《DNSAA双向聚酰胺薄膜层析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNSAA双向聚酰胺薄膜层析（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、DNSAA双向聚酰胺薄膜层析背背 景景层析法也称色析法也称色谱法，是法，是1906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶并命名的。他将植物叶子的色素通子的色素通过装填有吸附装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色后形成不同的色带而而被分开，由此得名被分开，由此得名为“色色谱法法”（Chromatography) 。后来无色物后来无色物质也可利用吸附柱也可利用吸附柱层析分离。析分离。英国生物学家英国生物学家Martin和和Synge。他。他们首先提出了色首先提出了色谱塔板理塔板理论。1944年出年出现纸层析
2、以后，析以后，层析法不断析法不断发展，相展，相继出出现薄薄层层析、析、亲和和层析、凝胶析、凝胶层析、析、气相气相层析、高析、高压液相液相层析等。析等。叶叶绿素通素通过碳酸碳酸钙管柱所形成的色管柱所形成的色谱图层析的两种相析的两种相固定相：固定相是固定相：固定相是层析的一个基析的一个基质。它可以是固体物。它可以是固体物质（如吸附（如吸附剂，凝胶，离子交，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），素上的溶液），这些基些基质能与待分离的能与待分离的化合物化合物进行可逆的吸附，溶解，交行可逆的吸附，溶解，交换等作用。等作用。流流动相：在
3、相：在层析析过程中，推程中，推动固定相上待分离的物固定相上待分离的物质朝着一个方向移朝着一个方向移动的液体、气体或的液体、气体或超超临界体等，都称界体等，都称为流流动相。在柱相。在柱层析中一般称析中一般称为洗脱洗脱剂，薄，薄层层析析时称称为展展层剂。层析法是利用混合物中各析法是利用混合物中各组分物理化学性分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各和力、分配系数等），使各组分在两相（一相分在两相（一相为固定的，称固定的，称为固定相；另一相流固定相；另一相流过固固定相，称定相，称为流流动相）中的分布程度不同，相）中的分布程度
4、不同，即各即各组分所受的固定相的阻力和流分所受的固定相的阻力和流动相的推力相的推力影响不同，影响不同，从而使各从而使各组分以不同的速度移分以不同的速度移动而达到分离的目的。而达到分离的目的。按按层析析过程的机理分程的机理分类：分配分配层析析: : 根据不同根据不同组分在不同溶分在不同溶剂中分配系数不同而使物中分配系数不同而使物质分离的方法称分离的方法称为分配分配层析。析。吸附吸附层析析: :吸附是两相成一界面，溶吸附是两相成一界面，溶质在表面密集的在表面密集的现象。以吸附象。以吸附剂为固定相，根固定相，根据待分离物与吸附据待分离物与吸附剂之之间吸附力不同而达到分离目的的一种吸附力不同而达到分离
5、目的的一种层析技析技术称称为吸附吸附层析。析。常用吸附常用吸附剂：活性碳、硅。：活性碳、硅。离子交离子交换层析析: : 是以离子交是以离子交换剂为固定相，根据物固定相，根据物质酸碱度、极性和分子大小差异酸碱度、极性和分子大小差异而将物而将物质予以分离的一种方法。予以分离的一种方法。凝胶凝胶层析（分子析（分子筛）利用凝胶）利用凝胶颗粒形成具有三粒形成具有三维空空间多孔性网多孔性网络结构的物构的物质，不，不带电荷，可起荷，可起滤过或或“筛”的作用。的作用。亲和和层析是利用生物分子析是利用生物分子间所具有的所具有的专一性一性亲和力的和力的层析技析技术。层析法分析法分类层析法分析法分类按两相所按两相所
6、处的状的状态分分类：流流动相有两种状相有两种状态：液体作：液体作为流流动相相 气体作气体作为流流动相相固定相也有两种状固定相也有两种状态：固体吸附：固体吸附剂作作为固定相固定相 以吸附在固体上的液体作以吸附在固体上的液体作为固定相固定相按两相所按两相所处的状的状态分分为：液相液相层析和气相析和气相层析析 流动相流动相固定相固定相 液体液体 （液相层析（液相层析) ) 气体气体 （固相层析）（固相层析） 液液 体体 液液- -液层析液层析气气- -液层析液层析 固固 体体 液液- -固层析固层析气气- -固层析固层析层析法分析法分类名称名称操作形式操作形式适用范围适用范围柱层析柱层析将固定相装于
7、柱内，使将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而样品沿一个方向移动而达到分离的目的。达到分离的目的。柱层析是常用的层析形式，适用于大量样柱层析是常用的层析形式，适用于大量样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。色谱等都通常采用柱层析形式。薄层层析薄层层析将适当粘度的固定相均将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各后用流动相展开，使各组份分离组份分离薄层层析主要适用于小分子物质的快速检薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分
8、析和少量分离制备，通常为一次性使测分析和少量分离制备，通常为一次性使用。用。按操作形式不同分按操作形式不同分类：吸附吸附层析析原理：任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物原理：任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶或溶解在其中的溶质在在此表面密集此表面密集现象称象称为吸附，利用吸附吸附，利用吸附剂对不同物不同物质具有不同吸附力使混合物得具有不同吸附力使混合物得到分的到分的现象就叫吸附象就叫吸附层析。析。凡能将其他物凡能将其他物质聚集到自己表面的物聚集到自己表面的物质称吸附称吸附剂，包括硅皮、氧化，包括硅皮、氧化铝、活性炭、活性炭、淀粉、淀粉、纤维素及陶土，而聚集于聚集于吸
9、附素及陶土，而聚集于聚集于吸附剂表面的物表面的物质称被吸附称被吸附剂。吸附吸附剂与被吸附与被吸附剂之之间的作用除了物理作用外，的作用除了物理作用外，还有化学作用，如有化学作用，如DNS-DNS-氨基酸氨基酸双向聚双向聚酰胺薄膜胺薄膜层析析时中被分离的物中被分离的物质之所以能吸附在聚之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于胺薄膜上就是由于二者之二者之间形成形成氢键。分配分配层析技析技术 （液（液- -液液层析法）析法）原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之相）之间的分配系数的不的分配系数的不同而达到分离各同而达到分离各组分的目的。分的目
10、的。纸层析是最广泛的一种分配析是最广泛的一种分配层析。析。特点：液特点：液- -液液层析法适合于分离同系物或同分异构体析法适合于分离同系物或同分异构体分配分配层析技析技术分配系数小的溶分配系数小的溶质在流在流动相中分配的数量多，移相中分配的数量多，移动快；分配系数大的溶快；分配系数大的溶质在固定相中在固定相中分配的数量多，移分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。慢。因此可彼此分开。分配系数主要与下列因素有关：分配系数主要与下列因素有关： 被分离物被分离物质本身的性本身的性质； 固定相和流固定相和流动相的性相的性质； 层析柱的温度。析柱的温度。 相关的概念（一）：相关的概念（一）： 分配系数：当
11、一种溶分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶分布在两个互不相溶的溶剂中中时，它在固定相和流，它在固定相和流动相两相内的相两相内的浓度之比是个常数，称度之比是个常数，称为分配系数分配系数(Kd)。分配系数是。分配系数是层析中分离析中分离纯化物化物质的主要依据的主要依据 Kd=Cs/Cm 其中其中Cs: 固定相中的固定相中的浓度，度，Cm: 流流动相中的相中的浓度度分配分配层析技析技术相关的概念（二）：相关的概念（二）：迁移率：在一定条件下，在相同的迁移率：在一定条件下，在相同的时间内某一内某一组分在固定相移分在固定相移动的距离与流的距离与流动相本相本身移身移动的距离之比的距离之比值。常用。常
12、用RfRf来表示。来表示。物物质在一定溶在一定溶剂中的分配系数是一定的，中的分配系数是一定的， Rf值也是恒定的，因此可以根据也是恒定的，因此可以根据RfRf值来来鉴定被分离的物定被分离的物质。Rf =色斑中心至原点中心的距离色斑中心至原点中心的距离溶溶剂前前缘至原点中心的距离至原点中心的距离亲和和层析法析法亲和和层析（析（Affinity Chromatography）是利用生物分子）是利用生物分子间专一性一性亲和力而和力而进行分离行分离的一种的一种层析技析技术。如我如我们熟悉的：抗原和抗体；熟悉的：抗原和抗体；酶和底物或和底物或辅酶或抑制或抑制剂；激素和受体；激素和受体；RNA和其互和其互
13、补的的DNA等。等。亲和和层析的分离原理析的分离原理简单的的说就是通就是通过将具有将具有亲和力的两个分子中一和力的两个分子中一个固定在不溶性基个固定在不溶性基质上，利用分子上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，和力的特异性和可逆性，对另一个分子另一个分子进行行分离分离纯化。化。 亲和和层析可用于析可用于纯化生物大分子、稀化生物大分子、稀释液的液的浓缩、不、不稳定蛋白定蛋白质的的贮藏、从藏、从纯化的化的分子中出去残余的分子中出去残余的污染物、用免疫吸附染物、用免疫吸附剂吸附吸附纯化化对此尚无互此尚无互补配体的生物大分子，配体的生物大分子，分离核酸是分离核酸是亲和和层析析应用的重要方面。用的重要方
14、面。亲和和层析析纯化化过程程简单、迅速，且分离效率高。、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不分离含量极少又不稳定的活性物定的活性物质尤尤为有效。缺点是有效。缺点是针对某一分离某一分离对象，制象，制备专一的配基和一的配基和寻求求层析的析的稳定条件限定条件限制了其使用。制了其使用。亲和和层析示意析示意图离子交离子交换层析析离子交离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的的结合力不同而合力不同而进行分离行分离纯化。化。离子交离子交换层析的固定相是离子交析的固定相是离子交换剂，它是由一，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基不溶于水的惰性高分子聚合物基质
15、通通过一定的化学反一定的化学反应共价共价结合上某种合上某种电荷基荷基团形成的。形成的。离子交离子交换剂包括交包括交换树脂和交脂和交换纤维素两种。素两种。离子交离子交换剂可以分可以分为三部分：高分子聚合物基三部分：高分子聚合物基质、电荷基荷基团和平衡离子。和平衡离子。电荷基荷基团与高分与高分子聚合物共价子聚合物共价结合，形成一个合，形成一个带电的可的可进行离子交行离子交换的基的基团。平衡离子是。平衡离子是结合于合于电荷基荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交生可逆的交换反反应。平衡离子。平衡离子带正正电的离的离子交子交换剂能与能与带正正电
16、的离子基的离子基团发生交生交换作用，称作用，称为阳离子交阳离子交换剂；平衡离子；平衡离子带负电的离的离子交子交换剂与与带负电的离子基的离子基团发生交生交换作用，称作用，称为阴离子交阴离子交换剂。原理原理聚聚酰胺薄膜胺薄膜层析是一析是一类特殊的分配特殊的分配层析。混合物随流析。混合物随流动相通相通过聚聚酰胺薄膜胺薄膜时，由，由于被分离物于被分离物质与薄膜形成与薄膜形成氢键，而各物，而各物质形成形成氢键的能力不同，决定吸附力的差的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力异，吸附力强, ,展展层速度慢，吸附力弱，展速度慢，吸附力弱，展层速度快。速度快。展展层溶溶剂与被分离物与被分离物质在聚在聚酰胺离子表面
17、胺离子表面竞争形成争形成氢键，选择适当的展适当的展层溶溶剂，使被分离物使被分离物质在溶在溶剂与聚与聚酰胺薄膜表面之胺薄膜表面之间的分配系数有最大差异。易溶于展的分配系数有最大差异。易溶于展层剂的所受的的所受的动力作用大，展力作用大，展层速度快，反之，速度慢。速度快，反之，速度慢。 DNS-氨基酸氨基酸的双向聚的双向聚酰胺薄膜胺薄膜层析析本本实验中，聚中，聚酰胺上的氨基与氨基酸（胺上的氨基与氨基酸（AA）的）的羰基形成基形成氢键，酰胺基胺基团上上羰基与基与AA中中羟基或酚基形成基或酚基形成氢键。由于有些。由于有些AA结构相似，如只采用一种溶构相似，如只采用一种溶剂系系统进行行单向向层析，析，难达
18、达到完全分离的目的。因此可到完全分离的目的。因此可选择另一溶另一溶剂系系统进行第二向行第二向层析。析。这种种层析方法称析方法称为双向双向层析。析。 第一向：苯冰醋酸溶第一向：苯冰醋酸溶剂 第二向：甲酸水第二向：甲酸水显色：二甲氨基色：二甲氨基萘磺磺酰氯（DNS-Cl）可与氨基酸的游离氨基）可与氨基酸的游离氨基结合成合成DNS-氨基酸。形成的氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外光下呈黄色氨基酸在紫外光下呈黄色荧光。光。DNS-Cl + AADNS-AA + HCl3 3、操作注意事、操作注意事项：严格控制点格控制点样位置以及点位置以及点样直径。直径。展展层时勿将点勿将点样点浸入展点浸入展层剂中。中。展展层后必后必须经电吹吹风将膜吹干。将膜吹干。紫外光紫外光对眼睛有害不要把眼睛有害不要把头伸到灯下伸到灯下观察。察。颉亮亮苯苯丙丙赖甘甘丝天天脯脯谷谷DNS-氨基酸的双向氨基酸的双向层析析预期期实验结果果
