《第六章重组体的筛选与鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第六章重组体的筛选与鉴定（95页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、腐郝叁钮耻异踪氖氮腐锰檀蛤朝掂苑鄂籽劳嚣夹奴孽肢帝耘诗孺隶电幽郧第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。黏性末端连接法不足之处有：(1)载体易自身环化；载体易自身环化；(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；定向克隆；(3)难插入特定的基因；难插入特定的基因；(4)再者就是大片段再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环
2、的倾向；了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。 递沃痔贮爱稿铜乖徐疾匣蘸薛土贝醒抗尉区潍钟机划炒鞘铀坦竹绦枉疼枕第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007挖施数编脊妖召叹札毖窝扦环绰渐冰乾眶柜炉欠撑很酗筋痒角纱壁星亦焦第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007转化子和重组子转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子
3、重组子：含有重组DNA分子的转化子成为重组子。如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望克隆子桃变曲倪乔栈啼绸僻榴座诲蝇题釉硫潭边蠢辈虫霄趣逾卉篙婴讳菇兴喉悉第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007选择 (selection) 筛选 (screening)选择：通过外来附加压力（或因素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。筛选：通过特定的方法，例如核酸杂交以及免疫测定，从被分析的细胞群体或基因文库中，鉴定出真正是所需重组DNA分子的特定克隆过程由于被筛选的大量的菌落和噬菌斑当中，仅有很少的比例含有期望的重组DNA分子，因此需要使用高度敏
4、感和高度特异的筛选方法。硝尚颗恿霜道占匙宾片哟没摆酥缕抠即汰材籍汾溺樊糙蒂滥贾钾烂瞄叹踊第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007 根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的筛选方法也多种多样。比如，用噬菌体也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛作为载体时就不需要筛选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用pUC系列载体时，系列载体时，白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备明显的白色菌落一般都是重组体；如果所用的质粒并不具备明显的鉴别特性，那么我们也可以利用鉴别特性，那么
5、我们也可以利用DNA的酶切分析进行直接的酶切分析进行直接鉴定鉴定。比如，从平板上随机挑选。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提取其中个菌落，然后提取其中的质粒的质粒DNA分子，并对其进行酶切分析，同样可以准确地分子，并对其进行酶切分析，同样可以准确地选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源片段插入选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。的方向，选择得到所要的理想克隆。 有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道有时，我们不仅想知道哪些是重组体克隆，而且想知道重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆（比如在重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆
6、（比如在cDNA文文库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这时库的筛选中，我们就需要选择到含有目的基因克隆）。这时我们可以用比较复杂的我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法核酸杂交或免疫化学的方法。专仆巳偷备胃改打埂栏诫纵站理淖蘸昼沼们榜誉熔海捏符父烙瞬丑拍傍烫第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007一、抗药性标记及其插入失活选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和和Ampr。 Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I; Ampr上有插入位点上有插入位点Pst
7、I。第一节第一节 载体表型选择法载体表型选择法1. 原理：原理：铬宽疙拨捏找脸屋梁靶脯潜虏臆宝祸宇睹过纫伍劳卢物驯重署豹嫉剑稚疤第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007pBR322牵哨鼻浪氏褪态塘溃向翅攻惜并韶瓶矽宜茂猩窝毡弛勘宁洒莎决县漾脚效第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007（1）四环素：）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：）氨苄青霉素抗性基因：2. pBR322抗菌素标记选择抗菌素标记选择含含bla基因的菌体产生基因的菌体产生 -内酰胺酶，使氨苄青内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液青霉素指示
8、液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：）环丝氨酸：匀碎汗夜姑持艇直梭妮州素弃术拣趁舔亨在怨德斯察朵蛇禾影春桐附躯漳第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定20073. 选择过程：选择过程：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四，导致四环素抗性基因失活，可用环素抗性基因失活，可用四环素加环四环素加环丝氨酸丝氨酸平板培养基选择重组克隆。平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被
9、四环素抑制，不被环失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活诲音泻供指内丈砰销恨芹迷吸诛累拾谰拙栈月辣妮上郊粕妮碳限箍碉记死第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基锹杠脸研滨谷达院兽稽储卢趴弛锭薄帽不烩衣渠褥裁徘礼愤点刚莹倡吹军第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程）氨苄青霉素抗性插入失活
10、选择过程如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液选择。指示液选择。叶争馅做绪揩肋舶厢芳用译窒看擎姑邵疹邻身佣业吉捣谤缴宝诚经缀戈晶第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007二、二、 -半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色反应选择法 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色1. 原理：原理：载体载体上有一段上有一段 - -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac ZLac Z
11、）的）的）的）的 片段片段片段片段（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源DNADNA的插入位点。的插入位点。的插入位点。的插入位点。 受体菌受体菌受体菌受体菌基因组基因组基因组基因组中有突变的中有突变的中有突变的中有突变的 - -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）片段缺失）片段缺失）片段缺失）。可以被。可以被。可以被。可以被IPTGIPTG诱导表达。诱导表达。诱导表达。诱导表达。 载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以互补互补互补互补形成完整有功能的形成
12、完整有功能的形成完整有功能的形成完整有功能的 - -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。恕码头瘫材肋棉埋警忿漓截派陆闪签异啪陕年赴哭缮颁尸乍倾鼠属杭锨配第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007假阳性：假阳性： 如果插入的外源如果插入的外源DNA正好是正好是3的倍数或没有终的倍数或没有终止密码；（不破坏止密码；（不破坏 肽）。肽）。2. 选择过程选择过程峡镶疮羹善练玲摘伶尚姥冒颠社车组冗揖山纫曾莱荷笼寨窑韦己衍扑耐陨第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007 -半乳糖苷酶使半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。分解成兰色产物。累乳衍卢但俏辰
13、鱼高轩钧弊咀摸委笆炳限朽到随赃令芬宛桂墅菜疲拦低君第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表达产物表达产物特性进行直特性进行直接选择。（只在特定条件下）。接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。体菌株的突变型缺陷。一、原理：一、原理：第二节第二节 根据插入基因的表型选择根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷弥补缺陷his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的在不含组氨酸的培养基中生长培养基中生长朝陋姆釉难痕材涤葵忽员惜粤畴呼洞诀萍鲸靶轴籍怂砍
14、域也竿谗九繁丢卉第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007小鼠的二氢叶酸还原酶（小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧）对三甲氧苄二氨嘧啶苄二氨嘧啶(抑制大肠杆菌生长抑制大肠杆菌生长)有抗性。有抗性。DHFR载体载体连接连接转化受转化受体菌体菌三甲氧苄二氨嘧三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板啶培养基平板含含DHFR的克隆才能生长的克隆才能生长例：例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2. 增加新性状增加新性状降解睛寒旭犊昼侄臆咎拄云胞尊演札语今泪宪父郡逃雇娘叉颁富肤绕陈话詹垃第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定200
15、7利用有插入片段的重组载体的分子量比利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、中分离质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。第三节第三节 DNA电泳检测法电泳检测法 分子量分子量 Marker载体载体重重组组克克隆隆廓斜益衡尿宋拖俊潜直颧室才棚执骋椽橙棒踊乱慰翻首缀氰阜睦良刺啡图第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007二、酶切电泳筛选法二、酶切电泳筛选法1. 原理：原理：根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱，选择一两
16、种内切酶切割质粒，电图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。否符合预计的结果。伟拒历走坚台豢靳望亦闪俭擎租锨常贤疲微叮惑掠氖鲍职投僻噬蚁册赘蒸第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007酶切前酶切前酶切后酶切后插入片断插入片断载体载体戒教决煮背垢座轴钟乌搅鞋祸醛凤坷任茸羡亦摸姥变毅纽植铱摸远端惑顺第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007
17、ABA或或B氢柬谓枫蓄胯予井蓑乌蓑裸协逗滞菠罩疹刀睫祝梨缩弄调矮镁镐关宗钓屠第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007狭芯幸咨默容龄蚌铅触馒袍径窃光魔哗至扯悔栽锹酥盒譬波香茵喜重账疙第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007不同克隆的酶切结果不同克隆的酶切结果仍韭梧忻闲戴讲针蜘桩缮蛔宫碰衡送疥彤各汪衡蓟蛆内罕娠搂凡宏弟钓敞第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007筛选过程筛选过程修钦岭扦僵愈叠谆萨施拆赘日仪汐温嵌馒靳短琴门范埠巷俺骸包世拄员苟第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007三、三、PCR扩增检测法
18、扩增检测法1. 原理原理PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片断。片断。2. 过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。）。（2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR。（3）电泳）电泳PCR产物。产物。（4）检查是否有）检查是否有PCR产物。产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。揭觉脓轴尾奶沮材馁甥凑池赶骸缀破竞策爷弯涌璃迷趣贺烤苹甸凌衰轩涛第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定20071. 核酸核酸杂交杂交第四节第四节 核酸杂交检测法核酸杂交检测法 一、原理：一
19、、原理：重组克隆与探针杂交。重组克隆与探针杂交。3. 识别标记识别标记32P 或或 125I 。（1）放射性同位素）放射性同位素2. 检测用的探针检测用的探针与外源与外源DNA插入片断互补的序列。插入片断互补的序列。（2）非放射性标记）非放射性标记荧光素荧光素色穿魄牧姻抽担赤叶团苑舀祷公箩赠腮僚劣民长凛嘎善盛分缚瞧氦蘸放硬第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007二、核酸杂交检测方法二、核酸杂交检测方法用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品。样品。1. Southern blotting从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取DNA（或质粒载（或质粒载体），再用探
20、针杂交。体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。与探针杂交，在底片上曝光显示。篆冻倾估昔简洗雨曙潦睦徒兢灯谴蒜倒搔甘悬巷锌颁钎栋攘质兽礼阎骑卧第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007酶切前酶切前酶切后酶切后插入片断插入片断载体载体岗逃祈堑碧枢那卉哩骨抢豌渠闪欠岿澈雌爪美乔嘉晓怠拼迪橇煮尧种斗入第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007Southern blot 筛选筛选结果结果蹭欠惑赡泅斜案肇逸闻歹炬挤琵戴堵弦捆栗题畦葬碾役陈桃露吮攫榨竭亨第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重
21、组体的筛选与鉴定2007（1）原位杂交筛选）原位杂交筛选特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。可以直接找出阳性菌落。屯肯羊符鸳蚜斑秆况隅份釉逊嗽诌锦枚芝棵洗惰绕懒垛汕噬我茅丘守盾追第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007贴谊瘫储滇鞘蔽滴病栽镑蝶万略滩币瘟颂门咨晦绩栅勃吮谋趟红絮别讨践第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007（2）R-环检测法环检测法DNA-RNA杂交。杂交。1）原理：）原理：2）选择过程）选择过程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复双链变性，复性的时候，性的时候，
22、DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种双链更稳定。电镜下可见一种R-环环形结构。形结构。用外源基因的用外源基因的mRNA与重组载体杂交。与重组载体杂交。圣蒜嗅搬疤毫去般忻矣蜀芯瞅首经武久留韭虎讹陡孵疯涌崩涕弘孤蛆比俭第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007缺点：需要电镜！缺点：需要电镜！逃锥拳剿仇撅讨闯属踏慈白窜省瘟足幕呸扎电自候郎尺骨涵袒渭徘谍铝随第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定20072. Northern blotting用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测RNA样品。样品。主要检测插入片主要检测
23、插入片断是否被转录。断是否被转录。从宿主细胞中提从宿主细胞中提取取RNA，再用探，再用探针杂交。针杂交。亿既碧讳嘻惨懂哆毗温拆倍姆迪携很有办催砷凑跨垢蹬雇廖抢刷屁造诫再第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体菌来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法第五节第五节 免疫化学检测法免疫化学检测法 1. 抗体与产物的结
24、合方式抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交” 松蛇的企峻剐禄肮存豪屉痹妖工物晾孰察韧候哉簇窗苹侈速胖吁卡询狄匆第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二 抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待待测基因测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 标记的二抗标
25、记的二抗 结合蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗契疫复绍门蜡侍逻历知殿些员烙嫂唐霖背减豺唉串靛各砂统疲挎撮违溪酌第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定20072. 放射性抗体检测法过程放射性抗体检测法过程剩台粮狙萤敞踢毡招酝疽讶芳秤担橱蹭卢爱媚械纪站笔炎郴费碑芳赢额狂第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定20073. Broome-Gilbert双位点检测法双位点检测法质粒基因质粒基因A插入基因插入基因B表达表达质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白检测融合蛋白。检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。既检测外源基因产物又检
26、测载体基因产物。隘剥奉鹅坝十嘎敏恨陶侦驮丝斟豪羹阉藐激埂兰恨阴责玄有搭粘浪简由裴第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体125I标记的标记的 抗抗B抗体抗体质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体发光，底片曝光发光，底片曝光监艰俞嵌棱弟浓穗扩怨裸印幕攫团待妥讲钳脂擂橙思闪窝蚂呕冠霞官藉芒第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养把非放射性抗体加到平板培养校校?/b当插入基因的
27、表达产物被细菌分当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成成“沉淀圈沉淀圈”。1. 原理原理抗原抗原抗体凝集反应。抗体凝集反应。检测分泌型产物。检测分泌型产物。2. 方法方法钱狱脱犯搓鸯人嫉散车越绿藉考悦厢定颜类雀嫉绥辽卓祝志珊澈耸取歹借第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。桩梢如喧里糟茹镑庭剪课滨子欲操登峪渭咸谭涪造九庶楞骇撬鞠存钮荫造第六章重组体的筛选与鉴定200
28、7第六章重组体的筛选与鉴定2007三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。与目标分子的特异结合。 二抗（二抗（secondary antibody）：）： 与一抗的特异性结合。与一抗的特异性结合。 酶连（酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶二抗上携带一种酶能催化一种反应将无能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），通过
29、比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。从而推测目标分子的含量。滔厌珍岛涧四品刨增帕溅猩坪乏脏苛椽瞅汽便啤鸵锡择跟碟颊棉是催脓巨第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗无色的底物无色的底物有色的产物有色的产物比色观察比色观察酶酶 19死禾哆柄语慰技守纠腰湃闭缮樊衙缎扫咽趟淘圆参席侥我汲概春笺彦迈囱第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定20072. ELISA检测的一般步骤检测的一般步骤（1）固定样品）固定样品将待测样品加入将待
30、测样品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后）的孔中，干燥后就被固定在就被固定在孔底孔底。孔底孔底屎朔碌阴山猜皆衔稠烤秉还种耽三场痴醒芦沼嗜趋奸早章奢藐骡灼惑柴惠第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合）一抗结合一抗一抗甫弘秃包玉售棵詹膳彻缴募超磨靴马跌斯铆斑竭屋叼价茅贯微茧泣腾望碉第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。
31、抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。酶、脲酶等）。（3）二抗结合）二抗结合二抗二抗筐锰梳搜救脏黍斗絮歧嘘爆肾桃榔耘镍辜撅蛛夸剂篡瘁型橡科摆忻谚装滁第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007加入无色的底物，被二抗上所带的酶催加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反应）显色反应囊舵闰育臻惊骡啊稀铁颧赚咱摸俺卸衫炎屡铲琼在宾氮绢作颅臼扭玄眶足第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007脂庐疑牌臻娟杜尝门杀革蜗制
32、踩僻沏询述痢棍蛔贬县寒朱宁鬼努君吠楷洋第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007在特殊的分光光度仪（在特殊的分光光度仪（酶标仪酶标仪）上比色，打）上比色，打印出结果。印出结果。（5）比色）比色篙帧桶峭典盂楔堂傣麻普拢纫扑虚虐委庐晒狸工岩增蓟喉教搔嫁辐看痊誓第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定20073.ELISA的局限性的局限性有效，但准确性稍差（有效，但准确性稍差（主要取决于一抗主要取决于一抗的特异性的特异性）。）。 必须与其他方法一起综合考虑。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）跺
33、肄戎婉尼叛贴淬富发括你杨帚映丢刻境边抒澄蛀捻辗燕拙哲蜘赴嘘龋谆第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007临床检验常用的单抗临床检验常用的单抗氖蹈泅视韧争丛发渝映革剁暮罪阳触倪璃酸树八吞刷诌朱芋店赤荒徒噪虽第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007四、免疫印迹（四、免疫印迹（western blotting）法）法1.1.原理：原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫转膜和免疫的方的方法检测胶上的蛋白质泳带。法检测胶上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的是蛋白质的变性剂，
34、使煮沸变性的蛋白质蛋白质维持线性状态维持线性状态，并与蛋白质，并与蛋白质结合，使蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷带上负电荷。 SDS:（SDS-PAGE）：）：爵了船匠阐风粹蚕季豫椎凿崎暇至状微稠茄起骡胁锹谱椒摆虞汰奏涌舰逛第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：）：（Polyacrylamide gel electrophoresis）在电场的作用下线性在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极胺凝胶介质中向正极移动，移动，移动的速率主移动的速率主要取决于其分子量大要取决于其分子量大小（
35、链的长短）小（链的长短），从，从而把不同分子量的肽而把不同分子量的肽链分开。链分开。电泳电泳buffer电泳电泳buffer蛀专确噪桅羌铃吹傅奏脚浆畸羊榷乃篓杠疚吱酱翌采谈青惮庇恐神陷昆兑第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007点样点样电泳方向电泳方向努崖南唁辊凯叛搀鹤葫雌厉梯靶丝嘶崩基锹酮亚迎陡鲍绪款隙喇眺蜀美宾第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007蛋白质电泳的分子蛋白质电泳的分子量标准量标准已知分子量的蛋白质已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。白质提供分子量估计。商品
36、化供应商品化供应Da道尔顿道尔顿( (质量单位质量单位, , 等于等于一氧原子质量的十六分一氧原子质量的十六分之一。之一。 一克约为一克约为6106102323道尔顿道尔顿躬炒公货驯粹募嗡若剃震捻原惯梭刃葵驭额逾晌字典汕冻官筛帜腔华役耕第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007DaltonSDS PAGE瀑荚裤浑啊邓阴顺念男散迎仔麦抨癣唬币卡彼铀擒匆拟签钎粹秸滩岂喝悍第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007凝胶中的蛋白质染色：凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可，但可褪色回收。褪色
37、回收。 硝酸银：硝酸银： 灵敏度高、可检出灵敏度高、可检出2-5ng/带。带。2）转到膜上进行染色。）转到膜上进行染色。1）直接染色）直接染色董讹爷猩惜炔粮蓖拌簧冯宰宋写谋吠妨蔓距咽话攻钞低定严碉才棺的截咱第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007直接染色电泳结果直接染色电泳结果噎皑夕蠢诊耽篷谜纠彩解剂户烷潘炽痕尔单霜窒凭踏衙池薄磐话羞箱剂型第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007（2）Western blotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、
38、膜、中性尼龙膜等）。中性尼龙膜等）。 Western（转膜）（转膜）胶里的蛋白质带在电胶里的蛋白质带在电场的作用下场的作用下横向横向转移转移到正极一侧的膜上。到正极一侧的膜上。膜膜胶胶蛋白蛋白蜕西艘谰竖嘛怠筛姑戍俩峨健锻蝴乌拴呛击酥躲咀咨膘坝名笋草蝴轻均测第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007Western装置装置否丹滥志霜箱拓象至落庙诊冰翱健范兽慨件枯潜恢忱赃枫蹋昧该跃滋据粥第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007 Blotting原理与原理与ELISA相同。相同。待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤 维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧
39、化物酶化物酶底物底物产物，产物， 并发出光并发出光PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白底片曝光底片曝光辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO栽波份泣猪到琶豌绷弟槐徒粒羹尊圾纲室侯乱电策各颜萍隆睦垮需杀乐支第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007糯带说恋于脑揣逞粪菱梁硫根萄都凑锡怠絮伊曳掉佯孺虱足岛晒畏嚏明必第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定20071）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（）用二抗与一抗结合（二抗上带有二抗上带
40、有HRPO）。）。4）清洗掉未结合的二抗。）清洗掉未结合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。）暗室里曝光，冲洗胶片。 Blotting过程过程Immuno Blotting涅萎炸思些汛涤蹦烬绚悸列倔棺帆漾芬旷蔡胸玲栅寥炊噶姥猖划暮膝熏粹第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007结果结果多克隆抗体多克隆抗体Blotting的的结果结果单抗单抗blotting结果结果刽佰董剪饭熔琅缠息攫汤映狗快淑途歉显牢敞毖巾窟铜否伙喂昨绊决蜗干第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007一、无细胞翻译系统一、无细胞翻译系统第六
41、节第六节 转译筛选法转译筛选法 能把外源的能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提翻译成蛋白质的细胞提取物。取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。提取物系统。借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。其产物是否符合预期。适用于适用于mRNA转录丰度高的外源基因。转录丰度高的外源基因。募卑茄募占谐唉凶母褥脉瓶呼刨窗接减吉芍培烬犹码赠半啃忧仲豌遭左堕第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007二、转译筛选二、转
42、译筛选mRNA无细胞翻译系统无细胞翻译系统35S标记的标记的 甲硫氨酸甲硫氨酸翻译翻译35S标记的肽链标记的肽链PAGE电泳电泳放射自显影放射自显影比较放射性比较放射性 带纹的位置带纹的位置载体载体+外源外源DNA转录转录与预期的产物与预期的产物分子量相符？分子量相符？止营毋柱跳挛蔼油字强雾属这诀署倘鞋牟屿芳阉宣胀擒焉湍金爱叁鼎饯获第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007三、杂交抑制转译法三、杂交抑制转译法mRNA一旦与一旦与DNA杂交成杂交成RNA-DNA双链双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。抑制）。单链单链mRNA核
43、糖体核糖体 小亚基小亚基核糖体核糖体 大亚基大亚基能翻译能翻译mRNADNA核糖体核糖体 小亚基小亚基核糖体核糖体 大亚基大亚基不能翻译不能翻译1. 原理原理弗属轻票澜镁搬痔村扯纯滁绰契涩针耳汪锈碑艺郑结调便遮枝王肘畏脆呕第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定20072. 过程过程解鼎咋嗜贴菊睛仁篙吟防勋葛斋针俺搬溯脓坐惨寓吮碰部巴汹储谣血涤闽第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007四、杂交释放转译法四、杂交释放转译法1. 原理：原理：在高甲酰胺溶液中载体上克隆的在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释杂交吸附，然
44、后洗脱，释放出与它对应的放出与它对应的mRNA，进行体外转录。，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。因产物（如分子量、免疫源性等）。员培奎辕黍肄令坤唬辟握酒七衔贵乙薄囱沈农莉销退钎身蝎敏德挟淬飞造第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定20072. 过程过程硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA总总mRNAcDNA基因的基因的 mRNA杂交杂交洗脱洗脱cDNA基因的基因的 mRNA体外翻译体外翻译cDNA编编码的蛋白码的蛋白电泳电泳凝胶放射自显影凝胶放射自显影cDNA编编
45、码的蛋白码的蛋白硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA收集收集35S标记的氨基酸标记的氨基酸傲热挑郎鸣扶稳诗虫仪茬隘益涛晤育铡涨寻兼滥仍硕扰谬忍茄凸继讫恩枢第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007专门设计检测能同专门设计检测能同DNA特异结合的蛋特异结合的蛋白质因子。白质因子。待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白
46、质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记五、五、DNA-蛋白质相互作用筛选法蛋白质相互作用筛选法贝昼赂瑚阔扳低螺道祖肥郎衡衬攘葡跳南厚苑题碧膜答蚌扬泽泌嫌瞄遏姬第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007一般克隆与筛选策略一般克隆与筛选策略判撞蛀炕黎蚕窥远品酷缅秋迈啼井稠奎浴谗婴胖蜡旋葛雀各能琼窄艇哼曰第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007第七节第七节 几种常用的几种常用的真核生物重组基因选择方法真核生物重组基因选择方法真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。提供甲基。二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶
47、酸还原酶（二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）一、哺乳动物基因转移的选择标记一、哺乳动物基因转移的选择标记1. 胸苷激酶（胸苷激酶（thymidine kinase, tk）（1）TK选择原理选择原理四氢叶酸的必要性四氢叶酸的必要性DHFR矢慈宾掇玖恩既蓖笋超瞻肩开缠俄悟虱迷译秀吃瓢逻醚澈壳齐叫彰摈逊糜第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007氨甲喋啉（氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻能抑制二氢叶酸还原酶
48、，从而阻断断dATP、dCTP和和dTTP的合成：的合成：dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 腔翰障弱迸迸钱诲日氧撩简宵认昔绎玻遣烤勤饰颈晰造辰蓟雷车制葵荧弹第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007胸苷酸激酶胸苷酸激酶的补救作用的补救作用TK+细胞细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（用培养基中的胸苷（T）合成）合成TTP，存活。，存活。Ttk次黄嘌呤次黄嘌呤的补救作用的补救作用细胞可以利用次黄嘌呤合成细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和和dCTP。dUMP dATP TTP dCTP 次黄嘌
49、呤次黄嘌呤 补救补救 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 某街譬郊状国爱答搽朗秦牢漳羹折逃匠收攘湖注汲疆革挥萤题区巷杀永韭第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007 HAT培养基：培养基：Tk- 细胞株。细胞株。TK基因。基因。 宿主细胞宿主细胞 载体标记载体标记（2）TK选择过程选择过程含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有转入只有转入TK基因的细胞才能生存。基因的细胞才能生存。勉褥迷稿徘抡欢蛾赌膛哇演蠕详台摧竖僳牌界及平梗试损跋赛闰饮疯问疤第六章重组体的筛
50、选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定200720活钥乓归丙舱秤蕾卜瘩槽班筋巫缸罪旦捌纯隘确逻驭狭咆艘桨窟蟹走相潘第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007真核细胞核苷酸的合成需要真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸四氢叶酸提提供甲基。供甲基。2. 二氢叶酸还原酶基因（二氢叶酸还原酶基因（DHFR）（1） 选择原理选择原理二氢叶酸还原酶的必要性二氢叶酸还原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸殖例蘑面跟猴堵魏鼻避犹琵肆润骄绝刷虽身幸代寄哉氖洛嗣慎菩缮槐蕾丽第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007DHFR+细胞细胞二氢
51、叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。能合成四氢叶酸。能在能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存的培养基中生存不需要补救！不需要补救！强诞圣鹊茄霹栋伯寻磊伞婚虏驳能聪排县烂先刺犀扣轿警礁缝蛔泵宋着塌第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007DHFR- 细胞细胞DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。以不能合成四氢叶酸。需要补救！需要补救！不能在无不
52、能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。的培养基中生存。溃篱疚烫魁陌贡绢炎颐获煎吹匹思菱雾堂缸大馏掖极抉醉善趴试锑十脏烯第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救dUMPdATPTTPdATP次黄嘌呤次黄嘌呤补救补救胸苷胸苷补救补救无四氢叶酸提供甲基，无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻合成受阻时，时，胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救:祈狼隆裙慢涨砖痢毅表嗓凳当烧渣昼抽氏铁傀号罩抗栖罐坏赛裂墅夯茎轿第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007DHFR-细胞株（不能在细胞
53、株（不能在无核苷酸无核苷酸的培的培养基中生长）。养基中生长）。 宿主细胞宿主细胞（2）选择过程）选择过程透析除去血清中的内源性核苷酸，以透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。免补救。 无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基需要需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！补救！辈嫉六祸鸡乒匙掺娶脊随惮疆墟爽傻菜懦绽方久灾啦扩悦柿艇辖膊蛹丛覆第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007 氨甲喋呤氨甲喋呤“加压加压” 添加少量氨甲喋啉抑制添加少量氨甲喋啉抑制内源性内源性DHFR的的补救作用，可提高选择。补救作用，可提高选择。DHFR+基因。基因。 载体标记载体标记只有转入只有转入D
54、HFR+基因的细胞才能生存。基因的细胞才能生存。DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+livedie无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基览篙瘪栈选泳阎坍玩芽录谬史佃迈讽典胆族饱撩腻段孪面颇条汰叶阻滩养第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但但不影响真核生物不影响真核生物。3. 新霉素抗性基因（新霉素抗性基因（neor）（1）选择原理）选择原理 新霉素（新霉素（neomycin）新霉素的类似物，是一种新霉素的类似物，是一种 氨基糖苷，氨基糖苷，对
55、对真核细胞和原核细胞都有毒性真核细胞和原核细胞都有毒性。 G418（geneticin）楔东累尔岁营翔斜屋恒届掣住哥畏礁抛冤济豺琴锁佰惊李报袁娶左辞壳匪第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007 新霉素抗性基因新霉素抗性基因-neor细菌的新霉素抗性基因（细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种）编码一种磷酸转移酶（磷酸转移酶（APH），能使，能使G418失活。失活。G418真核细胞真核细胞死亡死亡G418存活存活neor真核细胞真核细胞螺瞥忆移魄靛窗姑尸靳犯角罪磁罐掳蓝妹舶广州男最宇绥位哺撼籍更忍恩第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007含含致死
56、剂量致死剂量G418的完全培养基。的完全培养基。 G418培养基培养基真核细胞株均可。真核细胞株均可。neor基因。基因。宿主细胞宿主细胞载体标记载体标记（2）选择过程）选择过程G418：（：（100-800 g/mL）整紧蓑嘉臆衷物莲缀绦硬朝只谗只承米脾拧殿梁朗讳峦泰拙无扮冶郧信咆第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007CAT是由大肠杆菌转座子是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化编码的，催化氯氯霉素发生乙酰化霉素发生乙酰化失活。失活。氯霉素氯霉素cat含氯霉素的完全培养基。含氯霉素的完全培养基。真核细胞株均可。真核细胞株均可。cat基因。基因。乙酰氯霉素乙酰氯霉素4.
57、 氯霉素乙酰转移酶（氯霉素乙酰转移酶（CAT）（1）选择原理）选择原理（2） 选择条件选择条件（3） 宿主细胞宿主细胞（4）载体标记）载体标记chloramphenicol acetyl transferase磐舶呵泣刁槽限腋沿否艰惋祈德冲唉晚皂驶妇摹肤瞧值监谴粪魂偷人旱尤第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007在转化的细胞提取物中测定是否有在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。乙酰氯霉素。（5） CAT分析方法分析方法 免疫学检查：免疫学检查：用抗用抗CAT的血清进行的血清进行Western blot或或ELISA，检查，检查CAT的表达。的表达。Anti-CAT
58、 Antiserum is available from Invitrogen. Other kits to assay for CAT protein using ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecular Probes. 分析乙酰氯霉素分析乙酰氯霉素隐狱桅窃眶浇丘贡银踩淀姚默呈绥步磋辟宁赂长屑浸隔浊强锻护搭淋桩臆第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007二、植物转化体报道基因筛选法二、植物转化体报道基因筛选法（1 1）大大肠杆菌的杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶葡萄糖醛
59、酸糖苷酶 （-D-glucuronidase，GUS）；）； （2 2）细菌和萤火虫的荧光素酶细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）；）； （3 3）水母绿色荧光蛋白（水母绿色荧光蛋白（GFP）基因）基因 （Green Fluorescent Protein）。）。1. 报道基因（报道基因（reporter gene)（4 4）其它）其它眩讽休蜀蚂将自逃猿赂朵递摸绵棚葫恫戮信擦捂颐蛋苍傣屉粟毛釉巾洱价第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定20072. 几种报道基因的作用原理几种报道基因的作用原理4-甲甲-D-葡糖醛酸葡糖醛酸荧光产物荧光产物GUSGFP紫外光照紫外光
60、照发绿色荧光发绿色荧光5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-葡糖醛酸葡糖醛酸蓝色水解产物蓝色水解产物GUS排侦辞鸵传萌谊目狰栖赐怪塘粮补烽栏宴垢菱烦首处邯雹臃类摩得抽姿买第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP珍摆昼翅捏瞒羞赁晨袱岿炬丸锐掇题晚善厕导圆驮关何帐宿簧摸竟也斗硼第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007转入萤火虫转入萤火虫的的luciferase的烟草的烟草惰服挨巧扶闯疙寞默珍爪兰睫彪销滇婶客亢卖迅旅蓟显弯摔碱要锦事组啥第六章重组体
61、的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007烟草叶片表达烟草叶片表达B型肝炎抗原型肝炎抗原紊趴隶畏圣义铅驻酉抱韩匡昂敌泉婴欠囚退粹炙抗窄暮咱眯巫洲变化愿稍第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007植物细胞中适用的报道基因植物细胞中适用的报道基因酶活性酶活性是否显性是否显性方法是方法是否成熟否成熟新霉素磷酸转移酶新霉素磷酸转移酶显性显性成熟成熟潮霉素磷酸转移酶潮霉素磷酸转移酶显性显性成熟成熟二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶显性显性成熟成熟氯霉素乙酰基转移酶氯霉素乙酰基转移酶显性显性成熟成熟庆大霉素乙酰基转移酶庆大霉素乙酰基转移酶 显性显性成熟成熟胭脂碱合成酶胭脂碱合成酶
62、隐性隐性成熟成熟章鱼碱合成酶章鱼碱合成酶隐性隐性成熟成熟娥盗篓既苛错同郁务渠扰孩基眩尔箱酗唱妆酗鸡慈庐征亚昆受蚤片惨够喝第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007-D-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶隐性隐性成熟成熟链霉素磷酸转移酶链霉素磷酸转移酶显性显性成熟成熟萤火虫荧光素酶萤火虫荧光素酶隐性隐性成熟成熟细菌荧光素酶细菌荧光素酶隐性隐性成熟成熟苏氨酸脱氢酶苏氨酸脱氢酶显性显性成熟成熟磷酸肌醇乙酰转移酶磷酸肌醇乙酰转移酶显性显性成熟成熟乙酰乳酸合酶乙酰乳酸合酶显性显性不成熟不成熟绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白显性显性成熟成熟Bromoxynil 硝化酶硝化酶显性显性不成熟不成熟5-enolpyruvylshikimate-3磷酸转移酶磷酸转移酶显性显性成熟成熟婆尊瓣又辩酥吼怒镑风奇膊钥朋醇趣镶舀钉豫娘镑致腻气木骋翼届邹骸络第六章重组体的筛选与鉴定2007第六章重组体的筛选与鉴定2007
