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1、第十章第十章 中药制剂分析中中药制剂分析中新方法与新技术新方法与新技术 1 现代色代色谱技技术v顶空气相色谱法液上气相色谱法、顶空气相色谱法液上气相色谱法、顶空分析法顶空分析法v 对样品基质上方的气体成分进展对样品基质上方的气体成分进展GC分析来测定这些组分在原样品分析来测定这些组分在原样品中的含量中的含量v顶空气相色谱的分类顶空气相色谱的分类v静态顶空静态顶空GCv动态顶空动态顶空GC 1 现代色代色谱技技术v顶空气相色谱法顶空气相色谱法v主要特点主要特点v样品前处置简单样品前处置简单v检测限低检测限低v可分析含量低、组成复杂的样品可分析含量低、组成复杂的样品v适用于易挥发或易分解或无法直接
2、进样适用于易挥发或易分解或无法直接进样分析的液体或固体样品的分析分析的液体或固体样品的分析 1 现代色代色谱技技术v顶空气相色谱法顶空气相色谱法v运用实例运用实例静态顶空静态顶空GC(GC(内标法内标法) )测定血液中乙醇含量测定血液中乙醇含量对照品溶液的制备对照品溶液的制备 将将10g/l10g/l的乙醇贮藏液稀释的乙醇贮藏液稀释1010倍，精细汲取此倍，精细汲取此液液1ml1ml置于置于10ml10ml顶空样品瓶中，同时精细加顶空样品瓶中，同时精细加1ml1ml内标溶液内标溶液0.25%0.25%的正丙醇水溶液，迅速密封，即得。的正丙醇水溶液，迅速密封，即得。样品制备样品制备 精细汲取精细
3、汲取1ml1ml充分混匀的血样转移至充分混匀的血样转移至10ml10ml顶空样品瓶中，顶空样品瓶中，同时精细加同时精细加1ml1ml内标溶液内标溶液0.25%0.25%的正丙醇水溶液，迅速密封，的正丙醇水溶液，迅速密封，即得。即得。 色谱条件色谱条件 略略顶空分析条件顶空分析条件 平衡温度为平衡温度为5050，平衡时间为，平衡时间为1010分钟快速搅拌下，分钟快速搅拌下，阀、保送管及定量管温度为阀、保送管及定量管温度为8080，加压为，加压为13.8kPa13.8kPa，加压时间、充，加压时间、充样时间和压力平衡时间均为样时间和压力平衡时间均为0.150.15分钟，定量管为分钟，定量管为1.0
4、ml1.0ml。 1 现代色代色谱技技术v超高效液相色超高效液相色谱UPLC，Ultra Performance Liquid Chromatographyv主要特点主要特点v固定相固定相v双三乙氧基硅乙双三乙氧基硅乙烷在硅胶中构成在硅胶中构成桥式乙基基式乙基基团v颗粒粒度小，粒粒度小，仅为1.7mv耐耐压，颗粒度分布范粒度分布范围很窄很窄v装柱装柱v检测器器v呼呼应快快v样品池品池10mm的光程与普通的光程与普通HPLC一一样而体而体积只需只需500nL普通普通HPLC的的20分之一分之一 v优点点v更高的分析速度，更好分更高的分析速度，更好分别效果和更高的灵敏度，速效果和更高的灵敏度，速度
5、、灵敏度及分度、灵敏度及分别度，分度，分别是是HPLC的的9倍、倍、 1.7倍及倍及3倍倍 1 现代色代色谱技技术v超临界流体色谱超临界流体色谱SFC, supercritical fluid chromatographyv以超临界流体低黏度、高密度以及较高的以超临界流体低黏度、高密度以及较高的分散系数作为流动相。分散系数作为流动相。v对对GC及及HPLC的检测器均可兼容运用的检测器均可兼容运用v适用于分析适用于分析GC难以处置的高沸点、不挥发性难以处置的高沸点、不挥发性样品样品v分别速度较分别速度较HPLC，分别效果更好。，分别效果更好。v运用实例运用实例v超临界流体色谱法测定怀牛膝制剂中齐
6、墩果超临界流体色谱法测定怀牛膝制剂中齐墩果酸的含量酸的含量 1 现代色代色谱技技术v色谱联用技术色谱联用技术v多维色谱多维色谱v如：二维薄层色谱等如：二维薄层色谱等v气相色谱气相色谱-质谱联用技术质谱联用技术v气相色谱气相色谱-红外光谱联用技术红外光谱联用技术v液相色谱液相色谱-质谱联用技术质谱联用技术 2 高效毛高效毛细管管电泳泳(HPCE,high performance capillary electrophoresis)v电泳泳: : 在在电解解质溶液中，位于溶液中，位于电场中的中的带电离离子在子在电场力的作用下，以不同的速度向其所力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的荷相反的电极
7、方向迁移的景象。极方向迁移的景象。v 由于不同离子所由于不同离子所带电荷及性荷及性质的不同，迁移的不同，迁移速率不同，可速率不同，可实现分分别。v19371937年年 Tiselius ( Tiselius (瑞典瑞典) ) 利用自在溶液利用自在溶液电泳泳将人血清提取的蛋白将人血清提取的蛋白质混合液分混合液分别出白蛋白和出白蛋白和、球蛋白球蛋白v19811981年年 Jorgenson Jorgenson 和和 Luckas Luckas 开展了高效毛开展了高效毛细管管电泳分泳分别分析技分析技术 ( (运用运用75m75m内径石英毛内径石英毛细管和采用了高达数千伏的管和采用了高达数千伏的电压)
8、 )， 2 高效毛高效毛细管管电泳泳 各种各种电性离子在毛性离子在毛细管柱中的迁移速度管柱中的迁移速度为： + =电渗流渗流 + +ef 阳离子运阳离子运动方向与方向与电渗流一致渗流一致 - =电渗流渗流 - -ef 阴离子运阴离子运动方向与方向与电渗流相反渗流相反 0 =电渗流渗流 中性粒子运中性粒子运动方向与方向与电渗流一致渗流一致 可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分别v分别原理分别原理v 电场作用下，电场作用下，毛细管柱中出毛细管柱中出现：电泳景象现：电泳景象和电渗流景象。和电渗流景象。v 2 高效毛高效毛细管管电泳泳v仪器安装仪器安装v电压：电
9、压：0 030KV30KV。v分别柱不涂敷任何分别柱不涂敷任何固定液，固定液，v紫外或激光诱导荧紫外或激光诱导荧光检测器光检测器v可检测到：可检测到：10-1910-1910-21mol/L10-21mol/L 2 高效毛高效毛细管管电泳泳v主要特点主要特点v优点优点v高分辨率：实际塔板数高达数百万块，高分辨率：实际塔板数高达数百万块，甚至数千万块。甚至数千万块。v高灵敏度：可检测出低至高灵敏度：可检测出低至10-21mol/L10-21mol/L浓浓度的物质。度的物质。v高分析速度：可在高分析速度：可在3 3分钟内分别分钟内分别3030种阴离种阴离子；子；1.71.7分钟分别分钟分别1919
10、种阳离子种阳离子;4;4分钟可分分钟可分别别1010种蛋白质种蛋白质. .v试样用量少：仅需几试样用量少：仅需几nLnL10-9L10-9L的试样的试样v仪器简单，操作本钱低：分析一个试样仪器简单，操作本钱低：分析一个试样仅需几毫升流动液仅需几毫升流动液 2 高效毛高效毛细管管电泳泳v常见的毛细管电泳方式常见的毛细管电泳方式v毛细管区带电泳毛细管区带电泳(CZE)(CZE)v毛细管胶束电动色谱毛细管胶束电动色谱(MECC)(MECC)v胶束作为假固定相的电动色谱胶束作为假固定相的电动色谱v毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳(CGE)(CGE)v凝胶作为支持物，起分子筛的作用凝胶作为支持物，起分子筛的
11、作用v毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳(CIEF)(CIEF)v用于蛋白质、多肽等两性物质的分别用于蛋白质、多肽等两性物质的分别v毛细管等速电泳毛细管等速电泳(CITP)(CITP) 2 高效毛高效毛细管管电泳泳v运用运用v离子分析离子分析v药物分析药物分析v手性化合物分析手性化合物分析v氨基酸分析氨基酸分析v核酸分析及核酸分析及DNA测序测序vHPCE在中药制剂分析中的运用在中药制剂分析中的运用v生物碱的测定、动物类药材的鉴别、指生物碱的测定、动物类药材的鉴别、指纹图谱纹图谱高效毛高效毛细管管电泳法泳法测定心舒口服液中腺苷、芦丁和定心舒口服液中腺苷、芦丁和阿魏酸的含量阿魏酸的含量对照品溶
12、液照品溶液 略略供供试品溶液的配制取心舒口服液品溶液的配制取心舒口服液10 mL，加，加热浓缩至至约1 mL，加，加60 %甲醇定容甲醇定容10 mL，冰箱放置，冰箱放置过夜，夜，经0. 45 mm滤膜膜滤过备用。用。电泳条件以熔融石英毛泳条件以熔融石英毛细管管( 50 mm 66 . 5 cm，有效分，有效分别长度度58 cm) 为分分别通道，以通道，以105 mmol/L硼砂液硼砂液为运运转缓冲液，冲液，压力力进样50 mpa，6 s，毛，毛细管柱温度管柱温度为20 ，运，运转电压为0 30 min : 24 kV，30 60 min : 28 kV，检测波波长为210 nm，毛，毛细管柱
13、运用前以管柱运用前以0.1 mol/L 氢氧化氧化钠溶液、注射溶液、注射用水和运用水和运转缓冲液依次冲洗冲液依次冲洗5 ,5 ,8 min，每次，每次电泳泳后以运后以运转缓冲液冲洗冲液冲洗8 min 。在此条件下，同。在此条件下，同时测定腺苷、芦丁和阿魏酸的含量。定腺苷、芦丁和阿魏酸的含量。隋印等隋印等. 中国医院中国医院药学学杂志志. 2019, 25(3):232-234 3 原子吸收光原子吸收光谱AAS,atom absorption spectrometryv任任务原理原理v1 1各种元素的原子构造和外各种元素的原子构造和外层电子排布子排布不同，不同，v 基基态第一激第一激发态: :
14、v 跃迁吸收能量不同迁吸收能量不同具有特具有特征性征性v 2 2各种元素的基各种元素的基态第一激第一激发态v 最易最易发生，吸收最生，吸收最强，最灵敏，最灵敏线。特征。特征谱线( (共振共振线) )。v 3 3利用待利用待测元素的原子蒸气中基元素的原子蒸气中基态原子与共振原子与共振线吸收之吸收之间的关系来定量分析。的关系来定量分析。 3 原子吸收光原子吸收光谱v任务原理任务原理 3 原子吸收光原子吸收光谱v原子吸收光原子吸收光谱仪v锐线光源光源空心阴空心阴极灯极灯 3 原子吸收光原子吸收光谱v原子吸收光原子吸收光谱仪v原子化系原子化系统将将试样中离子中离子转变成原子蒸气。成原子蒸气。v原子化方
15、法原子化方法v火焰法火焰法v无火焰法无火焰法电热高温石墨管，激光高温石墨管，激光v冷原子化法冷原子化法v单色器色散元件棱色器色散元件棱镜、光、光栅，凹凸，凹凸镜、狭狭缝等等v检测系系统光光电池、光池、光电倍增管、光敏晶体管倍增管、光敏晶体管 3 原子吸收光原子吸收光谱v优缺陷缺陷v优点：原子化程度高，点：原子化程度高，试样用量少用量少1 1100L100L，可，可测固体及粘稠固体及粘稠试样，灵敏度高，灵敏度高，检测限限10-12 g/L10-12 g/L。v缺陷：精缺陷：精细度差，度差，测定速度慢，操作定速度慢，操作不不够简便，安装复便，安装复杂。 4 中中药指指纹图谱 从整体上评价中药的内在
16、质量中药指纹图谱建立的原那么尽能够多的覆盖全貌特征明显，专属性强，重现性好方便操作与运用 4 中中药指指纹图谱v中中药化学指化学指纹图谱鉴别v规范范图谱的建立的建立v中中药材的材的选择v 选用用经种种类鉴定的正品定的正品优质地道地道药材，确定材，确定图谱的特征参数。另搜集多的特征参数。另搜集多产地，具充分代表性，符合地，具充分代表性，符合药用用规格的格的样品，品，对图谱特征的重特征的重现性性进展展调查。随。随之搜集一些易混淆或曾出之搜集一些易混淆或曾出现的的伪品，以品，以所确定的特征假所确定的特征假设能加以区能加以区别和和识别，那么更那么更为理想。理想。v实验样品的制品的制备v 可根据可根据药
17、材所含成分材所含成分选定，尽能定，尽能够思索思索对不同成分的兼容性，通常用不同不同成分的兼容性，通常用不同极性的溶极性的溶剂2 23 3种，制成供种，制成供试品，供一品，供一组图谱综合合鉴定运用。定运用。v 留意取留意取样代表性与均匀性。代表性与均匀性。 4 中中药指指纹图谱v中药指纹图谱鉴别中药指纹图谱鉴别v规范图谱的建立规范图谱的建立v检测方法检测方法v现代光谱红外光谱，紫外光谱现代光谱红外光谱，紫外光谱v色谱气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱、毛细管电泳色谱、毛细管电泳v其它其它X X光衍射光衍射 4 中中药指指纹图谱v中药指纹图谱鉴别中药指纹图谱鉴别v指纹
18、图谱的解析指纹图谱的解析v研讨指纹图谱中特征信号的归属研讨指纹图谱中特征信号的归属v各指纹图谱的相关性研讨各指纹图谱的相关性研讨v直观比较直观比较v相对指数、重叠率、八强峰等量化数据相对指数、重叠率、八强峰等量化数据v计算机辅助中药指纹图谱类似度计算软计算机辅助中药指纹图谱类似度计算软件件 4 中中药指指纹图谱酸醇提取液中紫外吸收成分的HPLC 分析=254 nm二甲亚砜提取液中可见吸收成分的HPLC 分析=451 nm体外培育牛黄与天然牛黄指纹图谱的比较研讨(丁岗等. 中国天然药物, 2019,2(5)309-3125 其他技术v 用生物检定法来评价中药质量用生物检定法来评价中药质量v例例1
19、：用生化目的评价中药质量与药效相：用生化目的评价中药质量与药效相关性更关性更v 为亲密，以淀粉酶活力比较测定鸡为亲密，以淀粉酶活力比较测定鸡内金、内金、v 鸽内金、鹌鹑内金的比活力，提出鸽内金、鹌鹑内金的比活力，提出了量化了量化v 数据。数据。例例2：利用大蒜提取物中大蒜辣素和大蒜新：利用大蒜提取物中大蒜辣素和大蒜新素具素具v 有抗菌作用这一特点，用生物检定有抗菌作用这一特点，用生物检定方法进方法进v 行检测，结果与气相色谱法测定结行检测，结果与气相色谱法测定结果一致。果一致。5 其他技术v DNA分子遗传标志技术v DNA分子-遗传信息的直接载体，v 物种鉴别更为准确可靠v 90年代，PCR (Polymorase Chain Reaction)技术，快速而灵敏地检测v DNA多态性v 近年来，基于PCR的RFLP、RAPD、SSR、AFLP等检测DNA多态性的v 分子标志技术DNA指纹技术。v运用：在药材鉴定方面v 中药材地胆草与白花地胆草混淆品，v 西红花及其混淆品和伪品川红花、莲须、玉米须、黄花菜v 乌梢蛇及其混淆品、金钱白花蛇及其伪晶v 牛鞭、驴鞭与梅鞭
