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1、基因工程的基本内容9/20/20241基因决定性状（一）vv青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉素青霉素 基因决定性状（二）vv豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮基因决定性状（三）vv家蚕能够吐出蚕丝为人类利用家蚕能够吐出蚕丝为人类利用定向基因改造设想 设想设想一一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌能否让细菌能否让细菌能否让细菌“ “吐出吐出吐出吐出” ”蚕丝蚕丝蚕丝蚕丝？设想设想二二能否让微生物产生出人
2、的胰岛素、干扰素等能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？珍贵的药物？珍贵的药物？珍贵的药物？设想设想三三经过多年的努力，科学家于经过多年的努力，科学家于经过多年的努力，科学家于经过多年的努力，科学家于20202020世纪世纪世纪世纪70707070年代创立年代创立年代创立年代创立了可以定向改造生物的新技术了可以定向改造生物的新技术了可以定向改造生物的新技术了可以定向改造生物的新技术基因工程。基因工程。基因工程概念基因工程：基因工程：在生物体外，通过对在生物体外，通过对在生物体外，通过对在生物体外，通过对DN
3、ADNADNADNA分子进行人工分子进行人工分子进行人工分子进行人工“剪切剪切剪切剪切”和和和和“拼接拼接拼接拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，对生物的基因进行改造和重新组合，对生物的基因进行改造和重新组合，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。胞内表达，产生出所需要的基因产物。胞内表达，产生出所需要的基因产物。胞内表达，产生出所需要的基因产物。基因工程的别名基因工程的别
4、名基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基基 因因操作水平操作水平DNADNA分子水平分子水平基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物基因工程过程示意图从细胞中分从细胞中分从细胞中分从细胞中分离出离出离出离出DNADNADNADNA限制酶截取限制酶截取限制酶截取限制酶截取DNADNADNADNA片断片断片断片断分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒 DNADNADNADNA重组重组重组重组用重组质粒用重组质粒用重组质粒用重组质粒转化大肠
5、杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因基因工程操作的工具1.1.将目的基因片断从人体细胞内提取，将目的基因片断从人体细胞内提取，需要基因的剪刀需要基因的剪刀需要基因的剪刀需要基因的剪刀限制性内切酶。限制性内切酶。限制性内切酶。限制性内切酶。2.2.将目的基因与运载体将目的基因与运载体DNADNA连接，连接，需要基因的针线需要基因的针线需要基因的针线需要基因的针线DNADNADNADNA连接酶。连接酶。连接酶。连接酶。3.3.将目的基因运入大肠杆菌，将目的基因运入大肠杆菌，需要基因的运输工具需要基因
6、的运输工具需要基因的运输工具需要基因的运输工具运载体。运载体。运载体。运载体。限制性内切酶1.1.分布：分布：主要在微生物中。主要在微生物中。主要在微生物中。主要在微生物中。2.2.特特点点：特特特特异异异异性性性性，即即即即识识识识别别别别特特特特定定定定核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸序序序序列列列列， 切割特定切点。切割特定切点。切割特定切点。切割特定切点。3.3.结果：结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。产生黏性未端（碱基互补配对）。产生黏性未端（碱基互补配对）。产生黏性未端（碱基互补配对）。4.4.举举例例：大大大大肠肠肠肠杆杆杆杆菌菌菌菌的的的的一一一一种种种种限限限限制制制制酶酶酶酶能能
7、能能识识识识别别别别GAATTCGAATTCGAATTCGAATTC序列，并在序列，并在序列，并在序列，并在G G G G和和和和A A A A之间切开。之间切开。之间切开。之间切开。 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将序列，并在特定的切割点上将序列，并在特定的切割点上将序列，并在特定的切割点上将DNA DNA DNA DNA 分子切断。分子切断。分子切断。分子切断。目前已发现的限制酶有目前已发现的限制酶有目前已发现的限制酶有目前已发现的限制酶有20020020020
8、0多种。多种。多种。多种。限制性内切酶的作用过程DNA连接酶vv连接酶的作用：将互补配对的两个黏将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整性末端连接起来，使之成为一个完整的的DNADNA分子。分子。vv连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。磷酸二酯键，不是氢键。问题问题问题问题用用用用DNADNADNADNA连接酶连接两个相同的黏连接酶连接两个相同的黏连接酶连接两个相同的黏连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？性未端要连接几个磷酸二酯键？性未端要连接几个磷酸二酯键？性未端要连接几个磷酸二酯键？DNA连接酶的作用过程运载体1.1.作用：作用：将外源基因送入受体细胞。将外源基因送入
9、受体细胞。将外源基因送入受体细胞。将外源基因送入受体细胞。2.2.条件：条件：1)1)1)1)能在宿主细胞内复制并稳定地保存。能在宿主细胞内复制并稳定地保存。能在宿主细胞内复制并稳定地保存。能在宿主细胞内复制并稳定地保存。2)2)2)2)具有多个限制酶切点。具有多个限制酶切点。具有多个限制酶切点。具有多个限制酶切点。3)3)3)3)具有某些标记基因具有某些标记基因具有某些标记基因具有某些标记基因3.3.种类：种类：质粒质粒质粒质粒、噬菌体和动植物病毒。、噬菌体和动植物病毒。、噬菌体和动植物病毒。、噬菌体和动植物病毒。要让一个从甲生物细胞内取出来的基要让一个从甲生物细胞内取出来的基要让一个从甲生
10、物细胞内取出来的基要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个因在乙生物体内进行表达，首先得将这个因在乙生物体内进行表达，首先得将这个因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是因送入细胞的工具就是因送入细胞的工具就是因送入细胞的工具就是运载体运载体。质粒的特点qq细细胞胞染染色色体体外外能能自自主主复复制制的的小小型型环环状状DNADNA分子；分子；qq质粒是基因工程中最常用的运载体；质粒是基因工程中最常用的运载体
11、；qq最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；qq存在于许多细菌及酵母菌等生物中；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；qq质粒的存在对宿主细胞无影响；质粒的存在对宿主细胞无影响；qq质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒的复制只能在宿主细胞内完成。问题问题问题问题要想将某个特定基因与质粒相连，需要几要想将某个特定基因与质粒相连，需要几要想将某个特定基因与质粒相连，需要几要想将某个特定基因与质粒相连，需要几种限制性内切酶和几种种限制性内切酶和几种种限制性内切酶和几种种限制性内切酶和几种DNADNADNADNA连接酶处理？连接酶处理？连接酶处理？连接酶处理？ 基因操作的基本步骤1.提
12、取目的基因2.目的基因与运载体结合3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测和表达提取目的基因vv将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。取取 出出DNADNA用用限制酶限制酶切断切断DNADNA 目前被较广目前被较广目前被较广目前被较广泛提取使用的目的泛提取使用的目的泛提取使用的目的泛提取使用的目的基因有：苏云金杆基因有：苏云金杆基因有：苏云金杆基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰菌抗虫基因、人胰菌抗虫基因、人胰菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰岛素基因、人干扰岛素基因、人干扰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏素基因、种子贮藏素基因、种子贮藏素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗蛋白基因、植物抗蛋白基因
13、、植物抗蛋白基因、植物抗病基因等。病基因等。病基因等。病基因等。提取目的基因的方法（一）vv 直接分离基因鸟枪法 将供体生物的将供体生物的将供体生物的将供体生物的DNADNADNADNA用限制用限制用限制用限制酶切割为许多片段，再用运载酶切割为许多片段，再用运载酶切割为许多片段，再用运载酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生体将这些片段都运载到受体生体将这些片段都运载到受体生体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一物的不同细胞中去。只要有一物的不同细胞中去。只要有一物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因个细胞获得了需要的目的基因个细胞获得了需要的目的基因
14、个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成并得以表达，基因工程就算成并得以表达，基因工程就算成并得以表达，基因工程就算成功了。功了。功了。功了。该法最大的缺点是带有很该法最大的缺点是带有很该法最大的缺点是带有很该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功大的盲目性，工作量大，成功大的盲目性，工作量大，成功大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基率低。且不能将真核生物的基率低。且不能将真核生物的基率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。因转移到原核生物中去。因转移到原核生物中去。因转移到原核生物中去。用限制酶用限制酶用限制酶用限制酶切成许多切成许多切成许多切成许
15、多片断片断片断片断提取目的基因的方法（二）vv 人工基因合成法1.1.逆转录法：以信使逆转录法：以信使逆转录法：以信使逆转录法：以信使RNARNARNARNA为模板，在逆转录酶的为模板，在逆转录酶的为模板，在逆转录酶的为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合作用下将脱氧核苷酸合作用下将脱氧核苷酸合作用下将脱氧核苷酸合成合成成合成成合成成合成DNA(DNA(DNA(DNA(基因基因基因基因) ) ) )。2.2.直接合成法：根据蛋白直接合成法：根据蛋白直接合成法：根据蛋白直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出质的氨基酸顺序推算出质的氨基酸顺序推算出质的氨基酸顺序推算出信使信使信使信使RNARN
16、ARNARNA核苷酸顺序，核苷酸顺序，核苷酸顺序，核苷酸顺序，再据此推算出基因再据此推算出基因再据此推算出基因再据此推算出基因DNADNADNADNA的脱氧核苷酸顺序。用的脱氧核苷酸顺序。用的脱氧核苷酸顺序。用的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合游离脱氧核苷酸直接合游离脱氧核苷酸直接合游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。成相应的基因。成相应的基因。成相应的基因。DNA合成仪PCR扩增仪目的基因与运载体结合vv用与提取目的基因相用与提取目的基因相用与提取目的基因相用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒同的限制酶切割质粒同的限制酶切割质粒同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，使之出现一个切口，使之出
17、现一个切口，使之出现一个切口，将目的基因插入切口将目的基因插入切口将目的基因插入切口将目的基因插入切口处，让目的基因的黏处，让目的基因的黏处，让目的基因的黏处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端与切口上的黏性末端与切口上的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，性末端互补配对后，性末端互补配对后，性末端互补配对后，在连拉酶的作用下连在连拉酶的作用下连在连拉酶的作用下连在连拉酶的作用下连接形成接形成接形成接形成重组重组重组重组DNADNADNADNA分子分子分子分子。提取质粒并用提取质粒并用提取质粒并用提取质粒并用限制酶切割限制酶切割限制酶切割限制酶切割用用用用连接酶将目的连接酶将目的连接酶将
18、目的连接酶将目的基因和质粒连接基因和质粒连接基因和质粒连接基因和质粒连接将目的基因导入受体细胞并扩增vv基因工程中常用的受体细胞基因工程中常用的受体细胞基因工程中常用的受体细胞基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土有大肠杆菌、枯草杆菌、土有大肠杆菌、枯草杆菌、土有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。壤农杆菌和动植物细胞等。壤农杆菌和动植物细胞等。壤农杆菌和动植物细胞等。vv导入受体细胞常用的方法是导入受体细胞常用的方法是导入受体细胞常用的方法是导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌或者病毒侵染细胞借鉴细菌或者病毒侵染细胞借鉴细菌或者病毒侵染细胞借鉴细菌或者病毒侵染细胞的途径。通常
19、还要对一些受的途径。通常还要对一些受的途径。通常还要对一些受的途径。通常还要对一些受体细胞进行增大通透性的处体细胞进行增大通透性的处体细胞进行增大通透性的处体细胞进行增大通透性的处理。理。理。理。vv目的基因可以随着受体细胞目的基因可以随着受体细胞目的基因可以随着受体细胞目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的进行快速的繁殖，在很短的进行快速的繁殖，在很短的进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大量的基因。时间内获得大量的基因。时间内获得大量的基因。时间内获得大量的基因。将将将将目的基因导目的基因导目的基因导目的基因导入受体细胞入受体细胞入受体细胞入受体细胞将将将将受体细胞受体细胞受体细胞
20、受体细胞进行扩增进行扩增进行扩增进行扩增目的基因的检测和表达（一） 前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。 细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一淘汰
21、无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。步培养、研究。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物目的基因的检测和表达（二）v多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到明摄入了抗虫基因并得到表达。表达。北京腾图文教电子发展有限责任公司几种限制性内切酶DNA连接酶的作用过程返返返返 回回回回DNA连接酶的作用原理返返返返 回回回回质 粒返返返返 回回回回目的基因与质粒的连接返返返返 回回回回
