生物化学大实验课件

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1、层析技术层析技术 生物化学大实验4.1 层析技术概述层析技术概述4.1.1 引言引言层 析 法 亦 称 层 离 法 或 色 谱 法（Chromatography），它从发明至今已有一个多世纪的历史。1903年俄国植物学家茨维特（M. Tswett）首先使用此法分离植物色素。他向填充有CaCO3粉末的柱内加入植物色素提取液，并以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，出现了不同颜色的谱带。后称之为色谱。由chroma（色彩）和graphs（图谱）构成色谱一词，层析法由此而得名。生物化学大实验但是，当时这种方法并没引起人们太多的关注，

2、直到1931年R. Kuhn用此法从蛋黄中分离出黄体素、从玉米中分离出玉米黄色素开始，层析技术才逐渐引起了人们的重视。此后1941年Martin用具有亲水能力的硅胶介质填充的层析柱分离氨基酸成功，并提出了液-液分配层析最初的塔板论。 生物化学大实验英国生物学家Martin和Synge根据塔板论，提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。前者预见了气相色谱的产生，并在1952年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分

3、离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱（HPLC）的产生，在60年代末也为人们所实现。80年代后期，人们在气相层析技术和液相层析技术的基础上还发展了超临界色谱。现在它们已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离手段。因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。 生物化学大实验4.1.2 层析的两个重要理论层析的两个重要理论层析法是一种利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移

4、动而达到彼此分离的目的。 生物化学大实验（1）塔板理论）塔板理论层析分离技术的目的是要将混合样品中各组分彼此分开，它遵循相似相溶的原理，在互不相溶的两相（固定相和流动相）之间进行分配。根据塔板理论，可以把层析柱设想由若干个层（即塔板）组成，被分离组分在每一个层（塔板）里的两相之间达到一次平衡，就进行了一次分配，相当于经过一个层（塔板）高。在分离过程中组分要达到多少次平衡，进行了多少次分配，应经过多少个层（塔板）高。理论塔板数量是衡量物质在柱内的分配次数，分离次数越多物质的分离效果越好。这样分配系数小的组分和分配系数大的组分就能彼此分开，分配系数小的组分每次达到平衡的时间短，从层析柱中先流出；分

5、配系数大的组分每次达到平衡的时间长，从层析柱中后流出。 生物化学大实验对于一个层析柱来说，可作如下基本假设：1. 层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理论塔板。层析柱的长度用L表示。2. 每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡，且忽略分子纵向扩散。3. 溶质在各塔板上的分配系数是一常数。4. 流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程（即不连续过程）。5. 溶质开始加在层析柱的第零塔板上。根据以上假定，将连续的层析过程分解成了间歇的动作，这与多次萃取过程相似，一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元（一次萃取）。则理论塔板数量n为：L/H生

6、物化学大实验（2）速率理论）速率理论根据上述假设，塔板理论初步阐明了组分在层析中的迁移速度。它可以定量地描述层析柱的柱效率等。对层析技术的发展起了重要的推动作用。但是塔板理论采用的是平衡过程的研究方法，忽略了许多动力学因素对柱分离效率的影响。实际上，层析分离与分子的扩散及运动速度是有关的，而且，同一溶质在不同流动相流速下将具有不同的理论塔板数，所以，后来又发展了非平衡态的层析理论，或称速率理论。该理论吸收了层析的塔板理论的观点，同时又进一步把层析分离的分配过程与涡旋流扩散、分子扩散及传质阻力三者的关系联系起来，提出了连续流塔板模型。生物化学大实验用Van Deemter方程表示影响塔板高度的因

7、素。H=A+B/u+Cu其中，A、B、C分别表示涡旋流扩散、分子扩散和传质阻力的3种系数；u表示流动相线性流速。由上式可以看出，当流动相流速一定时，A、B、C越小，H也越小，理论塔板数越大，柱效就越高。生物化学大实验下面我们来讨论一下这三方面因素的影响。涡旋流扩散（涡旋流扩散（A） 流动相中的组分由于受到固定相颗粒的阻碍，不得不从各种无规则的固体颗粒之间的间隙绕行，迫使其流动的方向不断发生改变，称为涡旋流扩散。由此可见，涡旋流现象的发生是由于固定相的颗粒大小不均匀及填充柱的不均匀引起各组分在层析柱中所发生的位移不同。它与流动相的性质、流速及组分的性质无关。因而，层析最好使用颗粒细、粒度均匀的填

8、料作为固定相，以减少涡旋流扩散。 生物化学大实验分子扩散（分子扩散（B/u）分子扩散是由浓度梯度所造成的。当样品随着流动相流经层析柱的时候，样品的前端和后端的浓度一定会降低，这就产生了浓度差，有了浓度差就会形成自由扩散，即分子扩散。分子扩散对于气相色谱和液相色谱的影响大相径庭，由于组分在液体中比气体中的扩散要小105倍，它对液相色谱的影响可以忽略。分子扩散不仅与组分在气相层析中停留的时间成正比，它还与载气和组分的性质、温度液相色谱的影响、压力和分子量等有关。 生物化学大实验传质阻力（传质阻力（Cu） 在层析过程中，样品各组分总是从流动相进入固定相，又从固定相进入流动相，如此反复多次，最终完成层

9、析。那么，流动相把组分交给固定相速度，固定相把组分交给流动相的速度，以及各组分在固定相和流动相中达到平衡的速度都是影响层析的因素，这就是传质阻力。由此可见，传质阻力与流动相中组分的扩散和固定相中组分的扩散有关。由于气体分子的传质速度特别快，传质阻力对于气相色谱和液相色谱的影响也是大相径庭的，与分子扩散的影响相反，它对气相色谱的影响可以忽略。若要减少液相层析的传质阻力，最好使用颗粒细，且微孔孔径大的固定相。 生物化学大实验4.1.3 层析的基本概念层析的基本概念 1. 固定相：固定相： 固定相是由层析基质组成的。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或

10、硅胶上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 2. 流动相：流动相： 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。生物化学大实验3. 分配系数及迁移率（或比移值）分配系数及迁移率（或比移值）： 分配系数是指：在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的重要依据。迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。实验中我们还常用相对迁移

11、率的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。生物化学大实验4. 分辨率（或分离度）分辨率（或分离度） 简言之，分辨率是指相邻两个峰的分开程度，是用来判断相邻两组分在层析柱内的分离情况的，可以用两个层析峰保留值之差与两峰底宽的平均值之比表示。用Rs来表示。图是计算分辨率的示意图。分辨率： 由上式可见，Rs值越大，两种组分分离的越好。

12、当Rs 1时，两峰总会有部分重叠；当Rs = 1时，两组分具有教好的分离，互相重叠约2%，即每种组分的纯度约为98%；当Rs=1.5时，两组分完全能分开，每种组分的纯度可达到99.8%。一般而言，Rs 0.8标志相邻两组分的分离不符合要求，Rs=1.5是相邻两组分达到完全分离的重要标志。 生物化学大实验 总之，影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑，特别是对于生物大分子，我们还必须考虑它的稳定性，活性等问题。如pH值、温度等都会产生较大的影响，这是生化分离绝不能忽视的。否则，我们将不能得到预期的效果。生物化学大实验 5. 正相色谱与反相色谱正相色谱与反相色谱正相

13、色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。一般来说，正相色谱（或正相柱）用于分离纯化极性大的分子（带电离子等）。反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。一般来说，反相色谱（或反相柱）用于分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）。生物化学大实验 6. 操作容量（或交换容量）操作容量（或交换容量）在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量（或交换容量）。一般以每克（或毫升）基质结合某种

14、成分的毫摩尔数或毫克来表示，数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强；否则反之。应当注意，同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，其受到分子大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等诸多因素的影响。因此，实际操作时，要想能得到有效的分离，样品的加入量要尽量少些。生物化学大实验7. 床体积（床体积（Vt）通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt）。Vt是基质的外水体积（Vo）和内水体积（Vi）以及自身体积（Vg）的总和。即Vt= Vo + Vi + Vg。柱床体积Vt可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。8. 洗脱体积（洗脱体积（Ve）洗脱体积是指

15、某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。生物化学大实验 9. 外水体积（外水体积（Vo）外水体积指基质颗粒之间体积的总和。外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定。一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大（为200万），在各种型号的凝胶中都被完全排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。10. 内水体积（内水体积（Vi）内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。11. 基质体积（基质体积（Vg）基质体积是指基质自身所具有的体积。生物化学大实验12. 死时间（死时间（t0）及死体积（）及死体积（V0）流动相中的溶质进入层析柱后，不被固

16、定相所吸附，与固定相不发生任何作用，通过柱所需要的时间，称为死时间（t0）；通过柱所收集的体积，称为死体积（V0）。13. 保留时间（保留时间（tR）及保留体积（）及保留体积（VR）自流动性中的某一组分进入层析柱开始到出现该组分峰最高点时，所需要的时间称为保留时间（tR），所收集的体积称为保留体积（VR）。生物化学大实验4.1.4 层析法的分类层析法的分类 层析根据不同的标准可以分为多种类型：1. 根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析是指以滤纸作为基质的层析。薄层层析是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行层析。柱层析则是指将基质填装在管中形成柱

17、形，在柱中进行层析。纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。生物化学大实验2. 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析、气相层析和超临界层析。气相层析是指流动相为气体的层析，而液相层析指流动相为液体的层析。气相层析测定样品时需要气化，大大限制了其在生化领域的应用，主要用于氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相层析是生物领域最常用的层析形式，适于生物样品的分析、分离。3. 根据分离的原理不同分类，层析主

18、要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。吸附层析是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。生物化学大实验分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合

19、的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。生物化学大实验4.1.5 柱层析的基本装置及基本操作柱层析的基本装置及基本操作1. 柱层析的基本装置柱层析的基本装置柱层析的设备主要有溶剂池、层析柱、恒流泵、部分收集器、检测仪和记录仪。有时还需要梯度混合器等。溶剂池主要用于储存样品和作为流动相溶液或溶剂的储存器。层析柱包括层析介质、带有筛板的玻管和各种接口。恒流泵用以保持一定的操作压，作为流动相的推动力，以便使样品和洗脱液以一定的流速通过层析柱。部分收集器收集柱子流出液的装置，它使每一管按预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集，

20、把整个流出液划分成许多个部分。检测仪是用来监测通过层析柱的流出液的仪器，主要有紫外检测器、荧光检测器、示差折光率检测器和电导检测器等。生物化学大实验梯度混合器是有两个彼此相通的圆筒容器和一个搅拌器组成的。如图：通过该装置可以制造出线型梯度、凸型梯度、凹型梯度三种梯度形式。在图中的A瓶中注入低浓度溶液，在B瓶中注入高浓度溶液，若A1=B1时，则为线型梯度；若A1B1时，则为凹型梯度。如果在A瓶和B瓶中注入的是不同的pH或极性的溶液，同样也可以得到类似于上述的三种梯度类型。 生物化学大实验 2. 柱层析的基本操作柱层析的基本操作柱层析的基本操作包括以下一些步骤： 选柱选柱 层析柱大小主要是根据样品

21、量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等现象。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:251:100之间。生物化学大实验 装柱装柱柱子填充质量的好与差，是关系到柱层析法能否成功分离纯化物质的关键。一般要求填料在柱内颗粒大小分布均匀，松紧一致，填料微孔中无气泡，不能分层，连接处无死体积，柱床体积稳定，在较高的工作压力下不坍塌变形、流速稳定等。否则要重新装柱。在填充层析柱之前，对所要填充的材料需作一些预处理。可根据不同的材料作

22、相应的溶胀、漂洗、再生、转型、脱气等。例如，将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5N1N）、碱 （0.5N1N）、盐（0.5M1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质，用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净，然后再用酸碱处理得到所需的离子形式，最后再用去离子水（或蒸馏水）洗涤至中性。 生物化学大实验层析柱的填充是先关闭出水口，用溶剂灌注至1/3柱高，并使筛板下的“死体积”不存有气泡，再将处理好的填充材料缓慢地倒入柱中，以防止气泡存留在柱内，静置使其沉降，并放出过多的溶剂，为了避免分层，最好一次装完，如需分几次填充，则在二次填充前应先在已经沉淀

23、的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。用溶剂彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后在床面上铺一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。 生物化学大实验 平衡平衡 柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。用恒流泵控制其流速（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为23倍柱床体积，以保证平衡后柱子符合填充均匀、松紧一致和没有气泡的标准。如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。 生物化学大实验 加样加样 加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量

24、应少于20%的操作容量，加样体积应低于5%的床体积。对于分析性柱层析，加样体积不超过床体积的1%。上柱前，应先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，使样品溶液的浓度尽可能高些，以减少加样体积，使区带狭窄。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。 应注意的是：样品溶液不能有沉淀出现，否则应过滤后再上样。加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击填料，以保持填料表面平坦。样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。 生物化学大实验 洗脱洗脱 洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。 简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂进行洗脱，也就是溶剂的种类、浓度、pH等都不变化。如果

25、被分离物质的各组分在该溶剂和固定相中的分配系数较大，采用这种方法是适宜的。 分步洗脱：对层析柱进行洗脱时，当与柱子结合的一个组分被一种溶剂洗脱后，更换溶剂洗脱下一个组分，一种溶剂洗脱其中一种组分。这种用几种洗脱能力递增的溶剂进行逐级洗脱的方法称为分步洗脱。 梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，可以采用逐渐改变溶剂的性质，形成一个浓度、极性、离子强度或pH值等连续递增或递减的梯度，从而使各组分依次被洗脱，这种方法称为梯度洗脱。最常用的是浓度梯度，在水溶液中，亦即离子强度梯度。它的优点之一是能够减少拖尾现象。 生物化学大实验由于影响柱层析效果的因素很多，洗脱条件的选择就尤为重要。在选择了

26、洗脱方式后，同时还应注意洗脱时的速率。根据速率理论，我们知道流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。因此，为了获得满意的分离结果，溶剂的流速务必恰当控制。除了洗脱方式、流速以外，还有温度、压力等条件的影响。总之，我们必须经过反复的试验与调整，才能得到最佳的洗脱条件。 生物化学大实验 收集、检测、合并及保存收集、检测、合并及保存 洗脱下来的流出液用部分收集器来收集。每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。然后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线（以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标）。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴

27、定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物活性，一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉，在低温下保存备用。 生物化学大实验 柱子的再生柱子的再生 柱层析的许多填料（吸附剂、离子交换树脂或凝胶等）经过适当方法的处理，又恢复其性能，可以反复使用多次，这就称为柱子的再生。各种填料的再生方法是不同的，详细操作可参阅操作手册及有关文献。 生物化学大实验4.2 凝胶层析凝胶层析 凝胶层析是20世纪60年代发展起来的一种简便有效的生物化学分离分析方法，又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶

28、过滤、凝胶渗透层析等。它是以具网状结构的凝胶填料作为固定相，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部，按分子量大小分离样品中各个组分的液相色谱方法。1959年，Porath和Flodin首次将多孔聚合物交联葡聚糖凝胶作为柱填料，后来人们将凝胶制成球形微珠，作为分离介质，获得了巨大成功。1964年，Moore又制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前已经成为生物化学实验中不可替代的技术手段之一。 生物化学大实验凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等

29、为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前主要用于生物化学、分子生物学和生物制药研究和生产中的蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化。同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。它具有设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高、条件温和，特别是不改变样品生物学活性等优点。 生物化学大实验4.2.1 凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理 凝胶层析是一种物理的分离纯化手段，它是依据样品中各组分间分子大小的差异设计的。凝胶层析的填料溶胀后是具有立体网状结构的球形惰性凝胶颗粒，颗粒的表面和内部形成很多孔穴，且孔穴直径较一致。若样品中各组分的分子大小不同，样品进入凝胶层析柱后，各个组分向凝

30、胶颗粒的孔穴内扩散，能否进入孔穴内部取决于孔穴的大小和组分分子的大小。比孔穴孔径大的分子不能进入孔穴内部，完全被排阻在孔穴之外，只能沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，随流动相向下流动，它们在柱内迁移的路径短，停留时间短，保留值小，所以迁移率最快，首先从柱中流出；生物化学大实验而分子小的组分则可以完全进入凝胶颗粒内部，沿着凝胶颗粒内的立体网状孔穴流过，它们在柱内迁移的路径长，停留时间长，保留值大，所以迁移率最慢，最后从柱中流出；而分子大小介于二者之间的在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们的大小，所以它们流出的时间也介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。样品经过凝胶层

31、析后，各个组分按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。生物化学大实验4.2.2 凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质 凝胶的种类很多，但能用于凝胶层析的，应具有这样几个特征：惰性好，不能与待分离的物质发生化学反应、吸附作用、离子交换作用或亲和反应等；耐受性好，在高温和有机溶剂的作用下，不发生变形；刚性好，应具有一定机械强度，能承受一定的操作压力。常用的凝胶主要有葡聚糖凝胶（dextran）、聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）、琼脂糖凝胶（agarose）以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。下面将分别介绍。 生物化学大实验1.

32、葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是指由葡聚糖与交联剂相互交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech生产。常见的有两大类，商品名分别为Sephadex和Sephacryl。Sephadex又可分为G型和LH型两类。葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex G系列，它是葡聚糖与3氯1,2环氧丙烷（交联剂）以醚键相互交联而成。结构式图！葡聚糖凝胶的交联程度（简称交联度）由环氧氯丙烷的百分比控制，它与凝胶颗粒网状结构孔径的大小有直接关系，交联度越大，网状结构的孔径越小，分离的分子量越小；反之，交联度越小，网状结构的孔径越大，分离的分子量越大。 生物化学大实验Sephadex G的

33、主要型号是G-10 G-200，型号不同，交联度也不同，分离相对分子质量的范围就不同，这就是所谓的分级分离。例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,00070,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。Sephadex G后面的数字除以10表示该凝胶的吸水率（吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，不包括颗粒间吸附的水份。单位是ml / g干胶）。如Sephadex G-50，表示吸水率是5ml/g干胶。葡聚糖凝胶是不溶于有机溶剂和水的聚合物，但其结构中含有大量的羟基，因此，Sephadex G的亲水性很好，能迅速在水中

34、和电解质溶液中溶胀，层析过程中与水溶性溶质接触非常容易。不同型号的Sephadex G的吸水率不同，分级分离范围也不同。数字越大的，分级分离范围越大，排阻极限也越大。 生物化学大实验排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。它代表该凝胶能有效分离的最大分子量，大于它的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。Sephadex G中排阻极限最大的G-200为6105。Sephadex G在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使

35、用。Sephadex G稳定工作的pH一般为为210。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex G与强酸和氧化剂接触。Sephadex G在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100 C下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。 生物化学大实验Sephadex G由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。所以在用Sephadex G进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，这样就可以避免Sephadex G与蛋白发生吸附，但应注意如果盐浓度过高

36、，会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。Sephadex G有各种颗粒大小（一般有粗、中、细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex G的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。 生物化学大实验另外，Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH型烷基化葡聚糖凝胶。LH型葡聚糖凝胶与G型葡聚糖凝胶相比较区别在于：一般以G型葡聚糖凝胶（经水溶液溶胀）作为固定相，以水溶液作为流动项，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。而以LH型葡

37、聚糖凝胶（经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂溶胀）作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。LH型葡聚糖凝胶的主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。 生物化学大实验Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺（N, N-methylene bisacrylamide）交联而成。是一种硬性凝胶。Sephacryl与Sephadex相比有很多优点：其一，它的化学和机械稳定性更高，Sephacryl在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可用各种去污剂（如SDS）、6mol/

38、L盐酸胍或8mol/L尿素等作为洗脱液；其二，耐高温，在120消毒（pH7.0时）处理后，层析性质没有明显变化；其三，Sephacryl稳定工作的pH一般为211，在0.2mol/L NaOH溶液中（室温）处理100小时，其低流速和多孔性没有明显影响；其四，Sephacryl的机械性能较好，比较耐压，可以用较高的流速洗脱，分辨率也较高；其五，它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于Sephadex的范围。所以它不仅可以用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖，甚至是质粒、大的病毒颗粒（直径300-400nm）。 生物化学大实验2. 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是以丙烯

39、酰胺（acrylamide，简称Acr）为单体，甲叉双丙烯酰胺（N, N-methylene bisacrylamide，简称Bis）为交联剂，在过硫酸铵-TEMED（四甲基已二胺）或核黄素-TEMED催化剂的作用下交联而成。通过控制丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的比例，就可以得到不同交联度的聚丙烯酰胺凝胶。最常用的聚丙烯酰胺凝胶层析介质是由Bio-Rad Laboratories生产的商品名为Bio-Gel P的系列产品，主要型号有Bio-Gel P-2 Bio-Gel P-300等10种，后面的数字103基本代表它们的排阻极限，排阻极限最大的Bio-Gel P-300为3105。所以数字越大，表

40、示交联度越小，凝胶孔径越大，分级分离的范围也就越大，反之亦然。 生物化学大实验聚丙烯酰胺凝胶的分级分离范围、吸水率等性能，在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中的稳定性等基本近似于Sephadex。聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性比Sephadex好，在pH为110之间比较稳定。但在较强的碱性或较高的温度条件下不如Sephadex稳定，易发生分解。另外，聚丙烯酰胺凝胶是一种化学合成的凝胶，不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。聚丙烯酰胺凝胶对芳香族、酸性、碱性化合物稍有吸附作用，如使用离子强度略高的洗脱液操作，此弊病就可以克服。 生物化学大实验3. 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 琼脂糖是从琼脂中分离

41、出来的天然线性多糖。琼脂由中性链状的琼脂糖和带负电荷的含磺酸基和羧基的琼脂胶两部分组成。其制备过程就是去除琼脂胶留下琼脂糖。琼脂糖是由D半乳糖和3,6脱水半乳糖交替构成的链状多糖。它在100 C时呈液态，当温度降至45 C以下时，多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异，常见的主要有瑞典的Sepharose系列、美国的Bio-gel A系列、英国的Sagavac系列、丹麦的Gelarose系列和我国的QT系列等。在Sepharose B系列产品中，B前面的数字表示琼脂糖的百分比浓度，例如Sepharose 6B表示琼脂糖的

42、浓度为6%， B前面的数字越大，表示交联度越大，凝胶孔径越小，分级分离的范围也就越小，反之亦然。 生物化学大实验琼脂糖凝胶的稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。它在室温下保存是很稳定的，工作在pH 49之间是稳定的，另外琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明显变化，因此，使用琼脂糖凝胶作为介质洗脱速度可以更快。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小，排阻极限却很大，分离范围更广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低。琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以030 C为宜。 Sepharose与1,3二溴异丙醇反应，形成Sepharose CL型交联凝胶，交联前后的

43、分离性能没有改变，只是热稳定性和化学稳定性都有所提高，可以在更广泛的pH范围内应用，稳定工作的pH范围为313。Sepharose CL型凝胶还特别适合于含有有机溶剂的分离。 生物化学大实验4. 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶 该凝胶是利用交联的聚丙烯酰胺作为三维空间骨架，再用琼脂糖嵌入其内部组成的混合型凝胶。这样制成的凝胶刚性好，孔径大，理化性质介于两者之间。它们主要由LKB提供的 Ultrol Gel AcA系列，AcA后面的数字分别表示聚丙烯酰胺和琼脂糖的百分比浓度，例如Ultrol Gel AcA34表示聚丙烯酰胺的百分比浓度是3%，同时琼脂糖的百分比浓度是4%，

44、数字越大，表示交联度越大，凝胶孔径越小，分级分离的范围也就越小，反之亦然。 生物化学大实验5. 多孔硅胶、多孔玻璃珠多孔硅胶、多孔玻璃珠 顾名思义，它们就是将硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔状结构的球形颗粒。多孔硅胶和多孔玻璃珠都属于硬质无机凝胶。它们的最大的特点是机械强度很高、化学稳定性好，使用方便而且寿命长，在较高的层析流速下，分辨率并不受影响。最大缺点是吸附效应较强（尤其是多孔硅胶），可能会吸附比较多的蛋白，但可以通过表面处理和选择洗脱液来降低吸附。另外它们也不能用于强碱性溶液，一般使用时pH应小于8.5。多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围都比较宽，多孔硅胶一般为1025106，多孔玻璃珠一

45、般为31039106。 生物化学大实验除了上述5类凝胶外，由于近年来各类凝胶技术发展得很快，目前已研制出很多性能优越的新型凝胶。例如Pharmacia Biotech的Superdex（由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成）和Superrose（高交联度多孔琼脂糖珠）。其它关于各种凝胶产品的详细情况可以参阅各个公司的产品目录。 生物化学大实验4.2.3 凝胶层析操作的具体问题凝胶层析操作的具体问题 1. 凝胶的选择凝胶的选择 选择凝胶时，首先要确定是组分分离还是组别分离。所谓组别分离是指分离那些相对分子质量之间相差很大的样品。例如蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质以及一些注射剂去

46、除大分子热源物质等等，它们之间的相对分子质量相差数十至数百倍，应选用能将大分子完全排阻而小分子完全渗透的凝胶，一般交联度较大的凝胶层析介质分离效果好，比如，葡聚糖凝胶Sephadex G-25或聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P-6等。生物化学大实验所谓组分分离则是指分离那些相对分子质量之间相差较小的样品。在进行组分分离时，要大概知道样品各组分的相对分子质量的最大最小值才能选择凝胶的型号，例如分离相对分子质量在5000100000之间的混合样品，选择凝胶的分离范围应正好包括所需的各个组分的相对分子质量，比如，葡聚糖凝胶Sephadex G-100等。因为分离范围选择过小，则某些组分不能得到分离；

47、分离范围选择过大，则分辨率较低，分离效果不好。生物化学大实验选择凝胶时，其次要选择凝胶颗粒的粒度。所谓粒度就是凝胶颗粒的大小，而与交联度无关。粒度小，外水体积也小，装柱易均匀，层析时涡旋扩散影响小，分辨率高，但流速慢；粒度大，外水体积也大，装柱不易均匀，层析时涡旋扩散影响较大，分辨率低，但流速快。选择时要依据分离的具体情况而定，例如进行组别分离时，则可以选用粒度大的凝胶，很快达到分离的目的；进行组分分离时，则要选用粒度小的凝胶以提高分辨率。 生物化学大实验2. 凝胶的预处理凝胶的预处理选择好凝胶的类型和层析柱后，根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，按下面的公式估算出凝胶的用量。干胶用量（g）柱床

48、体积（ml）/ 膨胀度（ml / g）。由于处理凝胶过程中可能有一定损失，所以用此公式计算出的干凝胶用量还需再增加1020。 将称取的干凝胶放在蒸馏水中溶胀，所需的溶胀时间依据不同类型凝胶的产品说明。如果加热煮沸，则溶胀时间会大大缩短，一般在15小时即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但必须避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏。溶胀处理后，要对凝胶进行反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均一的粒度过小的凝胶。然后用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl浸泡半个小时，再用水洗至中性。为了除去凝胶颗粒中的气泡，可以通过抽气或加热煮沸的方法实现，否则会影响分离效果。多孔玻璃珠和多

49、孔硅胶不需溶胀处理。 生物化学大实验3. 凝胶的再生和保存凝胶的再生和保存对于刚使用的新凝胶柱子，只需洗涤后重新平衡，即可再生。对于使用多次的凝胶柱子，需要将凝胶取出，按预处理的方法用酸或减处理后，重新装柱即可再生。使用过的凝胶，若要短时间保存，一般是反复洗涤去除蛋白质等杂质，然后加入适当的抗菌剂，例如：0.02的叠氮化钠、0.01%0.02%三氯丁醇、0.005%0.01%乙基汞硫代水杨酸钠、0.001%0.01%苯基汞代乙酸盐、苯基汞代硝酸盐或苯基汞代硼酸盐等，4 C下保存。若在较长的时间内不再使用，溶液中的凝胶容易长细菌，使其化学性质发生某些变化，如发生氧化、离子化等，因此，需将其干燥保

50、存。首先要将凝胶进行洗涤，以除去凝胶表面的污染物，然后将凝胶放在浓度由低到高的乙醇中逐级脱水（30%、50%、70%、80%、95%、无水乙醇），最后是乙醚，脱水后的凝胶在室温下晾干，或置于60 C烘箱中烘干，将乙醚挥发干，即可装瓶保存。注意溶胀的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶的结构。 生物化学大实验4. 洗脱液的选择洗脱液的选择凝胶层析所使用的洗脱液比较简单，只是起运载工具的作用，不依赖于洗脱液性质和组成的改变来提高分辨率，一般只使用一种缓冲液。洗脱液另一个的目的是为了消除组分与固定相的吸附等作用。一般来说，洗脱液的选择只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为

51、了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。 生物化学大实验5. 加样量加样量加样量也会对实验结果产生影响。加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，实验效率低。一般来说，加样量越少，或加样体积越小，分辨率越高。凝胶柱较大，加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般组分分离时加样体积约为凝胶柱床体积的15左右，而组别分离时约为凝胶柱床体积的1025。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分

52、开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。 生物化学大实验6. 洗脱速度洗脱速度若要维持凝胶柱的稳定及获得好的层析效果，需要一个恒定且合适的洗脱速度。一般可以使用恒流泵（蠕动泵）来保持洗脱速度恒定。但影响洗脱速度的因素很多，例如柱子的长度、凝胶的型号、凝胶的粒度等。一般来讲，柱子越长、凝胶的型号越小、粒度越小，洗脱速度越慢。洗脱速度慢是一柄双刃剑，它既可以使一些样品在两相中有充分的时间平衡，分离效果好，又可能造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长。因此，实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是210 cm /

53、hr。 生物化学大实验总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验情况来选择。而且各种选择都有一个限度的问题，超过这个限度可能会产生相反的效果。特别要注意的是各种条件之间的协调和配合后的综合效果。另外需要提的一点是，实验时应尽可能的参考相关实验和文献以及进行预实验，以优化最佳的实验条件。 生物化学大实验4.2.4 凝胶层析的应用凝胶层析的应用 凝胶层析在不仅在生物化学实验中，在生物学其他领域也占据重要的地位。使用非常的广泛、普遍。下面我们简单介绍几个方面的应用。 1. 生物大分子的纯化生物大分子的纯化 凝胶层析的最主要应用应该就是对生物大

54、分子进行纯化。它是依据混合样品中各组分的相对分子量的不同来进行分离的，有不改变样品生物学活性的优点，而且操作简单，这使得凝胶层析成为分离纯化生物大分子不可缺少的重要手段。它也是唯一通过分子质量差异进行分离的技术。另外，他还可以将相对分子质量相近，分子结构和形状相似的化合物与其他分子分开。 生物化学大实验2. 分子量测定分子量测定 凝胶层析用于分子量的测定是一种常用的手段。具体的方法是：将已知分子质量的系列混合标准品在同一凝胶柱、同一条件下进行层析，获得混合标准品中每一个组分的洗脱体积，然后将每一个组分的洗脱体积对其相对分子质量的对数作图，获得标准曲线。在同样的条件下将未知分子量的待测样品进行上

55、述凝胶层析，得到它的洗脱体积，用该体积在标准曲线上查得未知样品的相对分子质量的对数值，从而进一步计算出该未知样品的相对分子质量。用此法测定分子量可能会受到分子形状的影响，结果会产生一定的偏差。如果先前知道待测样品的形状，在选取标准品的时候，应与其形状保持一致，即未知样品是球形分子就选择球形分子作为标准品，未知样品是线形分子就选择线形分子作为标准品，这样产生的误差相对小一些。 生物化学大实验3. 脱盐及去除小分子杂质脱盐及去除小分子杂质 在生物大分子的分离纯化时，常常用盐析等方法获取，因此样品中含有大量的盐或其他小分子。利用凝胶层析法脱盐与用透析法脱盐相比，它有快捷，不造成样品较大的稀释，生物分

56、子不易变性等优点。一般常用的是Sephadex G-25等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵。 生物化学大实验4. 去热源物质去热源物质 热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。一般在制备水解蛋白、核苷酸、和酶注射液时，常含有此类热源物质，凝胶层析是一种简单而有效的去除方法。5. 溶液的浓缩溶液的浓缩利用凝胶颗粒强烈的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩也是有效的。其作用基本类似于聚乙二醇的脱水作用，这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值。 生物化学大实验