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1、 隐形孔雀石绿多克隆抗体的制备及鉴定 汇 报 人： 导 师： 汇报时间：摘自摘自 食品科学食品科学 01OPTIONS02OPTIONS03OPTIONS04OPTIONS实验背景及意义实验背景及意义实验方法及过程实验方法及过程实验结果及分析实验结果及分析个人收获个人收获 孔雀石绿简介 孔雀石绿孔雀石绿(malachite green，MG) 别名中国绿、品绿，属于有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀菌剂，可用作治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染，也常用作处理受寄生虫影响的淡水水产。由于孔雀石绿具有高毒素、高残留和致畸、致癌、致突变等副作用，当其进入生物体内，就会快速代谢产生具有更强危
2、害的隐性孔雀石绿隐性孔雀石绿(leucomalachite green，LMG)。 2002年5月中国农业部将孔雀石绿列入食品动物禁用的兽药及其化合物清单。2005年水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定国家标准要求孔雀石绿在水产品中的检出率不得超过1g/1000t。 多克隆抗体简介 抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。 由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外
3、，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。 ELISA技术简介 酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay） ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。本次试验采用的是间接酶联免疫吸附法，示意图如下： 实验方法Step 1化学合成法合成隐形孔雀石绿衍生物化学合成法合成隐形孔雀石绿衍生物Step 2隐形孔雀石绿衍生物与隐形孔雀石绿衍生物与BSA偶联制备免疫抗原偶联制备免疫抗原Step 3抗原免疫新西兰白兔，获取抗隐形孔雀石绿多抗原免疫新西兰白兔，获取抗隐形孔雀石绿多克隆抗体克
4、隆抗体Step 4特异性抗体效价的测定特异性抗体效价的测定 实验方法实验步骤一实验步骤一 隐性孔雀石绿衍生物的合成隐性孔雀石绿衍生物的合成 隐性孔雀石绿的分子结构不具有和蛋白偶联的活性基团，所以合成带有羧基的隐性孔雀石绿衍生物是与载体蛋白偶联的基础。 半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性。如果用化学方法把半抗原与某种纯蛋白的分子（载体）结合，纯蛋白会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。4-甲酰基苯甲酸1.2gN,N-二甲基苯胺3.2mL无水乙醇中回流24h(氮气保护)氯化锌3.2g将混合物溶于40mL甲醇中，用
5、HCl调pH值至5.0过滤收集淡绿色结晶，用去离子水清洗，真空干燥，重结晶 实验方法实验步骤二实验步骤二 隐性孔雀石绿隐性孔雀石绿-BSA全抗原的制备全抗原的制备 将前期实验合成的隐性孔雀石绿衍生物用碳化二亚胺法合成免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA。 具体步骤如下：具体步骤如下： 称取8mg CLMG溶于0.1mol/L的含50%二甲基亚砜的MES缓冲液(pH6.0)中，加入4.4mg 碳化二亚胺和2.6mg N-羟基琥珀酰亚胺。 混合物室温搅拌30min，逐滴加入50mL 1mg/mL BSA溶液中。混合物室温搅拌2h，用0.1mol/L PBS (pH7.4)透析，去掉未反应物，即制备出隐性孔
6、雀石绿-BSA全抗原。BSABSA：牛血清蛋白碳二亚胺：碳二亚胺：主要用于活化羧基，使羟基和氨基间脱水形成酰胺键。PBSPBS：磷酸盐缓冲液，与人体血液等渗，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾。N-羟基琥珀酰亚胺：羟基琥珀酰亚胺：用于在酰胺键形成时活化羰基基团，减少副产物。 实验方法实验步骤三实验步骤三 抗隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备抗隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备 应用免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA，采用常规免疫程序免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。空白组空白组背部皮下注射甲试剂甲试剂 1ml/只两周后，背部皮下注射乙试剂乙试剂 1ml/只两周后，同上 1周后采血制备抗血清，用免
7、疫沉淀实验检测抗体效价。并加强免疫，每次用量均为1mL 0.4mg/mL的全抗原 ，且不加任何佐剂，隔周注射，直到抗体效价不再升高为止。甲试剂：甲试剂：将制备的完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，使抗原终质量浓度为0.4mg/mL。乙试剂：乙试剂：换做弗氏不完全佐剂乳化，其他处理同甲。 获取抗体时，采用颈动脉插管取血，血样先27放置1h，然后置于37 2h，最后4过夜。肉眼观察血块收缩后，轻轻吸取血清。 血清用硫酸铵沉淀法进行纯化。将2mL预处理的血清与等体积pH7.4 0.02mol/L PBS溶液混匀，于冰上拌并缓慢逐滴加入4mL饱和硫酸铵(预冷)。置4条件下3h，使其充分沉淀(或于4
8、冰箱中静置过夜)。 6000r/min离心10min，弃上清液。用PBS溶解该沉淀至5mL，逐滴加饱和硫酸铵2.5mL(体积比0.5:1)，置0条件下3h。6000r/min离心10min，弃上清液。用PBS溶解该沉淀至5mL。逐滴加饱和硫酸铵2.5mL (体积比0.5:1)，置0条件下3h。 6000r/min离心10min，弃上清液。将末次离心得到的沉淀物以0.02mol/L PBS-0.2g/L NaN3(pH7.4)溶解至5mL。装入透析袋透析(室温即可)，以彻底除去硫酸铵。 纯化结束后，加入终质量浓度为0.01g/100mL的NaN3，分装成0.1mL的小份，置70低温保存。获取抗体
9、及血清纯化的具体步骤获取抗体及血清纯化的具体步骤 实验方法实验步骤四实验步骤四 隐性孔雀石绿特异性抗体的鉴定和效价测定隐性孔雀石绿特异性抗体的鉴定和效价测定 用碳二亚胺法合成包被抗原LMG-OVA(合成方法同前)，建立ELISA方法检测LMG抗体灵敏度。 具体步骤如下：具体步骤如下：用包被液(pH9.6)系列稀释包被抗原LMG-OVA(1: 500、1: 1000、1: 2000、1: 4000、1: 8000、1: 16000、1: 32000、1: 64000)，每孔100L包被酶标板并4过夜。PBST洗涤，每孔加180L封闭液(1%酪蛋白，0.05%吐温-20，0.01mol/L pH7
10、.4 PBS)，室温2h。洗涤，每孔加100L系列稀释(1: 5000、1: 10000、1: 20000、1: 40000、1: 80000、1: 120000)的抗血清，37条件下1.5h。设重复孔及阴性对照孔。洗涤，每孔加入100L HRP-羊抗兔抗体(1:2000稀释)，于37条件下1.5h。洗涤，每孔加入底物液A(TMB)和底物液B(30% H2O2)各50L，37条件下1015min。最后每孔加入50L终止液终止反应5min，读取492nm波长处的吸光度A492nm。 OVA为卵清蛋白。为卵清蛋白。 采用采用ELISA法鉴定抗体效法鉴定抗体效价时，需偶联不同于免疫原价时，需偶联不同
11、于免疫原的载体蛋白作为包被抗原。的载体蛋白作为包被抗原。 实验结果及分析结果一结果一 隐性孔雀石绿衍生物的合成结果隐性孔雀石绿衍生物的合成结果 实验结果及分析结果二结果二 隐性孔雀石绿隐性孔雀石绿-BSA全抗原的制备结果全抗原的制备结果 实验结果及分析结果三结果三 隐性孔雀石绿特异性抗体效价测定隐性孔雀石绿特异性抗体效价测定 实验结果及分析结果三结果三 隐性孔雀石绿特异性抗体效价测定隐性孔雀石绿特异性抗体效价测定半抑制浓度（或称半抑制率），即IC50。 实验结果及分析 合成孔雀石绿衍生物进而制备出高纯度的免疫抗原是本课题的关键所在，包括合成条件、蛋白偶联方法的选择以及透析程度等。 在合成带有羧
12、基的隐性孔雀石绿衍生物时，N,N-二甲基苯胺需要新鲜蒸馏，反应时无水乙醇应及时补充，以确保在充足氮气和乙醇中完全反应，减少副产物的生成。 重结晶后CLMG粉末于4避光保存。合成全抗原后透析时，在4磁力搅拌条件下每隔23h更换1次透析液，一般透析24h即可。透析产物中有少量乳白色絮状沉淀属正常现象，不影响实验结果。 免疫动物时为了能够产生高效特异性强的抗体，选择进行背部皮下注射结果较理想。在使用佐剂的情况下，一次注入的总佐剂量以0.5mg/kg体质量为宜。 个人收获访谈结果与析访谈结果与析 抗隐性孔雀石绿特异性抗体的效价达到了1:32000，说明用碳二亚胺法合成的免疫原制备隐性孔雀石绿多克隆抗体的方法是比较理想的。 对比以往文献，有做直接关于孔雀石绿的ELISA试剂盒的案例。孔雀石绿在水生动物体内迅速代谢成无色孔雀石绿，而无色孔雀石绿的毒性甚至超过孔雀石绿，所以通常将孔雀石绿和无色孔雀石绿的总量作为动物源性食品中孔雀石绿残留的限量指标。因此，分别针对水产中孔雀石绿总量及单独两者的检测，或可更为准确快速的了解水产中孔雀石绿的信息。 敬请各位老师同学批评指正！
