《土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-课件（31页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、课题2土壤中分解尿素的土壤中分解尿素的细菌的分离和菌的分离和计数数课题2 微生物的培养与应用一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素: :农业氮肥。不能直接吸收。农业氮肥。不能直接吸收。 细菌细菌分解成氨分解成氨之后才能被利用之后才能被利用2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )2 2脲酶脲酶+ CO+ CO2 2NHNH3 3+H2O3 3、常见微生物、常见微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌等某些真菌和放线菌也能分解尿素。杆菌等某些真菌和放线菌也能分解尿素。4 4、课
2、题目的、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌的细菌 1 1、实例：、实例：启示：启示：启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。到相应的环境中去寻找。到相应的环境中去寻找。到相应的环境中去寻找。原因：原因：原因：原因：70707070808080800 0 0 0C C C C，淘汰绝大多数微生物，只有，淘汰绝大多数微生物，只有，淘汰绝
3、大多数微生物，只有，淘汰绝大多数微生物，只有TaqTaq细菌能生存细菌能生存细菌能生存细菌能生存DNADNADNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应多聚酶链式反应多聚酶链式反应是一种在体是一种在体是一种在体是一种在体外将外将外将外将少量少量少量少量DNADNADNADNA大量复制大量复制大量复制大量复制的技术。的技术。的技术。的技术。耐高温（耐高温（耐高温（耐高温（939393930 0 0 0C C C C）DNADNADNADNA聚合酶。聚合酶。聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株一一.研究思路研究思路TaqTaq细菌细菌细菌细菌配置合适的培养基配置合适的培养基配置合适的培养基配置合适的培养
4、基抑制大多数微生物生长抑制大多数微生物生长抑制大多数微生物生长抑制大多数微生物生长利于利于利于利于目的菌株目的菌株目的菌株目的菌株生长生长生长生长结果：结果：结果：结果：培养一定时间后，培养一定时间后，培养一定时间后，培养一定时间后，目的菌株目的菌株目的菌株目的菌株数量上升，再通数量上升，再通数量上升，再通数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。2、微生物筛选原理：、微生物筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于人为提供有利于人为提供有利于目的菌株
5、目的菌株目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件生长的条件生长的条件( (包括包括包括包括营养、温营养、温营养、温营养、温度、度、度、度、pHpH等等等等) )，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。15.0g15.0g15.0g15.0g琼脂琼脂琼脂琼脂1.0g1.0g1.0g1.0g尿素尿素尿素尿素10.0g10.0g10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖0.2g0.2g0.2g0.2gMgSOMgSOMgSOMgSO44447H7H7H7H2 2 2 2O O O O2.1g2.1g2.1g2.1g
6、NaHNaHNaHNaH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 41.4g1.4g1.4g1.4gKHKHKHKH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看属于哪类？从功能上从物理性质看属于哪类？从功能上从物理性质看属于哪类？从功能上从物理性质看属于哪类？从功能上属于哪类培养基？属于哪类培养基？属于哪类培养基？属于哪类培养基？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为
7、碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素氮源：氮源：尿素尿素选择培养基选择培养基4 4、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？选择培养基：选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生在微生物学中，将允许特定种类的微生在微生物学中，将允许特定种类的微生在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。结果结果实验组实验组对照组对照组牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨尿素尿素唯一氮源唯一氮源只
8、生长分解尿素细菌只生长分解尿素细菌培养基类型培养基类型生长多种微生物生长多种微生物1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：2.2.当样品的稀释度当样品的稀释度足够高足够高时，培养基表时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数菌落数，就能推测出样品中大约含有，就能推测出样品中大约含有多少活菌。多少活菌。（1）原理：）原理：稀释涂布平板法稀释涂布平板法（
9、活菌计数法）活菌计数法）活菌计数法）活菌计数法）（2 2）稀释度：稀释度：106设置重复组：设置重复组：3个以上平板，个以上平板，菌落数在菌落数在30-300的求平均数的求平均数 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同例：两位同学用稀释涂布平板法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统计结果。 1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为菌落数为230230。 2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C
10、 C三个平板，三个平板，统计的菌落数分别为统计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三，该同学以这三个平板上菌落数的平均值个平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？错在哪？ 甲：没有甲：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板） 乙：乙：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上
11、进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。（三）设置对照（三）设置对照 1 1、设置对照的目的：、设置对照的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。果的影响，提高实验结果的可信度。 对照实验对照实验是指除了是指除了被测试被测试的条件外，的条件外，其他条件都其他条件都相同相同的实验。满足该条件的实验。满足该条件的称为的称为对
12、照对照组，未满足该条件的称为组，未满足该条件的称为实验实验组。组。.设置对照：设置对照：2.设置对照的方法：设置对照的方法：空白对照：不给对照组任何处理因素。空白对照：不给对照组任何处理因素。条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素。处理因素。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。A A同学的结果与其他同学不同，可能同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。的解释有两种
13、。一是由于土样不同一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误二是由于培养基污染或操作失误。小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误
14、；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二. .实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土
15、壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度三三样品的稀释样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用104 105 106 测定放线菌的数量，一般选用103 104 105 测定真菌的数量，一般选用102 103 104 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？原原因因：不不同同微微生生物物在在土土壤壤中中
16、含含量量不不同同.例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌菌数数约约为为477477万万，霉霉菌菌数数约约为为23.123.1万。万。目目的的：保保证证获获得得菌菌落落数数在在30300之之间间、适适于于计计数的平板数的平板结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供选择培养的条件。供选择培养的条件。. .取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明
17、培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300303003030030300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀
18、释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25
19、252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察三三. .结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数
20、的三个重复的菌落数不能相同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 五五. .课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮
21、水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝 培养培养培养培养基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB
22、)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结: :1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（ ） A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（ ） A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3
23、.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( ( ) ) A.COA.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A A C CD D4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（ ） A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，
24、以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（） A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐
25、高浓度食盐B BC C例例3 3（20052005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是是 ，青霉素是青霉菌的，青霉素是青霉菌的 代谢产物。代谢产物。在生产和科研中，常选用处于在生产和科研中，常选用处于 期的青霉期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛， 和和 比较稳定。比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，酵液，经离心分离、反复洗涤后， ，再计算发酵罐中菌体的总重量。，再计算发酵罐中菌体的总重量。异养需氧型异养需氧型次级次级对数对数个体形态个体形态生理特性生理特性称菌体的湿重称菌体的湿重 （称烘干后的重量）（称烘干后的重量）测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？http:/
