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1、IPTG诱导的蛋白表达调控1. 课题来源：课题来源：l实验步骤： 接种 扩大培养 IPTG诱导 蛋白提取、纯化l思考： IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用原理？2. IPTG的作用原理的作用原理lIPTG (isopropylthiog- alactoside,异丙基硫代半乳糖苷): 化学合成的乳糖类似物，很强的 半乳糖苷酶诱导剂，诱导乳糖操纵元(lac operon)的开放，自身不被催化分解。类似的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷)也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作 半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物
2、学和基因工程的工作中。2. IPTG的作用原理的作用原理2.1 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）l大肠杆菌利用乳糖至少需要需要两个酶：促使乳糖进入细菌的乳糖透过酶(lactose permease)和催化乳糖分解第一步的 半乳糖苷酶( -galactosidase)。l在环境中没有乳糖或其他-半乳糖苷时，大肠杆菌合成-半乳糖苷酶量极少，加入乳糖或其类似物2-3分钟后，细菌大量合成 -半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一碳源时，菌体内的-半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量的3%。2.1 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）l乳糖操纵元含有、和3个结构基因。基因表达
3、产物为 -半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)，再分解为半乳糖和葡萄糖；基因编码半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；基因编码转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。2.1 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）2.1 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）l基因5侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点（ribosome binding site，RBS）特征的Shan-Dagano(SD)序列，因而当乳糖操纵元开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA上。l由于、三个基因头尾相接，上一个基因的翻译终止码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一个核糖体能沿此
4、转录生成的多顺反子（polycistron）mRNA移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。 2.1 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）2.2 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）的负调控）的负调控l操纵子（o）序列位于启动子（p）与被调控的基因之间，部分序列与启动子序列重叠。l在乳糖操纵元中，调控基因lac I位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R。2.2 乳糖操纵元（乳糖操纵元
5、（lac operon）的负调控）的负调控2.2 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）的负调控）的负调控l当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵元处于阻遏状态。此基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。lR以四聚体形式与操纵子结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动，从而阻遏了这群基因的表达。2.2 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）的负调控）的负调控2.2 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）的负调控）的负调控l当环境中有足够的乳糖时，乳糖受-半乳糖苷酶作用转
6、变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类，半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对lac操纵元的诱导作用。 2.2 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）的负调控）的负调控 在这过程中乳糖（实际起作用的是别乳糖）就是诱导剂，与R结合起到去阻遏作用（derepression），诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放2.3 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）的正调控）的正调控l细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产生能量
7、时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。2.3 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）的正调控）的正调控l细菌中有一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的，当cAMP浓度升高时，CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为CAP（CRP-cAMP activated protein），能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。2.3 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）的正调控）的正调控2.3 乳糖操纵元（乳糖操纵元（
8、lac operon）的正调控）的正调控l在lac操纵元的启动子Plac上游端有一段序列与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异结合，称为CAP结合位点（CAP binding site）。CAP与这段序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。相反，当有葡萄糖可供分解利用时，cAMP浓度降低，CRP不能被活化，lac操纵元的结构基因表达下降。 2.3 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）的正调控）的正调控l由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖
9、。llac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。 2.3 乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac operon）的正调控）的正调控l不难看出：CAP结合位点就是一种起正性调控作用的操纵子，CAP则是对转录起正性作用的调控蛋白激活蛋白，编码CRP的基因也是一个调控基因，不过它并不在lac操纵元的附近，CAP可以对几个操纵元都起作用。l 从上所述，乳糖操纵元属于可诱导操纵元（inducible operon），这类操纵元通常是关闭的，当受效应物作用后诱导开放转录。这类操纵元使细菌能适应环境的变化，
10、最有效地利用环境能提供的能源底物。3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用l运用乳糖操纵元控制外源蛋白表达的目的： 在需要菌体大量繁殖时，为了提供更多的物质和能量确保菌体正常快速的生长，需要将外源基因关闭。 菌体浓度达到要求时，可通过诱导使菌体表达大量外源蛋白。3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用l在我们所使用的PGEX载体中，插入了乳糖操纵元的调控基因lac Iq和启动子Plac ，其后紧接GST基因、外源基因。l这些基因头尾相接，上一个基因的翻译终止码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子mRNA移动
11、，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。 vector informationMCS region3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用lIPTG诱导的表达载体必须以过表达lac阻遏物的大肠杆菌为宿主，才能阻止外源基因在诱导前的转录。由于大多数IPTG诱导的表达质粒拷贝数很高（30600），因此需要过量阻遏物才能阻断基础表达（渗漏表达）。单拷贝的lac Iq等位基因可以表达过量10倍的lac阻遏物但是，如果外源蛋白对宿主的毒性非常强，或者质粒拷贝数非常高，就需要将lac Iq等位基因克隆进表达质粒，确保紧密调节。3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用l IPTG诱导的条件： 一般：l 通过调节温度和IPTG的浓度，诱导表达质粒慢转导，防止外源蛋白表达过快而形成包涵体。 影响大肠杆菌中获得高表达水平的重要因素可能是生长温度，通过实验确定最佳温度，是表达外源蛋白的关键。l 表达量低 高温诱导 l 易形成包涵体 低温诱导
