南农生物技术制药第二章基因工程药物课件

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1、第二章基因工程与药物蛋白生产Genetic Engineering in Medicine and Industry 1南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物Some therapeutic products for used in humans2南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物Genentech 公司公司1976年，年，27岁的风险投资人岁的风险投资人Robert Swanson与与University of California的教授的教授Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业

2、前景。讨论结束时，他们工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为决定建立一个公司，并取名为Genentech（Genetic Engineering Technology）。）。第一个基因工程公司在学术界和商业界第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！的满腹怀疑中诞生了！3南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物Genentech的骄人业绩的骄人业绩1976Genentech创立创立1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因克隆了人胰岛素基因1979克隆了人生长

3、激素素基因克隆了人生长激素素基因1980公司上市，募集公司上市，募集$ 35million1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）公司）1984第一个第一个VIII因子，转让给因子，转让给Cutter Biological1985第一个自己生产的产品（人生长激素）第一个自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（生产组织纤溶酶原激活剂（tPA）1990生产生产interferon 1 1990与瑞士与瑞士Roche医药公司合并（医药公司合并（$ 2.1billion）4南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药

4、第二章基因工程药物药物美国已批准上市的基因工程药物（美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）中文名称中文名称中文名称中文名称商品名称商品名称商品名称商品名称英文名缩写英文名缩写英文名缩写英文名缩写开发公司开发公司开发公司开发公司胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素Humulin Humulin Humulin Humulin Novolin Novolin Novolin Novolin HumalogHumalogHumalogHumalogInsulin Insulin Insulin Insulin lispoinsulinlispoinsulinlispoinsulinlispoinsulin

5、Lilly Lilly Lilly Lilly Novo Nordisk Novo Nordisk Novo Nordisk Novo Nordisk LillyLillyLillyLilly人生长激素人生长激素人生长激素人生长激素Protropin Protropin Protropin Protropin Humatrope Humatrope Humatrope Humatrope NutropinAQNutropinAQNutropinAQNutropinAQrhuGHrhuGHrhuGHrhuGHGenentech Genentech Genentech Genentech Lill

6、y Lilly Lilly Lilly GenentechGenentechGenentechGenentech干扰素干扰素干扰素干扰素IntronA IntronA IntronA IntronA ReferonA ReferonA ReferonA ReferonA Avonix Avonix Avonix Avonix Betaseron Betaseron Betaseron Betaseron Actimmune Actimmune Actimmune Actimmune Alferon-NAlferon-NAlferon-NAlferon-NrhuIFNa2b rhuIFNa2b

7、rhuIFNa2b rhuIFNa2b rhuIFNa2a rhuIFNa2a rhuIFNa2a rhuIFNa2a rhuIFNrhuIFNrhuIFNrhuIFN rhuIFNrhuIFNrhuIFNrhuIFN 1b 1b 1b 1b rhuIFNrhuIFNrhuIFNrhuIFN 1b 1b 1b 1b rhuIFNa3rhuIFNa3rhuIFNa3rhuIFNa3Schering Schering Schering Schering Roche Roche Roche Roche Biogen Biogen Biogen Biogen Chiron Chiron Chiron

8、Chiron Genentech Genentech Genentech Genentech Interferon Interferon Interferon Interferon ScienceScienceScienceScience5南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物白细胞介素白细胞介素白细胞介素白细胞介素2 2 2 2ProleukinProleukinProleukinProleukinrhuIL2rhuIL2rhuIL2rhuIL2ChironChironChironChiron粒细胞集落刺粒细胞集落刺粒细胞集落刺粒细胞集落刺激因子激因子激因子激因

9、子NeupogenNeupogenNeupogenNeupogenrhuG-CSFrhuG-CSFrhuG-CSFrhuG-CSFAmgenAmgenAmgenAmgen粒细胞巨噬细胞粒细胞巨噬细胞粒细胞巨噬细胞粒细胞巨噬细胞集落刺激因子集落刺激因子集落刺激因子集落刺激因子LeukineLeukineLeukineLeukinerhuGM-GSFrhuGM-GSFrhuGM-GSFrhuGM-GSFImmunexImmunexImmunexImmunex红细胞生成素红细胞生成素红细胞生成素红细胞生成素Epogen Epogen Epogen Epogen ProcritProcritProcr

10、itProcritrhuEPO rhuEPO rhuEPO rhuEPO Amgen Amgen Amgen Amgen OrthoOrthoOrthoOrtho组织溶纤原激组织溶纤原激组织溶纤原激组织溶纤原激活剂活剂活剂活剂ActivaseActivaseActivaseActivaserhuTPArhuTPArhuTPArhuTPAGenentechGenentechGenentechGenentech生长激素生长激素生长激素生长激素SerostinSerostinSerostinSerostinsomatotropinsomatotropinsomatotropinsomatotropi

11、n SeronoSeronoSeronoSerono促生长素促生长素促生长素促生长素Nutropin Nutropin Nutropin Nutropin Saizen Saizen Saizen Saizen Genotropin Genotropin Genotropin Genotropin Norditropin Norditropin Norditropin Norditropin Bio-TropinBio-TropinBio-TropinBio-TropinsomatopinsomatopinsomatopinsomatopinGenentech Genentech Genent

12、ech Genentech Serono Serono Serono Serono Pharma/Upjohn Pharma/Upjohn Pharma/Upjohn Pharma/Upjohn Novo Nordisk Novo Nordisk Novo Nordisk Novo Nordisk Biotech GeneralBiotech GeneralBiotech GeneralBiotech General6南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物抗血友病因子抗血友病因子抗血友病因子抗血友病因子VIIIVIIIVIIIVIIIKogenate Kogena

13、te Kogenate Kogenate RecombinateRecombinateRecombinateRecombinateFactor VIIIFactor VIIIFactor VIIIFactor VIIIBayer Bayer Bayer Bayer BaxterBaxterBaxterBaxter葡萄脑苷脂酶葡萄脑苷脂酶葡萄脑苷脂酶葡萄脑苷脂酶CerezymeCerezymeCerezymeCerezymeglucocerebroglucocerebroglucocerebroglucocerebrosidasesidasesidasesidaseGenzymlGenzymlG

14、enzymlGenzyml脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸酶酶酶酶PulmozymePulmozymePulmozymePulmozymedomasedomasedomasedomaseGenentechGenentechGenentechGenentech乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗RecombivaxHB RecombivaxHB RecombivaxHB RecombivaxHB Engerix B Engerix B Engerix B Engerix B ComraxComraxComraxComraxHepatitis B Hepatitis B

15、 Hepatitis B Hepatitis B vaccinevaccinevaccinevaccineMerck Merck Merck Merck Smith Kline Smith Kline Smith Kline Smith Kline MerckMerckMerckMerck甲型肝炎疫苗甲型肝炎疫苗甲型肝炎疫苗甲型肝炎疫苗HavrixHavrixHavrixHavrixHepatitis B Hepatitis B Hepatitis B Hepatitis B vaccinevaccinevaccinevaccineSmith KlineSmith KlineSmith Kli

16、neSmith Kline7南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物体内用体内用体内用体内用单克隆单克隆单克隆单克隆抗体抗体抗体抗体Reopro Reopro Reopro Reopro Ortho OKT-3 Ortho OKT-3 Ortho OKT-3 Ortho OKT-3 Onco Scint CR/OV Onco Scint CR/OV Onco Scint CR/OV Onco Scint CR/OV Onco Scint OC103 Onco Scint OC103 Onco Scint OC103 Onco Scint OC103 Onco Sci

17、nt CR103 Onco Scint CR103 Onco Scint CR103 Onco Scint CR103 ProstascintProstascintProstascintProstascintMAB,blood clots MAB,blood clots MAB,blood clots MAB,blood clots MAB,Kidney sup MAB,Kidney sup MAB,Kidney sup MAB,Kidney sup MAB,diag injectMAB,diag injectMAB,diag injectMAB,diag injectCentocor Cen

18、tocor Centocor Centocor Ortho Biotech Ortho Biotech Ortho Biotech Ortho Biotech Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen CytogenCytogenCytogenCytogen鼠单克鼠单克鼠单克鼠单克隆抗体隆抗体隆抗体隆抗体PanorexPanorexPanorexPanorexMurine MABMurine MABMurine MABMurine MABGlax

19、o WelcomeGlaxo WelcomeGlaxo WelcomeGlaxo Welcome18南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物中国已经批准上市的基因工程药物（中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）药品名缩写药品名缩写药品名缩写药品名缩写开发生产公司开发生产公司开发生产公司开发生产公司批准时间批准时间批准时间批准时间 适应症适应症适应症适应症rhuINFa1b(rhuINFa1b(rhuINFa1b(rhuINFa1b(外用）外用）外用）外用） rhuINFa1b rhuINFa1b rhuINFa1b rhuINFa1b rhuINFa2arh

20、uINFa2arhuINFa2arhuINFa2a长春生研所长春生研所长春生研所长春生研所 上海生研所上海生研所上海生研所上海生研所 深圳兴科深圳兴科深圳兴科深圳兴科 长春生研所长春生研所长春生研所长春生研所 长生药业长生药业长生药业长生药业 三生药业三生药业三生药业三生药业1989198919891989试试试试 1996199619961996正正正正 1996199619961996正正正正 1996199619961996正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正病毒性角膜炎病毒性角膜炎病毒性角膜炎病毒性角膜炎 HBV,HCV HBV,

21、HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV 尖锐湿疣，疱疹等尖锐湿疣，疱疹等尖锐湿疣，疱疹等尖锐湿疣，疱疹等 HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVrhuIFNa2brhuIFNa2brhuIFNa2brhuIFNa2b新大洲药业新大洲药业新大洲药业新大洲药业 里亚哈尔里亚哈尔里亚哈尔里亚哈尔 华立达华立达华立达华立达 安科安科安科安科 华新华新华新华新1997199719971997正正正正 1996199619961996正正正正 199719971

22、9971997正正正正 1997199719971997试试试试1997199719971997试试试试HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCV9南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物rhuINFrhuINFrhuINFrhuINF 上海生研所上海生研所上海生研所上海生研所 克隆克隆克隆克隆 丽珠

23、生物工程丽珠生物工程丽珠生物工程丽珠生物工程1994199419941994试试试试 1995199519951995试试试试 1995199519951995试试试试类风湿类风湿类风湿类风湿 类风湿类风湿类风湿类风湿 类风湿类风湿类风湿类风湿rhuIL2rhuIL2rhuIL2rhuIL2长春生研所长春生研所长春生研所长春生研所 长春药业长春药业长春药业长春药业 四环制药四环制药四环制药四环制药 华新华新华新华新 三生药业三生药业三生药业三生药业 深圳兴科深圳兴科深圳兴科深圳兴科 中华合通中华合通中华合通中华合通 金丝利金丝利金丝利金丝利 康利制药康利制药康利制药康利制药1997199719

24、971997正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正 1995199519951995试试试试 1995199519951995试试试试 1995199519951995试试试试癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅

25、助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗10南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物rhuG-CSFrhuG-CSFrhuG-CSFrhuG-CSF九源九源九源九源1997199719971997试试试试化疗生白血病化疗生白血病化疗生白血病化疗生白血病rhuGM-CSFrhuGM-CSFrhuGM-CSFrhuGM-CSF特宝特宝特宝特宝1997199719971997试试试试化疗生白血病化疗生白血病化疗生白血病化疗生白血病rSKrSKrSKrSK医大实业医大实业医大实业医大

26、实业1996199619961996试试试试心梗溶栓心梗溶栓心梗溶栓心梗溶栓rhuEPOrhuEPOrhuEPOrhuEPO华欣华欣华欣华欣 永铭维沃永铭维沃永铭维沃永铭维沃1997199719971997试试试试 1997199719971997试试试试再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血 再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血bFGFbFGFbFGFbFGF（外用）（外用）（外用）（外用）珠海东大珠海东大珠海东大珠海东大1996199619961996试试试试创伤，烧伤创伤，烧伤创伤，烧伤创伤，烧伤11南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二

27、章基因工程药物药物一、基因工程与医药卫生一、基因工程与医药卫生1、生产基因工程药品（1 1）传统的某些药品（如动物激素）生产：）传统的某些药品（如动物激素）生产：控制某种物控制某种物质合成基因质合成基因转基因转基因“工程菌工程菌”基因工基因工程药品程药品基因表基因表达产物达产物基因工程基因工程发酵分离提取从动物组织中提取，生产量小，价格昂贵。（3 3）基因工程生产的药品）基因工程生产的药品重组人生长激素重组人白细胞介素 重组人干扰素 重组人胰岛素发酵罐（2 2）基因工程方法生产药品的方法：）基因工程方法生产药品的方法：12南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物13

28、13南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物二、基因工程菌大肠杆菌表达系统二、基因工程菌大肠杆菌表达系统一：大肠杆菌表达外源基因的优势一：大肠杆菌表达外源基因的优势二二 大肠杆菌表达载体的基本组成大肠杆菌表达载体的基本组成三三 常用的大肠杆菌表达载体常用的大肠杆菌表达载体四四 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达五五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题大肠杆菌表达真核基因存在的问题六六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制七七. 人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法14南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基

29、因工程药物药物一：大肠杆菌表达外源基因的优势l全基因组测序 , 共有4405个开放型阅读框架l基因克隆表达系统成熟l繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定l被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势l缺乏对真核生物蛋白质的复性功能l缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统l内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白l细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)periplasmheterogous15南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物二 大肠杆菌表达载体的基本组成一个良好的大肠杆菌表达载体：l有抗菌素抗性基因l决定载体拷贝数的复制起点

30、(ori )l供外源基因插入的多克隆位点。l参与控制转录与翻译的必不可少的原件外源基因在原核寄主细胞中表达 , 它的编码结构必须是连续的 , 不间断的 , 处于寄主启动子有效控制下。16南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物1启动子可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件1 ) 强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10 % - 30 %以上2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平3 ) 应该是诱导型的 , 能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。Account forinducible17南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药

31、第二章基因工程药物药物b: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子,那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。2 终止子a: 如果在克隆基因编码区的3 末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子c: 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。18南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸的情况下 , 转译终止效率便会

32、得到进一步加强。19南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物3转译起始序列mRNA的5 末端之独特的结构特征 , 是决定mRNA转译起始效率的主要因素。在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起始序列。未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构initiation factorconserved sequenceuniversial20南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物4、reporter gene其编码产物可被快速测定的功能单元。l追踪某些特定的DNA结构 (重组质粒 )是否已经导入寄主细胞l同任何一种目的启动子连接

33、 , 其表达活性可作为检测启动子功能的依据。usage半乳糖苷酶基因lacZ 、碱性磷酸酶基因、荧光素酶基因 (luciferase )基因、半乳糖激酶基因(galK )氯霉素抗性(乙酰转移酶)基因 (cat )四环素抗性基因 (tetr )alkaline phosphatase21南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物三 常用的大肠杆菌表达载体启动子广泛使用的大多数质粒表达载体启动子l噬菌体的PL启动子l大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子l色氨酸操纵子trp启动子lpBR322质粒的beta内酰胺酶启动子Lactose Operon22南农生物技术制药第二章基因工

34、程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图1-1 在大肠杆菌中基因表达的3个重要信号启动子核糖体结合位点基因终止子DNARNA转录核糖体结合mRNA位点23南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图图1-2 基因转录起始位点上游序列的比较基因转录起始位点上游序列的比较TTGACATATAATPuPy-35区区-30-70正调控区正调控区-20负调控区负调控区+1-10区区GC区区.CAAT区区TATAAA T PuAPy-40-110+1-20-30增强子增强子CCGCCC或或GGGCGG或或GGCCAATCT T A原核原核真核真核24南农生物技术制药第二章基因工

35、程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图1-3 通过表达载体在大肠杆菌中被表达PRTTPRTPRmRNA蛋白质表达载体外源基因将外源基因插入限制性酶切位点转化大肠杆菌25南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图1-4 杂交基因的构建和融合蛋白的合成PRTPRT插入外源基因ATATTA正确融合N端C端不正确融合外源基因不被翻译表达ATATTAGGAGCTGGAGC融合蛋白亲和层析法纯化化学试剂除去大肠杆菌肽段26南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图图1-5 1-5 在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题在大肠杆菌中表达外源基因长遇到

36、的问题翻译转录PRTT转录大肠杆菌不能切除内含子转录提前终止27南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图1-6 真核细胞表达载体常用的4种启动子P半乳糖转录GAL10P甲醇转录乙醇氧化酶基因（a）GAL启动子（b）AOX启动子（c）葡萄糖水解酶启动子（d）纤维二糖水解酶启动子P纤维素转录纤维素二糖水解酶基因P淀粉转录葡萄糖淀粉酶基因木糖不转录28南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物四真核基因在大肠杆菌中的表达三种表达部位各有不同的优缺点/而且对克隆基因表达产物的制备有很大关系。l在细胞质中表达l在细胞周质中表达l以分泌到细胞外的形式

37、表达。1外源基因在大肠杆菌中表达蛋白质位置cytoplasmperiplasm29南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物1 ) 细胞质中表达 expressed in cytoplasm包含体是存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构。在表达中应尽可能限制包含体产生, 并促进形成天然三维结构的蛋白质。多采用与分子伴侣共表达的方法, 可能是增加外源蛋白的可溶性和折叠能力的一种有效途径。insolublechaperon30南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物周质 : 指大肠杆菌一类G-菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结

38、构部分。 在大肠杆菌中 , 已成功的使用了各种不同类型信号肽 ,将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。周质中表达外源蛋白质优点:A : 周质中蛋白质种类少 , 周质中表达的外源蛋白质能够被有效的浓缩和纯化。b: 周质氧化环境有利于蛋白质按正确的方式折叠c: 在周质中蛋白质降解不广泛。来自原核、真核的外源基因都成功的在大肠杆菌细胞周质中实现了有效表达。2 ) 周质中表达周质中表达 expressed in periplasm31南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物3) 分泌表达 使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌到胞外培养基中进行分离纯化 , 这种研究思路称为外源蛋白

39、质的分泌表达。32南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物l目的蛋白稳定性高:l目的蛋白易于分离l目的蛋白末端完整将外源基因与大肠杆菌信号肽编码序列重组在一起进行分泌表达 , 其N端的甲硫氨酸残基可在信号肽剪切过程中被有效除去这些真核基因在大肠杆菌中表达时 , 蛋白质甲硫氨酸残基往往不能被切除。分泌表达优点 :重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中 , 其稳定性大约是在细胞质中的10倍许多真核生物成熟蛋白N端不含有甲硫氨酸残基。intactexcise33南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达;外

40、源基因分泌表达的表达率通常要比包涵体形式低很多分泌表达缺点 相对其它生物细胞 , 大肠杆菌蛋白分泌机制不健全。目前产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌工程菌很少Perfectsound34南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物l分泌型重组蛋白具有较高比例正确构象，l对蛋白酶不敏感蛋白质的分泌机制原核细胞周质中有多种分子伴侣 ,可阻止分泌蛋白随机折叠l分泌至细胞周质或培养基中l重组蛋白很少形成分子间二硫键与包涵体相比randomSulferinnerouter35南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物重组大肠杆菌 -目的蛋白完全分泌分泌型

41、目的蛋白表达系统构建有些G- 能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中 , 这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白 , 它激活定位于内膜上的磷酸酯酶 , 导致细菌内外膜的通透性增大。将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化受体细胞完全分泌型受体细胞转化permeabilitybacteriocin36南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物二种类型 l由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节序列构成。用于研究启动子功能及调控作用分子机理。l由一种异源蛋白质基因编码序列同寄主细胞诱导型启动子构成。用于生产新型

42、融和蛋白。2 融和蛋白质表达将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起 , 并作为一个开放型阅读框架进行表达。这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。 2.1 融和基因融和基因37南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物attention外源基因应装在受体蛋白编码基因下游 , 为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下 , 并不需要完整的受体结构基因2.2 融和蛋白的表达策略融合蛋白表达质粒的构建原则 受体细胞的结构基因能高效表达 , 且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要 , 它直接决定融合蛋白的裂解。两个蛋白编码

43、序列应保持一致的翻译阅读框架在DNA水平上，人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点 , 可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白Base onconsistent38南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物l使克隆外源基因有效转译 有效转译：取决于核糖体的结合位点 , 受到编码区起点核苷酸序列影响。l可使蛋白质产物稳定 , 免受寄主胞内酶的降解作用 ,因此可以得到较高的产率。l可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白质分配到细胞的正确位置。l能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白。2.3 表达融合蛋白质的优点ribosome39南农生物技术制药第二章基

44、因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物3 3 整合型异源蛋白的表达l工程菌在没有选择压力存在下 ,可以连续培养而不丢失目的基因表达盒, 这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程特别有意义3.1 3.1 整合形式表达目的蛋白的特点u目的基因稳定表达 u目的基因表达率低l整合型的目的基因随受体细胞染色体DNADNA一起复制, 在大多数情况下相当稳定 单拷贝整合的目的基因表达率受到限制 , 此时可通过强化表达元件加以补偿 replicate/ stabilitySpecies/ improvementintensify40南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物转位因

45、子依赖型的体内重组同源序列依赖型的体内重组3.2 DNA体内重组的基本原理41南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子 , 不同生物种群拥有结构不同的转位因子噬菌体 G片段 (G-Fragment )原核微生物 插入顺序 (IS ) 真核微生物 转座子 (Tn、Ty ) 高等植物 可移动因子 (Ac、Ds ) 高等动物 跳跃基因 (mobile gene )转位因子 transposon转位因子依赖型的体内重组42南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物转位因子的结构transposon

46、palindromerepressorinversion region43南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物整合形式44南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物 同源整合同源序列依赖型的体内重组同源整合一般地说 , 距离越远、长度越长、同源性越高 , 重组的频率也就越高 , 反之亦然。同源整合同源整合45南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物1基因结构存在很大差异。大多数真核基因含有内含子，细菌细胞中没有除去内含子机制；五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题2 转录信号不同。真核基因转录的mRNA分子不具有

47、结合细菌核糖体所必须的SD序列。细菌RNA聚合酶不能识别真核生物启动子3 mRNA的分子结构有所差异。绝大多数真核mRNA分子的3 末端有poly(A)尾巴 ，在5 末端有一个帽结构。影响mRNA在细菌中的稳定性及与细菌核糖体相结合的能力， 阻止正常的转录和转译。4真核生物的蛋白质 -有些是通过前体分子加工来的。在细菌中不存在这种修饰作用。5细菌的蛋白酶 -可以识别和降解真核生物的蛋白质产物46南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物l结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰 ，导致其表观生物学功能的丧失六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制1 工程

48、菌遗传不稳定性表现形式基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳性 , 具有下列两种表现形式 l分配不稳定性整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸segregative instabilitydomainDeletionregionrearrange47南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物l受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解2 工程菌遗传不稳定性的产生机制l外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应 ， 关闭合成途径 ，启动降解l重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 是重组

49、质粒逃逸的基本原因l受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排Deletion48南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物l以构建稳定性高质粒: 将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中: 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞3 改进载体、受体系统l正确设置载体上的多克隆位点: 禁止DNA片段插在稳定区内l将受体细胞的致死性基因安装在载体上，并构建条件致 死性的相应受体系统 。 eg:大肠杆菌的ssb基因 (DNA单链结合蛋白编码基因)49南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物根据载体上的抗药性标记 , 向

50、培养系统中添加相应的抗生素(药物和食品生产时禁止使用抗生素)4 施加选择压力根据载体上的营养缺陷型标记 , 向培养系统中添加相应的营养组份(培养基复杂 , 成本较高)correspond50南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物l使用可控型启动子控制目的基因定时表达及表达程度5 控制目的基因过量表达l使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数(优化基因工程菌的培养工艺)l培养基组成 : 限制培养基比丰富培养基更有利于稳定l培养温度 : 较低培养温度有利于重组质粒的稳定replicon51南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物

51、1982年 , 美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素 , 成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年 , Novo公司 , 成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年 , Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。七. 人胰岛素的生产方法基因工程法生产人胰岛素l体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别l具有无免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。potentialimmunogenic52南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工

52、程药物药物SHSHSHSHC C C C COO_SHSH N C CS.S.Pre-pro-insulinSSSSC C C C COO_SSC CS-SPro-insulin NSSSSC C C C COO_C CS SS-SinsulinN53南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物基因工程菌的构建战略：化学合成A链和B链的编码序列表达重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链分别表达法1synthesis54南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物55南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物由于A链

53、和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低 , 通常只有10% - 20%.采用这条工艺路线生产正确配对率较低 , 采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。A链和B链分别表达法生产技术评价为了进一步降低生产成本 , 美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线56南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物基因工程菌的构建战略 人胰岛素原表达法proinsulin57南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物表达产物后处理路线 B链中第22位上的Arg和第29位上的Lys , 由于良

54、好折叠的原因 , 对胰蛋白酶不敏感58南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物在人胰岛素原表达工艺中 , 由于C肽的存在 , 胰岛素原能形成良好的空间构象 , 三对二硫键的正确配对率也相应提高 , 折叠率高达80%以上。生产技术的评价目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。虽然这条工艺路线不比AB链分别表达法更为简捷 , 而且还要使用两种高纯度的酶制剂 , 但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷 , 使得每克最终产品的成本仅50美元。59南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物60南农生物技术制药第二章基因

55、工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物 一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与beta-內酰胺酶基因拼接 , beta-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。 获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性 , 为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。分泌型重组人胰岛素表达法上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌beta -半乳糖苷酶基因拼接的方法 , 所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强 , 但不能分泌 , 只要以包涵体的形式存在于胞质中。61南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物什

56、么叫蛋白质工程什么叫蛋白质工程 指指通通过过改改造造与与蛋蛋白白质质相相应应的的基基因因中中的的碱碱基基顺顺序序，或或设设计计合合成成新新的的基基因因，将将它它克克隆隆至至受受体体细细胞胞中中，通通过过基基因因表表达达而而获得具有新的特性的蛋白质（酶）技术。获得具有新的特性的蛋白质（酶）技术。 这这是是一一门门从从改改变变基基因因入入手手，定定做做新新的的蛋蛋白白质质的的技技术术。故故有有人人将将其其称称为为“第第二二代基因工程代基因工程” 1983年年，美美国国生生物物学学家家额额尔尔默默首首先先提提出了出了“蛋白质工程蛋白质工程”的概念。的概念。蛋白质工程和基因工程蛋白质类药物蛋白质工程和

57、基因工程蛋白质类药物 62南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物 1、蛋白质工程的理论设计：蛋白质工程的理论设计： 包括活性设计、专一性设计、框架（构象）设计等。包括活性设计、专一性设计、框架（构象）设计等。 由于对蛋白质的结构与功能之间的关系认识还不系统，由于对蛋白质的结构与功能之间的关系认识还不系统，目前的蛋白质设计仅仅是对天然蛋白质的修饰。目前的蛋白质设计仅仅是对天然蛋白质的修饰。 如：异常血红蛋白的氨基酸取代如：异常血红蛋白的氨基酸取代 去羧基端胰岛素等。去羧基端胰岛素等。蛋白质工程的一般技术蛋白质工程的一般技术u根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的

58、蛋白质；根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；u确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；u从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质。成具有特定生物功能的全新蛋白质。63南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物2、基因修饰、基因修饰点突变法点突变法 蛋白质结构的改变通过基因修饰来完成蛋白质结构的改变通过基因修饰来完成基因修饰的方法：基因修饰的方法：基因的全化学合成基因的全化学合成 按照所需蛋白质的氨基酸顺序，

59、先后合成结构基因、转按照所需蛋白质的氨基酸顺序，先后合成结构基因、转录的起始信号及终止信号、限制酶切位点等核酸片段，然录的起始信号及终止信号、限制酶切位点等核酸片段，然后用连接酶将各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌后用连接酶将各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌中进行目标蛋白质的表达。中进行目标蛋白质的表达。 目前用此法已合成了：人血细胞干扰素、胰岛素、生长目前用此法已合成了：人血细胞干扰素、胰岛素、生长激素释放抑制激素等基因。激素释放抑制激素等基因。64南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物调节基因启动基因结构基因终止基因连接酶连接酶完整基因65南农生物技

60、术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物基因直接修饰法基因直接修饰法 将连接于质粒上的某一蛋白质的基因用酶法去除一小段，将连接于质粒上的某一蛋白质的基因用酶法去除一小段，然后用合成的核苷酸片段接上，从而获得新的突变体。然后用合成的核苷酸片段接上，从而获得新的突变体。 已修饰过的酶有：已修饰过的酶有： 内酰胺酶、酪氨酰内酰胺酶、酪氨酰tRNA合成酶、二氢叶酸还原酶等酶蛋白。合成酶、二氢叶酸还原酶等酶蛋白。66南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物限制性内切酶限制性内切酶外源外源DNA限制性内切酶限制性内切酶退火退火重组质粒重组质粒转化转化受体细胞受

61、体细胞筛选筛选表达表达带重组体的细胞带重组体的细胞目的产物目的产物质粒质粒目的基因目的基因酶切割蛋白基因蛋白基因核苷酸片段核苷酸片段新突变质粒新突变质粒67南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物盒式突变盒式突变 1985年年Wells提出的一种基因修饰技术，一次可以在一提出的一种基因修饰技术，一次可以在一个位点上产生个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行子中重要氨基酸进行“饱和性饱和性”分析。分析。蛋白质工程的运用蛋白质或肽类药物的改造和新药的研制蛋白质或肽类药物的改造和新药的研制蛋白质或肽类药物

62、的改造和新药的研制蛋白质或肽类药物的改造和新药的研制68南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物酶切割蛋白基因蛋白基因核苷酸片段核苷酸片段新突变质粒新突变质粒同时获得多个突变体同时获得多个突变体69南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图图3-13-1胰岛素的分子结构和从前胰岛素原合成胰岛素的简要过程胰岛素的分子结构和从前胰岛素原合成胰岛素的简要过程30个氨基酸B链21个氨基酸A链胰岛素利于重组生产的特点前导序列BCA前胰岛素原（胰岛素原=BCA无前导序列）胰岛素SSSSBA剪切-S-S-S-S-LBAC自发折叠蛋白质工程的应用70南农

63、生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图图3-2 3-2 由人工合成的由人工合成的A,BA,B链的基因合成重组胰岛素链的基因合成重组胰岛素lac启动子lacZA基因运载人工合成的A基因的 载体B基因运载人工合成的B基因的 载体(a)人工合成的基因(b)合成胰岛素蛋白ABmet-半乳糖苷酶片段A链胰岛素纯化A链和B链二硫键连接metB链溴化氰处理pBR322pBR322转化的大肠杆菌合成AB融合蛋白71南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图图3-33-3重组促生长素抑制素的合成重组促生长素抑制素的合成lac启动子lacZ人工促生长素抑制素

64、基因met-半乳糖苷酶片段促生长素抑制素融合蛋白转化大肠杆菌促生长素抑制素（14氨基酸）溴化氰72南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图图3-43-4重组生长素的合成重组生长素的合成密码子01911912424024Hae保留除去（a）生长素cDNA片段的准备过程（b）表达024合成前导序列191cDNAlac启动子插入表达载体合成生长素转化大肠杆菌73南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图图3-5 3-5 凝血因子凝血因子基因及其翻译产物基因及其翻译产物外显子（26）内含子（25）（a）凝血因子基因（b）凝血因子的翻译后的加工初

65、级翻译产物（2351个氨基酸）ABCAC成熟的凝血因子蛋白加工74南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物重组凝血因子合成的几种方法在哺乳动物细胞中合成（仓鼠细胞）利用活体动物生产（猪）利用表达载体Ag启动子SV40聚腺甘酸化序列凝血因子的cDNA导入仓鼠细胞重组蛋白75南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物干扰素的合成干扰素的合成干扰素分子结构干扰素分子结构干扰素分子结构干扰素分子结构干扰素生产车间干扰素生产车间干扰素生产车间干扰素生产车间76南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图图3-7 3-7 利用

66、分离的病毒壳体蛋白作疫苗的原理利用分离的病毒壳体蛋白作疫苗的原理分离的病毒壳体蛋白壳体蛋白的特异抗体注射到血液循环抗体包围整个病毒被完整病毒感染77南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物图图3-8 3-8 重组牛痘病毒可能用途的基本原理重组牛痘病毒可能用途的基本原理乙型肝炎表面抗原基因牛痘病毒启动子重组牛痘病毒基因组牛痘病毒乙型肝炎病毒抗乙型肝炎抗体抗牛痘病毒抗体注射重组牛痘病毒颗粒到血液循环免疫系统合成抗牛痘病毒和乙型肝炎病毒的抗体78南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物表3-2 在重组牛痘病毒中表达的外源基因 基基 因因恶性疟原

67、虫表面抗原恶性疟原虫表面抗原流行性感冒病毒衣壳蛋白流行性感冒病毒衣壳蛋白狂犬病病毒狂犬病病毒G G蛋白蛋白乙型肝炎主要表面抗原乙型肝炎主要表面抗原单纯疱疹糖蛋白单纯疱疹糖蛋白人类免疫缺陷病毒（人类免疫缺陷病毒（HIVHIV）表面蛋白）表面蛋白水泡性口炎衣壳蛋白水泡性口炎衣壳蛋白仙台病毒蛋白仙台病毒蛋白BACKBACK79南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物（ inclusion bodies IBs)基因工程包含体的纯化基因工程包含体的纯化基因工程菌培养液不同表达形式的前处理基因工程菌培养液不同表达形式的前处理(胞外分泌型表达：离心胞外分泌型表达：离心, ,收集

68、液相收集液相浓缩浓缩纯化。纯化。(胞内表达：胞内表达：l胞内可溶性表达：离心胞内可溶性表达：离心, ,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心，离心，收集上清收集上清纯化纯化l胞内周质表达：离心胞内周质表达：离心, ,收集菌体收集菌体低浓度溶菌酶或渗透低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物压冲击等溶解目标物离心离心, ,收集上清液收集上清液纯化。纯化。l不溶性包涵体：离心不溶性包涵体：离心, ,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心离心, ,收集收集沉淀沉淀包涵体洗涤包涵体洗涤目标蛋白变性溶解目标蛋白变性溶解复性复性纯化。纯化。80南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物外

69、源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白蛋白产物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白外源蛋白的积累外源蛋白的积累人胰岛素人胰岛素50%50%形成包涵体形成包涵体 - -丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在细胞间区在细胞间区- -人体干扰素人体干扰素25%25%形成包涵体形成包涵体凝乳酶原凝乳酶原形成包涵体形成包涵体牛生长激素牛生长激素30%30%形成包涵体形成包涵体 - -内酰胺酶内酰胺酶形成间区包涵体形成间区包涵体人胰岛素原人胰岛素原5%26%5%26%形成包涵体形成包涵体81南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物Z包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。包涵体：一种蛋

70、白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。物活性。Z包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。Z高表达产生的积聚物在细胞内部形高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？成不溶物原因？蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚

71、集沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；表达蛋白过多，与其结合表达蛋白过多，与其结合/ /诱导组分不足，不能形成溶解状态诱导组分不足，不能形成溶解状态 蛋白质自身不稳定。蛋白质自身不稳定。包含体的构成包含体的构成82南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物收集菌体细胞收集菌体细胞细胞破碎细胞破碎包涵体的洗涤包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性目标蛋白的复性包含体的出现不仅增加了包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也生物分离设

72、计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。出了新的课题。欲获得天然活性态的目标欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活标蛋白恢复应有的天然活性。性。83南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物1）包涵体的洗涤）包涵体的洗涤l细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。l洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、

73、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。子而聚集，给后步纯化带来困难。l洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。去部分膜蛋白和脂质类杂质。l洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。产物为原则。84南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物 2）目标蛋白的变性溶解）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的

74、目标蛋白必须溶解到液相中，才能包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。白质变性才能使其形成可溶性的形式。 常用变性剂：常用变性剂： 5-8 mol/L盐酸胍和盐酸胍和6-8 mol/L尿素尿素, 作用：破坏离子间相互作用；作用：破坏离子间相互作用； 表面活性剂如表面活性剂如1-2 SDS，作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。 PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、影响变性因

75、素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和、离子强度、变性剂种类和浓度。浓度。85南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物原理：原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。过程称复性。复性方法：复性方法：l稀释法除变性剂稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。加入大量水或缓冲液。l膜分离法除变性剂

76、膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。透析、超滤、电渗析。l层析法：凝胶层析，层析法：凝胶层析，高效疏水层析高效疏水层析 3） 目标蛋白的复性目标蛋白的复性86南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物 蛋白质复性影响因素：蛋白质复性影响因素：u变性剂浓度变性剂浓度u目标蛋白浓度；目标蛋白浓度；upH和离子强度；和离子强度； u氧化还原条件。氧化还原条件。 还原剂：还原剂： 二硫苏糖醇、二硫苏糖醇、-巯基乙巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；醇、还原型谷胱甘肽；氧化剂：氧化剂： 氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。碱性下通空气。 复性区复性区 多聚物生成区多聚物生成区

77、 絮凝沉淀区絮凝沉淀区盐酸胍浓度盐酸胍浓度mol/L红血球碳酐酶复性操作中变性剂红血球碳酐酶复性操作中变性剂与蛋白质浓度对复性的影响与蛋白质浓度对复性的影响蛋白质浓度蛋白质浓度 mol/L87南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在E.coliE.coli中的高密度发酵过程中以两种形式表达：中的高密度发酵过程中以两种形式表达： 细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目标蛋白的标蛋白的30%30%） 无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的7

78、0%70%）。）。 悬浮破壁悬浮破壁PBS洗涤洗涤离心离心硫铵沉淀硫铵沉淀 亲和层析亲和层析阳离子交换层析阳离子交换层析溶解溶解复性复性亲和层析亲和层析湿菌体湿菌体发酵液发酵液干净菌体干净菌体上清液上清液包涵体包涵体纯品纯品活性检测活性检测破壁液破壁液离心离心离心液离心液洗涤洗涤举例：举例：TRAIL的分离纯化的分离纯化88南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物1. 1. 包涵体的洗涤包涵体的洗涤 粗制包涵体用粗制包涵体用 50mM50mM磷酸盐缓冲液，含磷酸盐缓冲液，含150mM NaCl pH=7.4 150mM NaCl pH=7.4 (1:3 w/v)(1

79、:3 w/v)洗涤洗涤2-32-3次；次； 用含有用含有1M NaCl1M NaCl的磷酸缓冲液洗涤的磷酸缓冲液洗涤1 1次次 (1:3 w/v)(1:3 w/v)，将粘附其，将粘附其表面的大部分蛋白及水溶性杂质除去；表面的大部分蛋白及水溶性杂质除去； 用用6M6M尿素及尿素及0.5%TritonX-100 0.5%TritonX-100 联合洗涤联合洗涤1 1次次 (1:3 w/v)(1:3 w/v)，去，去除另一些杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达除另一些杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达80%80%左右）；左右）； 用用SDS-PAGESDS-PAGE电泳检测纯度。电泳检测纯度。 2. 2.

80、 包涵体的变性溶解包涵体的变性溶解 洗涤后包涵体用含有洗涤后包涵体用含有30mM DTT30mM DTT及及5mol/l5mol/l盐酸胍的盐酸胍的Tris Tris 缓冲缓冲液液 pH =8.0 (1:5 w/v)pH =8.0 (1:5 w/v)变性溶解变性溶解 室温搅拌室温搅拌2h2h，95%95%以上的以上的包涵体可被溶解；包涵体可被溶解； 离心，离心，13000rpm13000rpm，20min 20min 弃沉淀得到溶解液。弃沉淀得到溶解液。89南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物3. 3. 包涵体复性（间歇式流加稀释复性法）包涵体复性（间歇式流加稀

81、释复性法）l以含以含DTTDTT和和ZnSO4ZnSO4的的Tris-HClTris-HCl为复性缓冲液，再添加为复性缓冲液，再添加0.4M L-0.4M L-ArgArg，0.5M0.5M尿素，尿素，0.5M 0.5M NaClNaCl作为蛋白聚集抑制剂，作为蛋白聚集抑制剂，l变性溶解液可多次流加，每次流加的时间是以上一次流加变性溶解液可多次流加，每次流加的时间是以上一次流加蛋白已达到部分复性为准。本实验中，流加间隔时间确定为蛋白已达到部分复性为准。本实验中，流加间隔时间确定为90min90min，每次流加浓度为，每次流加浓度为150mg/L150mg/L，变性液流加次数可高达，变性液流加次

82、数可高达6 6次，次，最终浓度可达到最终浓度可达到1mg/ml1mg/ml，44缓慢搅拌一段时间，缓慢搅拌一段时间，l对对50mM 50mM Tris-HClTris-HCl，300mM 300mM NaClNaCl，0.1M0.1M尿素及尿素及0.2mM ZnSO4 0.2mM ZnSO4 混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集的蛋白，混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集的蛋白，l超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液。超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液。90南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物 5. 复性后纯化复性后纯化

83、 复性浓缩后蛋白复性浓缩后蛋白 金属亲和层析金属亲和层析 吸附吸附 洗涤：洗涤： 40mmol/L咪唑，洗除非特异性吸附的杂蛋白咪唑，洗除非特异性吸附的杂蛋白 洗脱：洗脱： 100mmol/L咪唑咪唑 目标蛋白目标蛋白 纯度达纯度达95%以上（由以上（由SDS-PAGE和和RP-HPLC鉴定）鉴定） 收率收率75%91南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）92南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物 来自发酵罐的菌体经过离心除去培养来自发酵罐的菌体经过离心除

84、去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、再添加溶菌酶、EDTAEDTA和促进剂以除去脂蛋白和和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，溶解剂为行变性溶解，溶解剂为6mol/L6mol/L盐酸胍。溶解的盐酸胍。溶解的同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键。同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后过凝胶柱

85、除去杂蛋白，再加入复性缓冲浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀用离心除去。用离心除去。包含体产物分离工艺包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）（牛生长激素分离提取）93南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物质谱在蛋白质、多肽分析中的应用 94南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物质谱在蛋白质、多肽分析中的应用质谱在蛋白质、多肽分析中的应用1分子量的测定2蛋白质、多肽纯度的鉴定3肽质量指纹谱4肽序列测定技术5蛋白质的翻译后修饰鉴定6其他蛋白质鉴定95南

86、农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物分子量的测定分子量的测定l用ESI-MS和MALDI-TOF-MS测定蛋白质和多肽的分子量，精确度可达0.10.01，这远比其它方法(如SDS-PAGE、凝胶过滤、超离心等）精确。l正确测定蛋白质的分子量，可以提供很多信息，如确定分子大小，从氨基酸组成分析的结果求得准确的氨基酸组成，验证已测定的一级结构是否正确等。96南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物分子量测定实例分子量测定实例l采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，高效凝胶过滤色谱以及电喷雾离子化质谱三种方法对新发现的一种蛋白质（来源于福建尖吻蝮蛇蛇毒,是

87、一种具有类凝血酶活性的弱酸性蛋白质）的分子量进行了测定。测定方法分子量非还原SDS-PAGE26.2kDa(二硫键未打开)还原SDS-PAGE29kDa(二硫键被还原)HPGFC24.5kDaESI-MS30298Da97南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物分子量测定实例分子量测定实例l天花粉蛋白的一级结构测定，在86年时曾出现差错，当时测定的结果表明它是由234个氨基酸残基组成，分子量为25682Da。90年，我们发现结构测定有误，重新修正了其一级结构。它应由247个氨基酸残基组成，正确分子量为27141.32Da。l93年，用MALDL-TOF-MS和ESI

88、-MS测定了天花粉的分子量。98南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物天花粉蛋白天花粉蛋白（TCSTCS）的）的MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS的分子量图谱的分子量图谱99南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物天花粉蛋白（天花粉蛋白（TCSTCS）的）的ESI-MSESI-MS的分子量图谱的分子量图谱100南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物分子量测定实例分子量测定实例l-苦瓜子蛋白的一级结构计算(包括糖部分)的分子量为29156Da，用MALDI-TOF-MS测定的分子量为29074D

89、a，二者相差82Da。这种差异可能是个别氨基酸测定的差错造成，估计整个结构测定不会有大错误。101南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物分子量测定实例分子量测定实例l-苦瓜子蛋白其C端用羧肽酶的方法测定为-S-T-A-D-E-N，但尚不能完全确定。l苦瓜子蛋白在190位有一个色氨酸，我们用BNPS-Skatole降解色氨酸，降解后的肽用HPLC分离，得到含有C端的一段小肽(59个氨基酸残基)用MALDI-TOF-MS测定其分子量为6443与计算得到的59肽的分子量为6442.9非常相符，因此也就证明了C端59个氨基酸残基的顺序是正确的。102南农生物技术制药第二章

90、基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物-苦瓜子蛋白Trp降解C端肽分子量103南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物蛋白质、多肽纯度的鉴定 l根据质谱测定分子量的作用，质谱还可用来作蛋白质、多肽纯度的鉴定。l只要质量有差异的杂质都可以被检出，此方法灵敏度高，用量少(pmol水平)、速度快，并有独到之处。104南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物蛋白质、多肽纯度的鉴定蛋白质、多肽纯度的鉴定l实例1：天花粉蛋白C-端微观不均一，即有二个C末端，一个多一个Ala(即247个氨基酸残基)，一个少一个Ala(即246个氨基酸残基)，用

91、ESI-MS完全能够分辨出来105南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物l实例2：如猪胰岛素和人胰岛素混在一起，用MALDI-TOF-MS也能够清楚地分出二个峰。两者的差异仅在猪胰岛素B链的第30位为Ala(89.09Da)，而人胰岛素相应的位置为Thr(119.12Da)，两者相差30Da（如图13-11）。这些差异用其他方法是很难检出的。106南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物蛋白质鉴定蛋白质鉴定肽质量指纹谱+基于串联质谱多肽测序蛋白质鉴定107南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物肽质量指纹谱肽

92、质量指纹谱由于各种蛋白质的氨基酸序列(一级结构)不同，蛋白质被酶解后产生的肽段序列也各异，肽混合物质量数亦具特征性，称为肽质量指纹谱(peptidemassfingerprint,PMF)，可用于蛋白质的鉴定。108南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物PMF流程109南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物肽质量指纹谱肽质量指纹谱MALDI-TOF-MS是最有效的分析肽混合物的质谱仪，肽混合物不需分离可直接分析，基质辅助激光电离方法能耐受一定浓度的盐，仪器灵敏度高，标准样品1pmol的量就足够，质量数准确度可达0.10.01，且操作简

93、单，分析速度快，依仪器型号不同一次可分析十几个到几十个样品。110南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物PMF实例l蓖麻毒素(ricin)利用MALDI-TOF生物质谱技术结合肽质量指纹谱方法，经过数据库检索，建立了鉴定检测Ricin的新方法。111南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物MALDI-TOF质谱的测定，得到Ricin的分子量为62925Da112南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物Ricin的肽质量指纹谱，共检出22条肽谱峰113南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程

94、药物药物将这些肽片段的质谱数据用MASCOT搜索引擎在SwissProt数据库中进行PMF检索，检索参数如表1所示。返回前5个检索结果，如表2所示。其中符合要求的结果(置信区间为得分大于66分)只有一种蛋白即蓖麻毒素:Ricinprecursor(P02879，RICI_RICCO)，得分107，匹配肽段13条，肽谱的实验值与理论值的对比见表3，其余未检出的肽段中有4条经过与理论值对照也找到了归属。114南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物肽序列测定技术肽序列测定技术l两种经典测序方法：DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰的问题；Edman降

95、解不能解决N端封闭的测序的问题。115南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物 蛋白梯形测序蛋白梯形测序 (proteinladdersequencing)l使用少量链终止剂，进行快速分步降解，在人为控制下产生一系列肽段，其中每个肽段于下一个之间只相差一个残基；用MALDI-TOF-MS读出肽段信息。l用此方法可在磷酸肽中定位磷酸丝氨酸残基。研究N-端封闭的肽和蛋白，必须了解其C-端序列的信息。116南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物蛋白梯形测序蛋白梯形测序 (proteinladdersequencing)117南农生物技术制药第

96、二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物肽测序一般方法（肽测序一般方法（MS/MS）l使用串联质谱，利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂。118南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物基于串联质谱的肽序列测定基于串联质谱的肽序列测定用特定蛋白水解酶作用于蛋白质，将得到的肽段送入一级质谱，产生前体离子，经过一定选择的前体离子在碰撞室发生CID。结果是前体离子肽骨架酰胺键的特异性断裂，并产生了一系列可用于确定氨基酸序列的y型和b型等离子。获得CID

97、二级质谱图后可算出肽序列。119南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物经过经过MS/MS分析的多肽片段分析的多肽片段 120南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物N端和端和C端多肽端多肽N-terminal peptidesC-terminal peptides415 486 30115457 71185332429121南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物理论质谱图理论质谱图122南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物理论质谱图与实际质谱图理论质谱图与实际质谱图123南农

98、生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物理论质谱图与实际质谱图理论质谱图与实际质谱图124南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物标准肽Glu-fib的MS/MS图谱 125南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物MS/MS优点MS/MS质谱测序可对N端封闭的肽进行测序;并可以通过CID得到部分至完全的序列信息后，做出MS肽谱，这可对修饰的氨基酸残基定性，并确证其位置，包括二硫键的分布。而且质谱技术与分离技术直接相连也可相互验证，同时还可对混合肽进行测序。另外它还有快速、灵敏的优点。126南农生物技术制药第二章基因

99、工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物基于MS/MS蛋白质鉴定l获得二级质谱图后可通过下列方法鉴定蛋白质：l较常用的肽序列标签鉴定方法（peptidesequencetag，PST：从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列，用于数据库查寻；l肽碎片离子搜索：直接用前体离子产生的未解析的CID图谱与数据库中的CID图谱比较，如Sequest、Mascot、Sonat等算法；l从头测序法（denovosequence），通过直接解释MS/MS数据识别肽序列，这类系统和算法有Lutefisk、SHERENG、PEAKS

100、、AuDeNS等。127南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物基于MS/MS的蛋白质鉴定128南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物串联质谱在蛋白质组学中的应用串联质谱在蛋白质组学中的应用129南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物测序其它方法测序其它方法l先用几种不同的蛋白水解酶对蛋白质进行酶解，胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶嗜热菌蛋白酶(thermolysin)SV8酶(staphylococcusaureusV8)l各种酶解片段用HPLC等分离得到的纯肽或简单的混合肽，可用MS/MS测定其各组分的顺序，然后从

101、不同蛋白水解酶酶解片段顺序，找到其重叠部分，即可得到整个蛋白质顺序。130南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物蛋白质的翻译后修饰鉴定蛋白质的翻译后修饰鉴定l磷酸化修饰l糖基化修饰l巯基和二硫键定位l氨基的乙酰化l泛素化修饰131南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物磷酸化修饰 l已知的磷酰氨基酸的类型有四种：1O-磷酸盐，通过羟氨酸的磷酸化形成的，如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。2N-磷酸盐，通过精氨酸，赖氨酸或组氨酸中的氨基的磷酸化形成的。3乙酰磷酸盐，通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。4S-磷酸酯，通过半胱氨酸的磷酸化形成的。132

102、南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物磷酸化肽富集磷酸化肽富集l分离技术有：双向磷酸多肽谱图(2D-PP)；高分辨率的凝胶电泳(2DE)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)。l对于32P标记的磷酸化肽或蛋白可用放射自显影或磷储屏检测，提取后可以高灵敏度MALDI-MS分析；如果32P标记不可行，就要用LC-MS/MS分析，常用HPLC与质谱联用。l常用的富集方法有：固定金属亲和色谱(IMAC)；抗体免疫沉淀；化学修饰。133南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化位点的方法位点的方

103、法 MALDI-TOF-MS可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质，与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点。原理：磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化，MALDI-TOF-MS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点。134南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物串联质谱(MS/MS)进行前体离子扫描，这一方法是通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在。原理：磷酸化肽经CID后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子”。质谱检测磷酸化肽和质谱检测磷酸化肽和 确定磷酸化位点的方法确

104、定磷酸化位点的方法135南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物l串联质谱还可进行中性丢失扫描，这种方法是用MS/MS检测经CID后发生中性丢失H3PO4(98u)的肽段。lLC-MS/MS分析磷酸化位点l傅立叶变换质谱进行电子捕获解离质谱检测磷酸化肽和质谱检测磷酸化肽和 确定磷酸化位点的方法确定磷酸化位点的方法136南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物糖基化修饰糖基化修饰蛋白质糖基化可分为4类:N-糖基化O-糖基化C-甘露糖化聚糖磷脂酰肌醇锚(GPI-anchor)糖基化137南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因

105、工程药物药物糖蛋白糖苷内切酶还原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TOF-MS糖含量相对分子质量ESI串联质谱MALDI-TOF-MS凝集素提取氨基酸序列糖基化位点糖肽片段糖蛋白结构分析示意图138南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物糖基化位点确定糖基化位点确定先用蛋白酶将糖蛋白酶解成含有和不含有糖链的肽片段，获得糖蛋白的肽质量指纹谱，再用糖苷内切酶将肽链切除，PMF发生变化，原含有糖肽段的质量由于糖链的丢失在质谱图上发生位移，通过网上数据库检索可以得到位移肽片段的氨基酸序列，而在这个序列中必含有糖基化位点，由此我们可以确定糖蛋白分子中的糖基化位点。139南农生物技

106、术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物糖基化分析糖基化分析l用糖苷内切酶将糖链切除，将反应前后的质谱图进行比较，就能直接表述糖链的平均质量，而糖蛋白的平均含糖量可由糖链的平均质量占糖蛋白平均相对分子质量的百分比来表示。l应用ESI，对PMF中的肽片段进行分析，可以得到蛋白某中间片段的序列，对已知蛋白，依靠此序列，判断其归属，从而对糖蛋白的氨基酸序列加以证实。l不同的质谱方法可以产生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞诱导解离(CID)谱，这可以给出有关糖的序列，分支及糖间的连接等信息。140南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物141南农生物技术制药

107、第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物糖基化修饰糖基化修饰l常用的糖蛋白质分离富集技术有:凝集素亲和技术、肼化学富集法、亲水相互作用色谱法、消除麦克尔加成反应。l基于质谱的糖蛋白质鉴定及糖基化位点确定方法有:PNGaseF酶法、EndoH酶法、-消除麦克尔加成反应、三氟甲基磺酸法。142南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物巯基和二硫键定位巯基和二硫键定位 l原理：利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巯基苏糖醇等试剂对蛋白质进行烷基化和还原烷基化,结合蛋白酶切、肽谱技术,利用生物质谱的准确分子量测定,可实现对二硫键和自由巯基的快速定位与确定。这在含有多二

108、硫键结构的活性多肽与蛋白质研究中有重要用途。143南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物泛素化修饰泛素化修饰l原理：由于泛素的C末端是Arg-Gly-Gly结构，经胰蛋白酶水解后，Gly-Gly留在被修饰蛋白质的肽链上，使肽段质量增加114，起到质量标记泛素化位点的作用，进而通过串联质谱鉴定泛素化位点。144南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物其他翻译后修饰l乙酰化l甲基化l脂基化l谷胱甘肽化145南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物质谱的其他应用l蛋白质的折叠l抗原决定部位指认l蛋白和蛋白、低聚核苷

109、酸及金属之间的作用l细胞和病毒分析等l药物代谢鉴定146南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物蛋白质类药物的体外聚乙二醇修饰（PEG化）(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤(2)阻碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)增加药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物 +蛋白或多肽偶联物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH147南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物国际上PEG修饰技术的研究进展l l美国美国RutgersRutgers大学大学DavisDavis教授教授7070年代的工作年

110、代的工作 甲氧基甲氧基PEGPEG的应用的应用l l美国美国EnzonEnzon公司公司 美国最早从事美国最早从事PEGPEG修饰蛋白质药物的公司修饰蛋白质药物的公司l l美国美国ShearwatersShearwaters公司公司 各种各种PEGPEG修饰剂的生产商修饰剂的生产商l l美国罗氏、先灵宝雅、安进美国罗氏、先灵宝雅、安进 PEGPEG药物：药物：PEG-INFPEG-INF，PEG-G-CSFPEG-G-CSFl l其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。148南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物国内PEG修饰技

111、术的研究进展l l国家国家863863重大机密项目：人工血液代用品的研制，重大机密项目：人工血液代用品的研制，1997-1997-20002000l l中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，2001-20052001-2005l l国家重大科技专项课题国家重大科技专项课题创新药物和中药现代化创新药物和中药现代化：长效：长效基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，2002-20052002-2005l l国家国家863863重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，2007-2

112、0102007-2010l lPEGPEG修饰血红蛋白：修饰血红蛋白：I I期临床期临床l l（中科院过程所、凯正公司）（中科院过程所、凯正公司）l lPEGPEG修饰修饰G-CSFG-CSF：IIIIII期临床期临床l l（格兰百克）（格兰百克）149南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）延长半衰期修饰人肿瘤坏死因子消除副作用修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra）延长半衰期修饰牛胰核糖核酸酶（RNase）提高抗肿瘤活性修饰超氧化物歧化酶（SOD）提高半衰期修饰天冬酰氨酶（Aspartase）克服免疫原性提高半衰期修饰人

113、干扰素（IFN）提高半衰期修饰血红蛋白（Hb）血液代用品修饰胰岛素提高半衰期我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作150南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物Sc-PEG 专利分析以PEG-OH为原料的必然途径CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH+光气+NHSCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N+NH2G-CSFOOOCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NHG-CSFO单链修饰：(SC-PEG)151南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物Roche公司的长效干扰素产品专利分析同样是以PEG-OH为原

114、料的必然途径双链修饰：152南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物新的修饰策略采用新方法制备新的修饰剂以PEG-COOH（CM-PEG)为原料的必然途径，已获专利CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N+NH2G-CSFOOO单链修饰：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHG-CSFO(CM-PEG)153南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物策略以PEG-COOH为原料的必然途径CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOO双链修饰

115、：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH+LysineOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-O-N+NH2IFNCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-NHIFN154南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物1、PEG修饰剂的批量制备取得了成功取取 得得 的的 主主 要要 进进 展展l分枝型ZL 01141745.5l分叉(长尾)型ZL 03100736.8l可逆型ZL03105003.4l不可逆型2.1ZL02120740.2l异端基双官

116、能团2.1155南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物聚乙二醇修饰剂产品产品号产品号末端基团末端基团分子量分子量包装包装（g）价格价格（￥）（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPEG-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-COOH20K10010200004000MPEG-NHS5-N-羟基琥珀酰亚胺5K1001052000040

117、002000MPEG-NHS10-N-羟基琥珀酰亚胺10K1001053000060003000MPEG-NHS20-N-羟基琥珀酰亚胺20K1001053500070003500156南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物三、药用蛋白的PEG修饰方法157南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物创新技术（反应器技术和产物移走技术）振荡反应器流加反应器缓释反应器固相反应方式膜耦合反应方式双水相反应方式Q. Yun, R. Yang, T. Chen, J. Bi, G. Ma, Z Su. J. Biotechnology, 2005,

118、 118: 67-74中国发明专利，申请号2.0 中国发明专利，申请号0410029577 1.修饰反应器设计PEG-pellet反应器158南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物吸附蛋吸附蛋白白加入加入PEGPEG修饰修饰洗洗脱脱2.固相吸附法制备PEG修饰蛋白159南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物PEG-INFPEG-INF的制备过程的制备过程G-CSFPEG-G-CSFCH3(-O-CH-CH)n-OH甲氧基PEG（mPEG-OH）活化的mPEG-O-醛3.PEG醛制备单修饰的药用蛋白160南农生物技术制药第二章基因工程南

119、农生物技术制药第二章基因工程药物药物粒细胞集落刺激因子(G-CSF)MW: 18.8kd (174 amino acids) pI: 6.1,1 thiol, 1 N-terminal, 4 lysines, Halflife:5h,Weeklyinjection:7times161南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物4.引入巯基的方法制备PEG修饰蛋白(2) PEGylationSNH+(1) ThiolationHS-(CH2)3-C-NH-HbNH+NOOPEG-S-(CH2)3-C-NH-HbNH+OPEGNO2-iminothiolaneNH2-Hb1

120、62南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物该PEG修饰产物的凝胶过滤分析163南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物IEF和SDS-PAGE鉴定PEG修饰蛋白1234+-Iodine stainComassie blue stainSDS-PAGEIEF1: Marker, 2: HbA, 3: -Hb 4: (Propyl-PEG5K)6-Hb5: (Propyl-PEG5K)6-Hb1: HbA, 2: -Hb 3: (Propyl-PEG5K)6-Hb4: (Propyl-PEG5K)6-Hb1 2 3 4 4 5 5 94.0

121、 66.2 43.0 31.0 20.1 14.4 164南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物RP-HPLC分析胰蛋白酶切片段165南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物质谱分析胰蛋白酶切片段MALDI-TOF/TOF分析分析PEG修饰位点在修饰位点在Val-1( )166南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物PEG修饰蛋白的结构鉴定圆二色光谱鉴定圆二色光谱鉴定荧光光谱鉴定荧光光谱鉴定167南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物RP-HPLC分析PEG修饰蛋白168南农生物

122、技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素的研发史自18世纪至今，在诸多研究者不断进取的努力下，胰岛素的研究经历了五个阶段： 发现胰岛素 得到胰岛素 了解胰岛素 合成胰岛素 改造胰岛素169南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物与胰岛素研究相关的诺贝尔奖项斯德哥尔摩斯德哥尔摩-诺贝诺贝尔颁奖大厅尔颁奖大厅% 1923- F.G. Banting 医学奖医学奖 J.J.R.Macleod 生理学奖生理学奖 1958- Frederick Sanger化学奖化学奖% 1977- Rosalyn Yalow 生理学或医学奖生理学或医学奖 The

123、Nobel Prize170南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物1788年ThomasCanley(英)证实胰腺损伤可导致糖尿病1869年Langerhans(德)发现胰腺内具有分泌功能的细胞团1889-1893年Vonmering和Minkowski(德)证实胰腺细胞团产生降血糖物质1893年EdouardLaguesse(法)将胰腺细胞团命名为胰岛1909年JeandeMeyer(比利时)将胰岛分泌的降糖物质命名为胰岛素胰岛素研究发展史发现胰岛素发现胰岛素171南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素的研究发展史得到胰岛素1

124、921年 从狗的胰脏提取了胰岛素并用于临床James BCollip (化学家化学家)Frederick G.Banting ( (医生医生) ) 获获1923年年诺贝尔医学奖诺贝尔医学奖 Charies HBest (学生助理学生助理) J.J.RMacleod(生理学家生理学家) 获获1923年年诺贝尔生理学奖诺贝尔生理学奖为纪念四位科学家为糖尿病治疗做出的杰出贡献为纪念四位科学家为糖尿病治疗做出的杰出贡献将班丁（将班丁（Banting）医生的生日（）医生的生日（11月月14日）定为世界糖尿病日日）定为世界糖尿病日172南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰

125、岛素的研究发展史得到胰岛素1926年JohnJ.Abel得到结晶胰岛素1935年ScottandFiacher获得高纯度结晶胰岛素173南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素的研究发展史得到胰岛素1936年 Hans Christan Hagedorn, et al 合成鱼精蛋白锌胰岛素(PZI)1946年 Hans Christan Hagedorn, et al 合成中效 胰岛素制剂（NPH） Hagedorn，是，是PZI、NPH的主要发明者，内的主要发明者，内科医师，博士，丹麦科医师，博士，丹麦Steno糖尿病中心创始糖尿病中心创始人，兼任主任人，兼

126、任主任26年年174南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素的研究发展史得到胰岛素l1951年锌胰岛素l1961年中性可溶性胰岛素l1964年预混胰岛素l1972年单峰胰岛素l1973年单组分胰岛素（纯度达到99%）175南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素的研究发展史了解胰岛素1955年 Frederick Sanger (英国) 阐明牛胰岛素的氨基酸排列顺序获得1958年诺贝尔化学奖176南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物1965年王应睐，邹承鲁，龚岳亭等(中)KatsoyannisP

127、G(美)Meienhorer(德) 人工合成牛胰岛素1967年DonaldF.Steiner(美) 发现胰岛素原1969年DorothyHodgkin(英) 确定胰岛素氨基酸排列的三维空间结构1971年PierreFreychet(美) 确认胰岛素受体胰岛素的研究发展史了解胰岛素177南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素的研究发展史了解胰岛素1958年，由中科院上海生物化学所、有机化学所和北京大学联合进行人工合成胰岛素研究，1965年获得人工合成牛胰岛素。牛胰岛素晶体结构模型牛胰岛素晶体结构模型178南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因

128、工程药物药物胰岛素的研究发展史了解胰岛素lRosalyn Yalow (and Solomon Berson)（美（美国）国）l1959年开始用放射免疫方法年开始用放射免疫方法测定血液中胰岛素含量测定血液中胰岛素含量19771977年，获诺贝尔生理年，获诺贝尔生理学或医学奖学或医学奖 179南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素的研究发展史合成胰岛素1979年 Ullrich 和 Itakura 阐明了胰岛素质粒的分子序列1979 -1981年 Goeddel 和 Chance 开始用DNA技术生物合成人胰岛素1981年-基因合成重组人胰岛素系列制剂180南

129、农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素的研究发展史了解胰岛素l用X线衍射法测出猪胰岛素晶体的立体结构为(中国，1971)：六个胰岛素分子和两个锌离子的胰岛素六聚体。l两个胰岛素分子形成二聚体，三个二聚体围绕着三重轴形成对称排列的六聚体。l作为胰岛素的储存形式，在胰岛素制剂注射到人体内也需要经过由六聚体解离为二聚体，再分解为单体释放入血液被利用的过程。胰岛素六聚体的三维胰岛素六聚体的三维结构图结构图181南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物A 1B 1213028 2727 28lispro基因合成的人胰岛素类似物基因合成的人胰岛

130、素类似物优泌乐优泌乐赖脯胰岛素赖脯胰岛素速效胰岛素速效胰岛素A 1B 12130天门冬氨酸天门冬氨酸赖氨酸赖氨酸glulisine谷氨酸谷氨酸赖氨酸赖氨酸谷赖胰岛素谷赖胰岛素基因重组的速效人胰岛素类似物，直接以单体胰岛素的形式入血，能够在注射后被迅速吸收，注射10分钟后即可起效。与长效胰岛素联合应用，模拟基础、餐时胰岛素治疗，血糖更易控制，低血糖发生率低。182南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物人胰岛素类似物 l基因重组的速效人胰岛素类似物的预混制剂，具有餐时注射起效快，灵活方便的特性。A 1B 12130天门冬氨酸天门冬氨酸脯氨酸脯氨酸aspart诺和锐诺和

131、锐门冬胰岛素门冬胰岛素诺和锐诺和锐30特充特充速效胰岛素速效胰岛素183南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物基因合成的人胰岛素类似物l超长效人胰岛素类似物,比常规长效胰岛素作用时间更长, 主要用于24小时长期控制基础血糖。l可以与速效类似物联合使用,能很好的模拟正常人的生理性胰岛素分泌,使糖尿病患者的血糖水平得到24小时理想控制。 A 1B 12130肉豆蔻酸肉豆蔻酸赖氨酸赖氨酸detemirA 1B 12130精氨酸精氨酸甘氨酸甘氨酸glargin32天门冬氨酸天门冬氨酸来得时来得时甘精胰岛素甘精胰岛素中、长效胰岛素中、长效胰岛素地特胰岛素地特胰岛素 诺和平诺

132、和平184南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素立体胰岛素立体结构结构185南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物1.Humulin（优泌林）（优泌林） 重组人胰岛素重组人胰岛素2.Novolin（诺和灵）（诺和灵） 1982年年10月在美国上市，全球第一月在美国上市，全球第一个商业化基因重组人胰岛素。个商业化基因重组人胰岛素。Eli Lilly and Company Novo Nordisk 186南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物欧洲市场的重组胰欧洲市场的重组胰岛素类似物岛素类似物Simo

133、n Heller , Plamen Kozlovski , Peter KurtzhalsDiabetes Research and Clinical Practice 78 (2007) 149158187南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物国内常用胰国内常用胰岛素一素一览表表产品名包装品名包装(U/瓶瓶)生生产厂家厂家种属来源种属来源短效胰短效胰岛素素中性胰中性胰岛素素(RI) 400400U/瓶瓶 上海生物制上海生物制药厂厂 猪猪常常规优泌林泌林400400U/瓶瓶 礼来礼来 人人( (Humulin-R) (人工合成人工合成) )诺和灵和灵- -R 40

134、0400U/瓶瓶 诺和和诺德德人人( (Actrapid-P) (人工合成人工合成) )诺和灵和灵- -R 150150U/瓶瓶 诺和和诺德德人人( (笔笔专用用)()(人工合成人工合成) )Lispro 400400U/瓶瓶 礼来礼来 人人中效胰中效胰岛素素中效中效优泌林泌林400400U/瓶瓶 礼来礼来 人人( (Humulin-N) (人工合成人工合成) )诺和灵和灵- -N 400400U/瓶瓶 诺和和诺德德 人人( (Protaphane) (人工合成人工合成) )诺和灵和灵- -N 150150U/瓶瓶 诺和和诺德德 人人( (笔笔专用用) ( (人工合成人工合成) )NPH 40

135、0400U/瓶瓶 徐州生化制徐州生化制药厂厂 猪猪188南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物 产品名包装品名包装(U/瓶瓶)生生产厂家厂家种属来源种属来源长效胰效胰岛素素精蛋白精蛋白锌胰胰岛素素400 U/瓶瓶 徐州生化制徐州生化制药厂厂猪猪( (PZI)混合胰混合胰岛素素70/3070/30优泌林泌林400400U/瓶瓶 礼来礼来 人人( (Humulin 70/30) (人工合成人工合成) )诺和灵和灵- -M 400400U/瓶瓶 诺和和诺德德人人( (Mixtard) (人工合成人工合成) )诺和灵和灵- -M 150150U/瓶瓶 诺和和诺德德人人(

136、(笔笔专用用) ( (人工合成人工合成) )国内常用胰国内常用胰岛素一素一览表表189南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物世界上第一例糖尿病世界上第一例糖尿病应用胰用胰岛素治素治疗获成功成功l1921年年5月，月，Banting和和Best：结扎狗胰管，扎狗胰管，从萎从萎缩的胰腺的胰腺组织中提取物具降糖作用中提取物具降糖作用l19221922年年1 1月，多月，多伦多多总医院一名医院一名1414岁患患严重重糖尿病的女孩糖尿病的女孩( (Leonard Thompson)接受牛接受牛胰腺提取液的治胰腺提取液的治疗l患儿高血糖近于完全消失，血糖降至正常患儿高血糖近于

137、完全消失，血糖降至正常l尿尿酮体消失体消失l精神、体力大大好精神、体力大大好转190南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰胰岛素素纯化的化的进展展l重重结晶法晶法(1970年以前年以前)含相当多含相当多杂质：胰：胰岛素原、胰素原、胰岛素分解中素分解中间物、物、胰高糖素、生胰高糖素、生长抑素、胰多抑素、胰多肽标准制准制剂中胰中胰岛素原含量达素原含量达10,000 20,000 ppm (parts per million)，即百万分之即百万分之1-21-2万万l单峰胰峰胰岛素素( (monopeak insulin)层析法提析法提纯杂质少于少于5050ppm191

138、南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物l单组分胰分胰岛素素(monocomponent insulin)离子交离子交换树脂脂层析法析法杂质 10 ppml高高纯度胰度胰岛素素(highly purified insulin)凝胶凝胶层析加离子交析加离子交换杂质少于少于10 ppml进一步提一步提纯的的单组分胰分胰岛素素杂质少于少于11ppml胰胰岛素素纯化的化的进步大大减少了步大大减少了杂质蛋白免疫蛋白免疫原性所引起的并原性所引起的并发症症胰胰岛素素过敏、胰敏、胰岛素抵抗、局部脂肪萎素抵抗、局部脂肪萎缩胰胰岛素素纯化的化的进展展192南农生物技术制药第二章基因工程

139、南农生物技术制药第二章基因工程药物药物锌混混悬剂缓效胰效胰岛素素(50年代期年代期)lHallas-Moller，1952年年l单加加锌，不加，不加鱼精蛋白，亦可延精蛋白，亦可延长胰胰岛素的作用素的作用l在在pH中性条件下，加入中性条件下，加入过量的量的锌l锌含量：含量：0.150.200.150.20mg/100 iul可使胰可使胰岛素素处于于结晶状晶状态，注入皮下后，再溶解，然后被吸，注入皮下后，再溶解，然后被吸收收l按制按制备方法的不同，可有不同的制方法的不同，可有不同的制剂：半半缓胰胰岛素素( (semi-lente)，属作用属作用较快的中效制快的中效制剂，胰，胰岛素素处于不定形于不定

140、形细粒状粒状态，注射后可，注射后可较快再溶解，被吸收快再溶解，被吸收特慢胰特慢胰岛素素( (ultra-lente)，属属长效制效制剂胰胰岛素，素，处于于结晶晶状状态，颗粒粒较大，再溶解大，再溶解较慢慢缓效胰效胰岛素素( (lente)l以上两种制以上两种制剂的混合，其作用介于中效及的混合，其作用介于中效及长效之效之间193南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物中性中性鱼精蛋白胰精蛋白胰岛素素Neutral Protamine insulin Hagedorn (NPH)l属中效制属中效制剂l鱼精蛋白与胰精蛋白与胰岛素二者的量相匹配，素二者的量相匹配，0.4 mg

141、/100 iu，鱼精蛋白无多余精蛋白无多余l二者呈相当的比份二者呈相当的比份( (Isophane proportion)l只需加微量的只需加微量的锌使制使制剂稳定：定：锌0.0160.0160.040.04mg/100 iulNPH与与RI混合混合应用用时，由于无多余的，由于无多余的鱼精蛋精蛋白，故白，故RI不被吸附，以速效形式存在不被吸附，以速效形式存在l目前有各种比例的目前有各种比例的预混胰混胰岛素素( (Premixed insulin)NPH/RI:70/30,80/20,60/40194南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物长效胰效胰岛素的素的发展展鱼

142、鱼精蛋白与胰精蛋白与胰精蛋白与胰精蛋白与胰岛岛素素素素结结合型合型合型合型缓缓效胰效胰效胰效胰岛岛素研制成功素研制成功素研制成功素研制成功lHagcdorn 1936l鱼精蛋白精蛋白( (Protamine)为雄雄鱼生殖腺所含的一生殖腺所含的一组碱性蛋白碱性蛋白质lpH中性的胰中性的胰岛素加入素加入鱼精蛋白后，其溶解度精蛋白后，其溶解度降低，形成胰降低，形成胰岛素素鱼精蛋白复合沉淀物精蛋白复合沉淀物l注射至皮下注射至皮下组织后，蛋白后，蛋白酶将将鱼精蛋白分解精蛋白分解下来，胰下来，胰岛素逐素逐渐释出出l有两种主要的制有两种主要的制剂195南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因

143、工程药物药物鱼精蛋白精蛋白锌胰胰岛素素Protamine Zine Insulin (PZI)l属属长效制效制剂l鱼精蛋白与胰精蛋白与胰岛素的比例素的比例为1.2 mg/100 iu，鱼精蛋白有精蛋白有过剩剩l需有需有过量量锌使制使制剂稳定：定：锌0.20.2mg/100 iul如如PZI与与RI混合混合应用，有一部分用，有一部分RI被被鱼精蛋白精蛋白吸附而吸附而变为缓效效lPZI约可吸附其本身半量的可吸附其本身半量的RI例如例如PZI 20 U + RI 20 u (1:1混合混合) )约相当于相当于PZI 30 u + RI 10 u (3:1混合混合) )196南农生物技术制药第二章基因

144、工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物人胰人胰人胰人胰岛岛素素素素l化学合成化学合成中科院上海生化所：高中科院上海生化所：高质量的量的结晶晶纯品品l重重组DNA：人工合成人胰人工合成人胰岛素素先合成先合成编码胰胰岛素素A链，B链的的DNA序列，将其植入大序列，将其植入大肠杆菌杆菌质粒中，提粒中，提纯肽链，并用二硫，并用二硫键连接起来接起来先合成胰先合成胰岛素原，再用素原，再用酶裂解裂解人工合成胰人工合成胰岛素不含素不含杂质，不含，不含杂质、胰多、胰多肽等等197南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物人与人与动物胰物胰岛素在生物学活性及素在生物学活性及药效学上的

145、差效学上的差别l总的来的来说，人胰，人胰岛素与猪等素与猪等动物胰物胰岛素，素，药效作用上甚效作用上甚为相近相近l药效学上的差效学上的差别：人正人正规胰胰岛素皮下注射后吸收素皮下注射后吸收较快，起效快，起效时间较早早人超人超缓胰胰岛素素较之牛的相之牛的相应制制剂作用作用较短，需每日注射短，需每日注射2次次l人与人与动物胰物胰岛素在免疫原性上的差素在免疫原性上的差别人胰人胰岛素的抗原性素的抗原性较牛胰牛胰岛素素为弱弱较猪胰猪胰岛素抗原性也素抗原性也轻用人胰用人胰岛素后，血中素后，血中针对胰胰岛素抗体的滴度素抗体的滴度较之使用之使用动物胰物胰岛素后素后为低低l低血糖低血糖问题应用人胰用人胰岛素后低血

146、糖的素后低血糖的发生生较多，可能与多，可能与强化治化治疗的的应用用较普遍有关普遍有关198南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰胰岛素素类似物似物l速效胰速效胰岛素皮下注射后作用不素皮下注射后作用不够快，不能与餐后高血快，不能与餐后高血糖同步糖同步l迟缓胰胰岛素在吸收素在吸收过程中出程中出现峰峰值，不能模，不能模拟生理性生理性的基的基础分泌分泌l人及人及动物胰物胰岛素制素制剂的的临床床应用不能完全符合生理性用不能完全符合生理性需要需要l为解决上述解决上述问题，将胰，将胰岛素分子加以改造，以得出素分子加以改造，以得出超超速速及及超超缓的胰的胰岛素素类似物似物199

147、南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物制制备速效胰速效胰岛素素类似物的策略似物的策略l形成二聚体有关的主要部位形成二聚体有关的主要部位为B链中氨基酸中氨基酸B8、B9、B12、B16、B21、B23-29lB16、B23-25与胰与胰岛素素结合其受体有关，不能改合其受体有关，不能改变，否，否则影响生物活性影响生物活性l阻碍二聚体形成的策略阻碍二聚体形成的策略在聚合的界面引起一个在聚合的界面引起一个电荷上的排斥状荷上的排斥状态如如B28脯氨酸脯氨酸( (Pro)换为门冬氨酸冬氨酸( (Asp)B28 Asp胰胰岛素素( (Novo-Nordisk)模仿模仿IGF-1

148、的的结构构B28 Pro B29 Lys换为B28 Lys B29 ProLispro insulin (Eli Lilly)200南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物缓效胰效胰岛素素类似物的似物的举例例l在在B链的的羧基端基端侧接上配基，如脂酸，后者可接上配基，如脂酸，后者可与蛋白与蛋白紧密密结合，然后合，然后缓慢慢释放放l甘精胰甘精胰岛素素201南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物甘精胰甘精胰岛素素强化治化治疗DM低血糖低血糖发生率与生率与NPH比比较l甘精胰甘精胰岛素：素：Insulin glargine重重组DNA，人工合

149、成人工合成2121A - Gly - 30 Ba - L - Arg 30B-L Arg - 人胰人胰岛素素作用作用时间较NPH长：等等电位改位改变：生理：生理pH中溶解性下降，六聚体中溶解性下降，六聚体稳定性定性上升上升2828周周过程甘精胰程甘精胰岛素：素：(264) 睡前睡前NPH ：(270) 睡前睡前 或或 睡前睡前+ +早餐前早餐前Tobert E. Ratner et al. Diabetes Care 2000, 23(5): 639-642202南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物重组人类胰高血糖素肽人类胰高血糖素肽-1-1 人类胰高血糖素肽人

150、类胰高血糖素肽人类胰高血糖素肽人类胰高血糖素肽-1-1（human glucagon-like peptide-1, human glucagon-like peptide-1, hGLP-1)hGLP-1)是由人小肠是由人小肠是由人小肠是由人小肠L L细胞分泌的多肽激素，是胰高血糖细胞分泌的多肽激素，是胰高血糖细胞分泌的多肽激素，是胰高血糖细胞分泌的多肽激素，是胰高血糖素原在小肠中被加工后的产物，属肠降血糖素之一。素原在小肠中被加工后的产物，属肠降血糖素之一。素原在小肠中被加工后的产物，属肠降血糖素之一。素原在小肠中被加工后的产物，属肠降血糖素之一。 人类胰高血糖素肽人类胰高血糖素肽人类胰高

151、血糖素肽人类胰高血糖素肽1 1的一级结构：的一级结构：的一级结构：的一级结构： His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr- Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu- Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu- Val - Lys-Gly-Arg -Gly Val - Lys-Gly-Arg -Gly (NH

152、 (NH2 2) )203南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物GLP-1促胰岛素分泌功能的发现促胰岛素分泌功能的发现1987年，年，Mojsov首先发现首先发现GLP-1具有很强的促胰岛素释放活性。具有很强的促胰岛素释放活性。 （Svetlana Mojsov et al, J. Clin. Invest. 79, February 1987, 616-619.）204南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物 78 107NH78 107NH2 2 126 158126 158HumanHumanproglucagon(PG)prog

153、lucagon(PG)PancreasPancreasSmall intestineSmall intestine Glicentin GlicentinOxyntomodulinOxyntomodulinGLP-1GLP-1GLP-1GLP-1hGLP-1hGLP-1在体内的生物合成在体内的生物合成1 31 32 62 63 77 124 1251 31 32 62 63 77 124 12570 71 109 110 159 16070 71 109 110 159 1601 30 33 61 72 1581 30 33 61 72 158 64 6964 69 72 107NH72 10

154、7NH2 2 72 10872 108 1 691 691 30 33 691 30 33 69111 123111 12378 10878 108GRPPGRPP glucagon glucagon IP-1IP-1Major proglucagon FragmentMajor proglucagon FragmentPG 72-107PG 72-107IP-2IP-2GLP-2GLP-2PG 72-108PG 72-108IP-2IP-2GLP-2GLP-2 GRPP GRPP205南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物lGLP-1天然结构药物天然结构药物丹麦

155、哥本哈根大学丹麦哥本哈根大学丹麦哥本哈根大学丹麦哥本哈根大学PanumPanum研究所研究所研究所研究所Brewery SuntoryBrewery Suntory公司和公司和公司和公司和SankyoSankyo制药公司制药公司制药公司制药公司国内的华谊公司国内的华谊公司国内的华谊公司国内的华谊公司lGLP-1类似物类似物 Eli LillyEli Lilly公司公司公司公司 LY 307161 SRLY 307161 SRAmylinAmylin公司公司公司公司AC2993AC2993Novo NordiskNovo Nordisk公司公司公司公司NN2211NN2211206南农生物技术制

156、药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物分泌表达质粒分泌表达质粒分泌表达质粒分泌表达质粒pAGT-8pAGT-8构建示意图构建示意图构建示意图构建示意图pAET-8pAET-8pAGT-8pAGT-81 12 2annealingannealingklenowklenowHind IIIHind IIIhGLP-1 genehGLP-1 genePst IPst IPst IPst IPst IPst IhGLP-1hGLP-1Kpn IKpn IHind IIIHind IIIHind IIIHind IIIHind IIIHind IIIEGFEGFEcoR IEcoR IP

157、phoA+SPphoAPphoA+SPphoAPphoA+SPphoAPphoA+SPphoAPphoA+SPphoAPphoA+SPphoAAmpAmp+ +AmpAmp+ +AmpAmp+ +EcoR I / Mung Bean Nuclease / Hind IIIEcoR I / Mung Bean Nuclease / Hind IIIT4 DNA LigaseT4 DNA Ligase207南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素注射方式的改进l几十年来,胰岛素注射器已经有了很大的改进。许多品牌厂商制造胰岛素专用注射器,针头经过特殊处理,因而注射时

158、不感到疼痛,而且针眼很小。注射器针筒上直接标有胰岛素单位(IU)，注射几个单位胰岛素只要按标记抽取,不需换算。一次性注射器一次性注射器208南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素注射方式的改进l一种利用高压将胰岛素“喷”入皮下的装置，无需针头，加之其经久耐用，常给惧怕针头的儿童使用。但此装置价格较贵，拆洗安装过程较繁琐，喷射时局部压力较大，尚未广泛推广使用。目前高压注射器多用于人群计划免疫和多人集中注射的情况。高压无针注高压无针注射仪射仪209南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素注射方式的改进l胰岛素笔是一种形如钢笔的专

159、用注射装置,将胰岛素液储存于笔中,使用前调好剂量旋钮,患者自己注射方便易行。l胰岛素笔配有专用笔盒,可随身携带,更方便于旅行出差时使用。l笔上配有触感式剂量调整旋纽 ，也能适用于眼睛不方便的患者。胰岛素笔胰岛素笔210南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物胰岛素注射方式的改进胰岛素泵是目前最方便、最现代化的注射方式，可以自动定时定量地注射胰岛素，能较好模拟生理性胰岛素分泌，可以准确控制胰岛素的输入剂量，并能经导管连续不断按需要将胰岛素输入患者皮下。随着技术的发展，胰岛素泵越发小巧，功能亦不断完善，目前的胰岛素泵仅重约100克,如一台寻呼机大小，携带方便。 胰岛素泵胰岛素泵211南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物非注射用胰岛素l正在研究中的其它非注射胰岛素给药途径包括: 口腔喷雾 鼻腔给药 直肠栓剂给药 均还在研究阶段 滴眼剂 透皮或口腔粘膜给药 212南农生物技术制药第二章基因工程南农生物技术制药第二章基因工程药物药物