280nm280nm和和260nm260nm光光吸吸收收差差法法 若若样样品品中中含含有有嘌嘌呤呤、嘧嘧啶啶等等核核酸酸类类吸吸收收紫紫外外光光的的物物质质，在在用用来来测测定定蛋蛋白白质质浓度时，会有较大的干扰。浓度时，会有较大的干扰。由由于于核核酸酸在在260nm26

149、0nm波波长长处处的的光光吸吸收收比比280nm280nm波波长长处处更更强强，因因此此可可利利用用280nm280nm和和260nm260nm的的吸吸收收差差来来计计算算蛋蛋白白质浓度。质浓度。常用下列经验公式估算：常用下列经验公式估算：蛋蛋白白质质浓浓度度（mg/mLmg/mL）=1.45=1.45A A2802800.740.74A A260260（假假设设1mg/mL1mg/mL蛋白质溶液的蛋白质溶液的A A280280为为1.01.0）第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验215nm215nm和和225nm225nm吸吸收收差差法法 蛋蛋白白质质的的肽

150、肽键键在在200200250nm250nm波波长长处处有有强强紫紫外外光光吸吸收收，其其光光吸吸收收强强弱弱在在一一定定范围内与浓度成正比，且范围内与浓度成正比，且波长越短光吸收越强波长越短光吸收越强。若若选选取取215nm215nm波波长长可可减减少少干干扰扰及及光光散散射射；用用215nm215nm和和225nm225nm的的吸吸收收差差值值与与单单一一波波长长测测定定相相比比可可减减少少非非蛋蛋白白质成分引起的误差。质成分引起的误差。对对稀稀溶溶液液中中蛋蛋白白质质浓浓度度测测定定可可选选用用215nm215nm和和225nm225nm的的吸收差法，常用经验公式：吸收差法，常用经验公式：

151、蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/mLmg/mL）=0.144=0.144（A A215215A A225225）第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验该方法测定范围为该方法测定范围为2020100g/mL100g/mL蛋白质。蛋白质。该方法测定该方法测定灵敏度高灵敏度高且不同蛋白质之间差异较小。且不同蛋白质之间差异较小。氯氯气气钠钠、硫硫酸酸铵铵以以及及0.1mol/L0.1mol/L磷磷酸酸、硼硼酸酸和和TrisTris等等缓冲液都无显著干扰。缓冲液都无显著干扰。但但是是，0.1mol/L0.1mol/L的的氢氢氧氧化化钠钠、乙乙酸酸、枸枸橼橼酸酸、琥琥珀珀酸酸

152、、邻邻苯苯二二甲甲酸酸、巴巴比比妥妥等等缓缓冲冲液液在在215nm215nm波波长长处处的的光吸收较大，必须降至光吸收较大，必须降至5mol/L5mol/L以下才无明显干扰。以下才无明显干扰。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（5 5）考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250G-250染染色色法法 考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250G-250在在酸酸性性溶溶液液中中为为棕棕红红色色，当当它它与与蛋蛋白白质质通通过过疏疏水水作作用用结结合后变为合后变为蓝色蓝色，可在，可在595nm595nm波长处进行比色测定波长处进行比色测定。该该法法反反应应快快、操操作作简简便便、消消耗

153、耗样样品品少少，但但不不同同蛋蛋白白质之间差异较大，且质之间差异较大，且标准曲线线性较差标准曲线线性较差。测定范围为测定范围为0.010.011.0mg/mL1.0mg/mL蛋白质蛋白质。高高浓浓度度的的TrisTris、EDTAEDTA、尿尿素素、甘甘油油、蔗蔗糖糖、丙丙酮酮、硫硫酸酸铵铵、去去垢垢剂剂对对测测定定有有干干扰扰，缓缓冲冲液液浓浓度度过过高高或或改变测定液的改变测定液的pHpH也会影响显色。也会影响显色。考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250G-250染染色色能能力力很很强强，比比色色杯杯洗洗不不干干净净会会影响光吸收度值影响光吸收度值；注意注意不可使用石英比色环不可使用石英比色环。第

154、二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验A A、溶溶液液的的配配制制 标标准准蛋蛋白白质质溶溶液液 0.10.1或或1.0mg/mL1.0mg/mL牛牛血清白蛋白。血清白蛋白。染染色色液液 称称取取100mg100mg考考马马斯斯亮亮蓝蓝G-250G-250溶溶解解于于50mL 50mL 9595乙乙醇醇中中，加加100mL 100mL 8585的的磷磷酸酸，加加水水稀稀释释到到1000mL1000mL。该该染染色色液液可可保保存存数数月月。若若不不加加水水可可长长期期保保存存，临临用用前前再稀释。再稀释。B B、标标准准曲曲线线 在在试试管管中中分分别别加加标标准

155、准蛋蛋白白质质溶溶液液0 0、6 6、1212、2424、3636、4848、60L60L，用用水水补补足足至至60L60L，加加3mL3mL染染色色液液，混混匀匀后后在在室室温温（20202525）保保温温15min15min，在在595nm595nm波波长长处处进进行行比比色色测测定定，以以标标准准蛋蛋白白质质浓浓度度为为横横坐坐标，以吸收度值为纵坐标作标准曲线。标，以吸收度值为纵坐标作标准曲线。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验C C、样样品品测测定定 取取60L60L样样品品溶溶液液同同上上测测定定，然然后后从从标标准准曲线上查得其浓度。曲线上查得其

156、浓度。当当样样品品中中蛋蛋白白质质浓浓度度较较稀稀时时（0.010.010.1mg/mL0.1mg/mL），可可在在3ml3ml染染色色液液中中加加0.3mL0.3mL样样品品溶溶液液，同同时时作作标标准准曲曲线线，测测595nm595nm波长处的光吸收度值。波长处的光吸收度值。0.05mg/mL0.05mg/mL牛血清白蛋白溶液的牛血清白蛋白溶液的A A595595约为约为0.290.29。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验用用于于蛋蛋白白质质浓浓度度测测定定的的方方法法还还有有很很多多，如如氨氨基基黑黑法法、四四溴溴酚酚酞酞磺磺酸酸钠钠法法、考考马马斯斯

157、亮亮蓝蓝R-250R-250法法、荧荧光光胺胺法法、氯氯胺胺T T法法、丹丹磺磺酰酰氯氯法法、凯凯氏氏定定氮氮- -茚茚三三酮酮法法等等。表表10-10-1 1列出不同方法测定蛋白质浓度之比较。列出不同方法测定蛋白质浓度之比较。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验2 2、蛋白质的效价测定、蛋白质的效价测定蛋白质的效价测定较多地采用蛋白质的效价测定较多地采用生物检定法生物检定法。（1 1）小小鼠鼠血血糖糖法法测测定定胰胰岛岛素素效效价价 在在给给小小鼠鼠注注射射胰胰岛岛素素后后，以以其其降降低

158、低血血糖糖或或由由此此而而产产生生的的惊惊厥厥作作用用为为反反应应指指标标，用用适适宜宜的的方方法法如如葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶过过氧氧化化酶酶法法测测定血糖值定血糖值，能直接反映其降血糖的药理作用。，能直接反映其降血糖的药理作用。此此法法用用动动物物少少并并为为微微量量反反应应，反反应应指指标标更更接接近近于于临临床床，设设备备简简单单、操操作作方方便便，克克服服了了小小鼠鼠惊惊厥厥法法判判断断指指标标易易受受主主观观因因素素影影响响、实实验验误误差差较较大大、专专属属性性差差且且需需特特定定的恒温设备等缺点。的恒温设备等缺点。但此方法实验设计但此方法实验设计统计分析较复杂统计分析较复杂，计

159、算步骤繁多。，计算步骤繁多。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（2 2）HPLCHPLC法法分分析析蛋蛋白白质质和和多多肽肽 HPLCHPLC技技术术已已发发展展为为检检测测蛋白质结构和纯度的重要分析工具。蛋白质结构和纯度的重要分析工具。SmithSmith用用RP-HPLCRP-HPLC法法测测定定了了胰胰岛岛素素效效价价，大大大大缩缩短短了了分分析析时时间间，样样品品用用量量少少，同同时时还还能能获获得得对对胰胰岛岛素素纯纯度度评评估必不可少的杂质种类及含量信息。估必不可少的杂质种类及含量信息。李李湛湛君君等等对对比比了了RP-HPLCRP-HPLC法法

160、和和在在体体生生物物测测定定法法（小小鼠鼠血血糖糖法法），证证明明两两种种方方法法测测定定结结果果基基本本吻吻合合，差差异异无无显显著性意义著性意义。在在高高纯纯、单单峰峰胰胰岛岛素素产产品品的的质质量量控控制制中中，理理化化方方法法可可代代替替生生物物测测定定法法。BPBP和和USPUSP对对人人胰胰岛岛素素的的鉴鉴别别和和效效价价测测定定及及其其中中的的高高分分子子蛋蛋白白、脱脱氨氨胰胰岛岛素素和和相相关关蛋蛋白白的的限限量测定，均采用量测定，均采用HPLCHPLC法。法。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（3 3）胰胰岛岛素素的的放放射射免免疫疫分分析

161、析法法 该该法法灵灵敏敏度度高高，可可达达到到pgpg水水平平；特特异异性性强强，样样品品中中的的待待测测物物不不需需提提取取或或纯纯化化，适适合合于于大大批批量量样样品品的的检检测测，便便于于标标准准化化、药药盒盒化化和和自自动化。动化。但但如如样样品品中中存存在在其其他他也也有有免免疫疫活活性性的的物物质质时时，如如胰胰岛岛素素的的聚聚合合物物和和降降解解物物等等，待待测测物物的的测测得得值值与与生生物物活活性性不一定一致。不一定一致。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验在在临临床床上上，人人体体内内胰胰岛岛素素水水平平测测定定可可以以采采用用1 1种种新

162、新的的含含量量测测定定方方法法放放射射性性核核素素稀稀释释法法，即即用用胰胰岛岛素素氘氘化化模模拟拟物物作作内内标标，免免疫疫亲亲和和色色谱谱分分离离后后，反反相相HPLCHPLC纯纯化化，质质谱谱仪仪分分析析，以以胰胰岛岛素素和和其其氘氘化化模模拟拟物物所所引引起起信信号号的的相相对对强强度度来来确确定定样样本本中中胰胰岛岛素素含含量量，能能够够测测定定3 31700pmol/L1700pmol/L胰岛素水平。胰岛素水平。结果显示与标准免疫定量数据有良好的相关性。结果显示与标准免疫定量数据有良好的相关性。因因为为这这种种定定量量方方法法不不受受胰胰岛岛素素类类物物质质的的免免疫疫干干扰扰，避

163、避免了与高胰岛素血症的混淆，具有重要的临床优势。免了与高胰岛素血症的混淆，具有重要的临床优势。第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药多肽因子类和蛋白质类药品检验品检验（4 4）滴定分析法测定抑肽酶的效价。滴定分析法测定抑肽酶的效价。在在一一定定条条件件（pH pH 8.08.0，2525）下下，胰胰蛋蛋白白酶酶使使N-N-苯苯甲甲酰酰-L-L-精精氨氨酸酸乙乙酯酯（BAEEBAEE）水水解解为为N N- -苯苯甲甲酰酰-L-L-精精氨氨酸酸，溶溶液液的的pHpH值值下下降降，加加入入氢氢氧氧化化钠钠试试液液，使使溶溶液液的的pHpH值值回复到回复到8.08.0，水解反应继续进行。，水解反应继续进行。在在胰胰蛋蛋白白酶酶溶溶液液中中加加入入抑抑肽肽酶酶，使使5050胰胰蛋蛋白白酶酶的的活活性性被被抑抑制制，剩剩余余的的胰胰蛋蛋白白酶酶与与N N- -苯苯甲甲酰酰-L-L-精精氨氨酸酸乙乙酯酯进进行行水水解解反反应应，用用氢氢氧氧化化钠钠液液滴滴定定释释放放出出的的酸酸，使使溶溶液的液的pHpH值始终维持在值始终维持在7.97.98.18.1。在在一一定定时时间间内内，根根据据样样品品消消耗耗的的氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液体体积积算算出其活力单位出其活力单位。此法为此法为ChPChP和和BPBP抑肽酶效价测定的法定方法。抑肽酶效价测定的法定方法。