环境生物化学：第2章 蛋白质

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1、第二章 蛋白质要点：要点：蛋白质相对分子质量的测定方法及其原理蛋白质相对分子质量的测定方法及其原理氨基酸结构特点、分类、理化性质（解离、成肽）氨基酸结构特点、分类、理化性质（解离、成肽）肽键及肽键平面肽键及肽键平面一级结构测定、高级结构、结构与功能的关系一级结构测定、高级结构、结构与功能的关系蛋白质的性质（胶体、变性、沉淀、颜色反应）蛋白质的性质（胶体、变性、沉淀、颜色反应）蛋白质分离纯化常用方法及其原理蛋白质分离纯化常用方法及其原理2-1 蛋白质的生物功能、化学组成及其分类蛋白质的生物功能：蛋白质的生物功能：塑造功能塑造功能催化功能催化功能运输和储存功能运输和储存功能协调运动功能协调运动功能

2、机械支持功能机械支持功能免疫保护功能免疫保护功能调节代谢功能调节代谢功能生成、接受、传递信生成、接受、传递信息功能息功能蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成主要成分：主要成分：C 52%、H 7%、O 23%、N 16%、S 2%。有些有些Pr还含有其他一些元素，主要是还含有其他一些元素，主要是P、Fe、Cu、I、Zn、Mo、Mn等等凯氏定氮法测定凯氏定氮法测定Pr含量的计算基础：含量的计算基础： Pr含量含量=蛋白氮蛋白氮16%补充：凯氏定氮法只有蛋白质才能用只有蛋白质才能用需加入三氯乙酸，测定非蛋白氮需加入三氯乙酸，测定非蛋白氮含氮有机物含氮有机物+浓浓H2SO4 K2SO4或或Na2SO4

3、沸点，沸点，CuSO4催化催化M(滴定酸滴定酸)=M(待测待测N)Pr含量含量=蛋白氮蛋白氮16%CO2 H2O NH3 +浓浓H2SO4 浓碱浓碱+(NH4)2SO4NH3 硼酸硼酸蒸馏蒸馏酸滴定酸滴定恢复硼酸恢复硼酸H+三聚氰胺，白色粉末三聚氰胺，白色粉末无气味，无味道无气味，无味道含氮量含氮量66%是牛奶的是牛奶的151倍倍是奶粉的是奶粉的23倍倍使测试使测试Pr含量增加一个百分点含量增加一个百分点作假花费只有真实花费的作假花费只有真实花费的1/5蛋白质的相对分子质量蛋白质的相对分子质量6000到到1000000 Da或更大或更大根据化学根据化学组成成测定最低相定最低相对分子分子质量量凝

4、胶凝胶过滤法法测定相定相对分子分子质量量SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳法泳法沉降分析法沉降分析法AA残基的数目残基的数目110Pr分子量分子量垂垂直直板板电电泳泳电泳速度电泳速度v=Eq/f沉降系数沉降系数（S）与蛋白质的密度和形状相关）与蛋白质的密度和形状相关对形状高度不对称的纤维状蛋白质不适用对形状高度不对称的纤维状蛋白质不适用蛋白质的分类蛋白质的分类分子形状分类：球状分子形状分类：球状Pr和纤维状和纤维状Pr分子组成分类：简单分子组成分类：简单Pr和结合和结合Pr简单蛋白按溶解度分类：清简单蛋白按溶解度分类：清Pr 、球、球Pr 、谷、谷Pr 、醇溶、醇溶Pr 、精、精Pr 、组、

5、组Pr和硬和硬Pr结合蛋白按辅基分类：糖结合蛋白按辅基分类：糖Pr 、核、核Pr 、脂、脂Pr 、磷、磷Pr 、金属、金属Pr 、血红素、血红素Pr 、黄素、黄素Pr生物功能分类：酶、调节生物功能分类：酶、调节Pr、转运、转运Pr等等蛋白质的水解蛋白质的水解水解方法水解方法反应物反应物产物产物优点优点缺点缺点酸水解酸水解硫酸或硫酸或盐酸盐酸L-氨基酸氨基酸不消旋不消旋Trp被破坏；羟基被破坏；羟基AA被分解；酰胺被分解；酰胺基被水解基被水解碱水解碱水解NaOHD-，L-AA混合物混合物Trp稳定稳定多数多数AA被破坏；被破坏；消旋；消旋；Arg脱氨生脱氨生成鸟氨酸和尿素成鸟氨酸和尿素酶水解酶水

6、解酶酶大小不等的大小不等的肽段和肽段和AA不消旋；不消旋；不破坏不破坏AA时间常；需多种酶时间常；需多种酶参与参与作业：简述凝胶过滤法测定蛋白质相对分子质简述凝胶过滤法测定蛋白质相对分子质量的原理量的原理简述简述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量原理白质相对分子质量原理名词解释：道尔顿、沉降系数名词解释：道尔顿、沉降系数比较蛋白质三种水解方法的利弊比较蛋白质三种水解方法的利弊2-2 氨基酸氨基酸的结构特点氨基酸的结构特点侧链侧链R基不同基不同比旋光度是鉴别各种比旋光度是鉴别各种AA的重要依据的重要依据有两种立体异构，温和酶解得到有两种立体异构，温和酶解

7、得到L-型，型，但在细菌中但在细菌中D-型型AA也广泛存在也广泛存在Thr和和Ile在实验室里可存在四种光学异在实验室里可存在四种光学异构体，即构体，即D-、L、D-别别-和和L-别别氨基酸的分类氨基酸的分类脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸芳香族氨基酸：芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp杂环氨基酸：杂环氨基酸：His、Pro非极性氨基酸：非极性氨基酸：极性氨基酸：极性氨基酸：极性不带电荷极性不带电荷极性带负电荷酸性氨基酸极性带负电荷酸性氨基酸极性带正电荷碱性氨基酸极性带正电荷碱性氨基酸按侧链按侧链R基的化学基的化学结构和性结构和性质分类质分类l中性非极性AAl中性极性中性极性AAl酸性酸性AAl碱性

8、碱性AA2.975.656.025.423.226.029.745.68pI10.765.025.977.595.985.755.486.306.535.895.665.97Ph=苯基苯基Me=CH3人体必需氨基酸人体必需氨基酸l蛋白质的稀有氨基酸蛋白质的稀有氨基酸l非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸l均由相应均由相应AA残基修饰而成，无遗传密码残基修饰而成，无遗传密码l必需氨基酸必需氨基酸l蛋白质的互补作用蛋白质的互补作用如谷类中赖如谷类中赖AA较少而色较少而色AA较多，大豆则相反。提倡较多，大豆则相反。提倡食物多样化，合理搭配食物多样化，合理搭配“缬异缬异亮苏，亮苏，赖蛋苯色赖蛋苯色”氨基酸的性

9、质氨基酸的性质一般物理性质一般物理性质-AA为无色晶体，熔点为无色晶体，熔点200 以上以上每种每种AA都有特殊的结晶，可用来鉴别都有特殊的结晶，可用来鉴别其味随不同其味随不同AA有所不同有所不同除胱除胱AA和和Tyr外，能溶于水，溶解度差外，能溶于水，溶解度差别大，可溶于稀酸、稀碱别大，可溶于稀酸、稀碱一般不溶于有机溶剂。一般不溶于有机溶剂。Pro和羟脯和羟脯AA能能溶于乙醇或乙醚溶于乙醇或乙醚AA的酸碱性质和等电点的酸碱性质和等电点AA的两性离子形式的两性离子形式 现象：熔点高，使水的介电常数增高，现象：熔点高，使水的介电常数增高，具有离子性质具有离子性质 解释：解释：有机化合物有机化合物

10、分子晶格分子晶格范德华力范德华力 AA晶体晶体离子晶格离子晶格静电吸引静电吸引介电常数与电解质的极性结构有关，极介电常数与电解质的极性结构有关，极性分子的介电常数高性分子的介电常数高在在20，水的介电常数为，水的介电常数为80，1M的的-AA水溶液为水溶液为102108同一个同一个AA分子上带有能放分子上带有能放出质子的正离子（出质子的正离子（-NH3+）和能接受质子的负离子和能接受质子的负离子（-COO-）又称兼性离子、偶极离子又称兼性离子、偶极离子AA的解离的解离解离度与溶液的解离度与溶液的pH有关有关注意酸碱的相对性注意酸碱的相对性AA的等电点的等电点净电荷为零时，溶液的净电荷为零时，溶

11、液的pH值（值（pI）静电作用使静电作用使pI时时AA的溶解度最小的溶解度最小pI计算：计算： pI=（ pK1+pK2）/2中性中性AA的的pI都在都在6.0左右左右血红血红Pr中含有较多的组中含有较多的组AA，使得它在血使得它在血液中具有明显的缓冲能力液中具有明显的缓冲能力把一个把一个AA结晶加入到结晶加入到pH7.0的纯水中，的纯水中，得到了得到了pH6.0的溶液，问此的溶液，问此AA的的pI是大是大于于6.0？小于？小于6.0？还是等于？还是等于6.0？从氨基？从氨基酸解离角度解释分析过程。酸解离角度解释分析过程。AA的光学性质和光吸收的光学性质和光吸收AA的光学性质的光学性质构型与旋

12、光性的概念构型与旋光性的概念AA的光吸收的光吸收可见光区没有吸收可见光区没有吸收红外光区和远紫外光区有吸收红外光区和远紫外光区有吸收近紫外光区近紫外光区Tyr、Pro、Trp有吸收有吸收AA的化学性质的化学性质-氨基参加的反应：氨基参加的反应：室温下可与亚硝酸反应，用于室温下可与亚硝酸反应，用于AA定量和定量和Pr水解程度的测定。赖水解程度的测定。赖AA的的 NH2反反应，但速度较慢应，但速度较慢R-CH-COOH+HNO2 R-CH-COOH+N2+H2ONH2OH生成生成Schiffs base（西佛碱）反应，与醛西佛碱）反应，与醛酮类化合物反应生成弱碱，是某些酶促反酮类化合物反应生成弱碱

13、，是某些酶促反应的中间物（如转氨基反应）。应的中间物（如转氨基反应）。西佛碱西佛碱-H2O+H2OC=O + H2NCCOOH C=NCCOOH RRRRHHHH甲醛滴定反应，与过量甲醛反应生成单甲醛滴定反应，与过量甲醛反应生成单或双羟甲基氨基酸衍生物，促使或双羟甲基氨基酸衍生物，促使-NH3+解离，碱性下降。通过测定游离解离，碱性下降。通过测定游离-NH3+含量，可大体判断含量，可大体判断Pr水解或合成的速度水解或合成的速度-OOC-CH-NH3+ -OOC-CH-NH2+H+ OH-pK2H+HCHO-OOC-CH-NHCH2OH -OOC-CH-N(CH2OH)2HCHON-羟甲基氨基酸

14、 N,N-二羟甲基氨基酸RRRR与酰化试剂反应，与酰氯或酸酐在与酰化试剂反应，与酰氯或酸酐在弱碱弱碱溶液反应酰基化，中用作氨基保护试剂。溶液反应酰基化，中用作氨基保护试剂。 丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNS）用于多肽链氨基末端）用于多肽链氨基末端AA的标记和微量的标记和微量AA的定量测定的定量测定R1-C-X+H2N-CH-COO- R1-C-NH-CH-COO-R2R2OOOH-X=Cl， OCOR氨基酸酰化产物氨基酸酰化产物实例：苯甲酸是常用的一种食品防实例：苯甲酸是常用的一种食品防腐剂，可与甘氨酸反应转变成腐剂，可与甘氨酸反应转变成N-苯苯甲酰甘氨酸甲酰甘氨酸，经尿排出，经尿排出烃基化反应，烃

15、基化反应，弱碱性条件弱碱性条件qSanger反应：反应：2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯（DNFB）生成稳定的黄色生成稳定的黄色2,4-二硝基苯二硝基苯AA（DNP-AA），），用来鉴定用来鉴定Pr的的N末端末端O2N- -F+H2N-CH-COOH O2N- -N-CH-COOH+HF弱碱中NO2NO2RRH（DNFB）（DNP-AA）（黄色）qEdman降解反应：与异硫氰酸苯酯降解反应：与异硫氰酸苯酯（PITC）生成生成PTC-AA，在无水酸中环在无水酸中环化成稳定的化成稳定的PTH。可连续测出可连续测出60个以上个以上的的AA顺序顺序脱氨基和转氨基反应脱氨基和转氨基反应-羧基参加的反应：羧基

16、参加的反应：成盐和成酯反应，羧基被掩蔽，氨基被成盐和成酯反应，羧基被掩蔽，氨基被活化，更容易与酰基或烃基结合活化，更容易与酰基或烃基结合成酰氯反应，氨基被保护后，可与二氯成酰氯反应，氨基被保护后，可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯，使羧基亚砜或五氯化磷作用生成酰氯，使羧基活化，常用于多肽的人工合成中活化，常用于多肽的人工合成中叠氮反应，氨基酰化保护后，羧基酯化叠氮反应，氨基酰化保护后，羧基酯化成甲酯，与肼和亚硝酸反应生成叠氮化成甲酯，与肼和亚硝酸反应生成叠氮化合物，活化羧基，应用于人工合成肽合物，活化羧基，应用于人工合成肽RCHCOOH RCHCOClPCl3，PCl5或或SOCl2NHPGN

17、HPG（PG保护基）保护基）R-CH-COOCH3 R-CH-CONHNH2 R-CH-C-N-NNNH2NH2HNO2NHPGNHPGNHPGOCH3OHH2O，N2脱羧反应脱羧反应-氨基和氨基和-羧基共同参加的反应：羧基共同参加的反应：与茚三酮反应，与茚三酮反应， 酸性溶液中共热，酸性溶液中共热， -AA脱氨脱羧，释放脱氨脱羧，释放NH3，水合茚三酮还水合茚三酮还原原，与，与另一分子水合茚三酮另一分子水合茚三酮在生成在生成蓝紫蓝紫色色物质物质(570nm) 脯脯AA和羟脯和羟脯AA（亚亚AA）不释放不释放NH3，直直接生成接生成黄色黄色物质物质(440nm)。成肽反应成肽反应，一个，一个A

18、A的氨基与另一个的氨基与另一个AA的的羧基缩合成肽，热力学上不能自发进行，羧基缩合成肽，热力学上不能自发进行，可通过活化羧基方法使反应顺利进行可通过活化羧基方法使反应顺利进行HR1OH2N-C-C-OH+H-N-C-COOH H2N-C-C-N-C-COOH-H2OR1R2R2HH HH HO侧链侧链R基参加的反应：基参加的反应：很多反应是很多反应是Pr化学修饰化学修饰的基础的基础Cys侧链侧链巯基巯基（-SH）反应性能很高，易反应性能很高，易被氧化缩合成胱被氧化缩合成胱AA。可逆反应，稳定可逆反应，稳定Pr构象上起很大作用，氧化剂（氧化成磺构象上起很大作用，氧化剂（氧化成磺基氨基酸）和还原剂

19、都可打开二硫键基氨基酸）和还原剂都可打开二硫键2-OOC-CH-CH2-SH -OOC-CH-CH2-S-S-CH2-CH-COO-氧化氧化还原还原+NH3+NH3+NH3SO3H具有弱酸性；具有弱酸性；能与各种金属离子形成稳能与各种金属离子形成稳定程度不同的络合物定程度不同的络合物羟基的性质羟基的性质u形成氢键；与酸成酯形成氢键；与酸成酯u蛋白质分子中，丝氨酸常与磷酸成酯蛋白质分子中，丝氨酸常与磷酸成酯u丝氨酸是大多数蛋白水解酶活性中心的丝氨酸是大多数蛋白水解酶活性中心的主要组分，多种酰基化剂能与酶活性中主要组分，多种酰基化剂能与酶活性中心的丝氨酸羟基作用导致酶失活心的丝氨酸羟基作用导致酶失

20、活咪唑基的性质咪唑基的性质生理条件下有缓冲作用生理条件下有缓冲作用咪唑环一侧的去质子化与另一侧的质子咪唑环一侧的去质子化与另一侧的质子化同步进行，能够发生多种化学反应，化同步进行，能够发生多种化学反应，如磷酰化反应、烷基化反应等如磷酰化反应、烷基化反应等甲硫基的性质甲硫基的性质强亲核中心，易与卤代烷等发生亲核取强亲核中心，易与卤代烷等发生亲核取代反应形成烷基化产物代反应形成烷基化产物H2NCH(CH2)SCH3+14CH3IH2NCH(CH2)2SCH3H2NCH(CH2)SCH3+H2NCH(CH2)2S14CH3COO-COO-COO-COO-14CH3弱碱弱碱巯基巯基试剂试剂芳香环的性质

21、芳香环的性质芳香环，共轭芳香环，共轭电子体系子体系紫外特征吸收峰，蛋白紫外特征吸收峰，蛋白质的紫外吸收性的紫外吸收性质主要来自它主要来自它们的的贡献献可可发生生亲电取代，如碘化、硝化和重氮取代，如碘化、硝化和重氮化反化反应等等显色反应显色反应作业：推导氨基酸解离公式推导氨基酸解离公式写出苯甲酸钠的防腐机理写出苯甲酸钠的防腐机理写出丹磺酰氯与氨基酸的酰化反应过程写出丹磺酰氯与氨基酸的酰化反应过程2-3 肽肽及肽键肽及肽键两个两个AA脱水缩合而成的化合物称脱水缩合而成的化合物称肽肽。AA之间脱水后形成的键称肽键，又称酰之间脱水后形成的键称肽键，又称酰胺键，是胺键，是AA在在Pr分子中的主要连接方式

22、分子中的主要连接方式由两个由两个AA缩合形成的称二肽，十肽以下缩合形成的称二肽，十肽以下称寡肽，十肽以上称多肽称寡肽，十肽以上称多肽HR1OHHHHHR2R1R2H2N-C-C-OH+H-N-C-COOH H2N-C-C-N-C-COOH-H2OON末端，习惯写在肽链的左侧，用末端，习惯写在肽链的左侧，用H2N-或或H-表示；表示；C末端，习惯上写在的右侧，末端，习惯上写在的右侧，用用-COOH或或-OH表示表示命名原则：除命名原则：除C末端的残基仍称该末端的残基仍称该AA的的原名，并置于肽名末尾，其余均按酰基原名，并置于肽名末尾，其余均按酰基命名，并从命名，并从N末端开始依次列出末端开始依次

23、列出二硫键存在于肽链之间或之内二硫键存在于肽链之间或之内注意：顺序相注意：顺序相反的肽链是一反的肽链是一个不同的多肽个不同的多肽肽键是Pr分子中AA连接基本方式的实验根据Pr分子中游离分子中游离-氨基和氨基和-羧基很少，水解过程中两羧基很少，水解过程中两者以等摩尔数增加者以等摩尔数增加某些人工合成的多肽能被水解某些人工合成的多肽能被水解Pr的的PrE水解，而且水解，而且能催化它的逆转，即在能催化它的逆转，即在AA或多肽之间形成肽键或多肽之间形成肽键包含酰基基团的化合物如双缩脲能与包含酰基基团的化合物如双缩脲能与CuSO4-NaOH溶液产生颜色反应，天然溶液产生颜色反应，天然Pr也有同样的反应也

24、有同样的反应人工合成的多聚人工合成的多聚AA的的X射线衍射图案和红外吸收光射线衍射图案和红外吸收光谱与天然的纤维状谱与天然的纤维状Pr十分相似十分相似我国在世界上首次人工合成我国在世界上首次人工合成Pr结晶牛胰岛素的结晶牛胰岛素的成功，完全证明了成功，完全证明了Pr的肽链结构的正确性的肽链结构的正确性肽键的结构氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用X射线衍射分析证实肽键长射线衍射分析证实肽键长0.132nm，介于介于C-N（ 0.127nm ）C=N（0.148nm）之间之间肽键平面：折叠成三维构象过程中非常重要肽键平面：折叠成三维构象过程中非常重要肽链中

25、肽键都是反式结构，以减少肽链中肽键都是反式结构，以减少R基的空间基的空间位阻位阻HHHR2R1H3NCCNCCOOOv含脯含脯AA的肽键顺反式均可以，因为四氢的肽键顺反式均可以，因为四氢吡咯环引起的空间位阻消去了反式构型吡咯环引起的空间位阻消去了反式构型的优势的优势多肽的性质多肽的性质多肽的两性解离：多肽的两性解离： 解离情况复杂，主要取决于侧链上的碱解离情况复杂，主要取决于侧链上的碱性和酸性基团的相对数目性和酸性基团的相对数目多肽链的反应多肽链的反应 可以发生可以发生AA的一切反应的一切反应多肽链的水解多肽链的水解 酸水解、碱水解、酶水解酸水解、碱水解、酶水解补充：氨基酸的邻基反应：如有氨基

26、酸的邻基反应：如有Asn和和Gly相邻相邻排列，侧链酰氨基中的羰基碳原子具有排列，侧链酰氨基中的羰基碳原子具有弱亲电性，正好与肽链主链上亲核的氮弱亲电性，正好与肽链主链上亲核的氮原子距离原子距离5个原子，容易形成五元环，常个原子，容易形成五元环，常引起氨基酸顺序分析出现错误引起氨基酸顺序分析出现错误双缩脲反应：含有两个或以上肽键化合双缩脲反应：含有两个或以上肽键化合物可与碱性硫酸铜作用产生紫红色或蓝物可与碱性硫酸铜作用产生紫红色或蓝紫色络合物，是多肽定量的重要反应紫色络合物，是多肽定量的重要反应OCOCH2N NH2 H2N NH2OCOCH2N N NH2加热NH3HHHR2R1H3NCCN

27、CCNCCOOOOHHR3天然存在的活性寡肽天然存在的活性寡肽主要作为化学信使，又称为主要作为化学信使，又称为活性肽活性肽谷胱甘肽：某些酶的辅酶，在体内氧化谷胱甘肽：某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重要作用。分子中存在还原过程中起重要作用。分子中存在特特殊的殊的-肽键肽键，是由，是由Glu的的-羧基与羧基与Cys的的-氨基缩合而成。有还原型和氧化型氨基缩合而成。有还原型和氧化型CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COO-CH2CH2CH2-NH3+ COO-CH2SH-Glu-Cys-Gly S S-Glu-Cys-Gly还原型还原型GSH 氧化型氧化型GSH 脑肽脑肽：其中其中脑啡肽脑

28、啡肽是高等动物脑中发现是高等动物脑中发现的比吗啡更有镇痛作用且不上瘾的活性的比吗啡更有镇痛作用且不上瘾的活性5肽。发现了肽。发现了C末端残基分别为末端残基分别为Met和和Leu的两种类型，其余四个的两种类型，其余四个AA是酪、甘、甘、是酪、甘、甘、苯丙苯丙AA。上海生化所上海生化所82年年5月利用月利用Pr工工程技术成功的合成了程技术成功的合成了Leu-脑啡肽。脑啡肽。-内内啡肽啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe- Met -COO-Met-脑啡肽Leu-脑啡肽Leu1975年有人从猪脑中分离出年有人从猪脑中分离出一种一种31肽的具有较强的吗啡样肽的具有较强的吗啡样活性与镇痛作用的活

29、性与镇痛作用的-内啡内啡肽其第其第117位的降解片段称位的降解片段称为-内啡内啡肽，无以上活性，但有抗，无以上活性，但有抗精神分裂症的精神分裂症的疗效效+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser -Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Val-Lys-Asn-Ala-His-Lys-Lys-Gly-Gln-COO-催产素和升压素催产素和升压素：均为均为9肽。前者使子宫肽。前者使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产及排乳作和乳腺平滑肌收缩，具有催产及排乳作用，另有促进遗忘作用；后者促进血管用，另有促

30、进遗忘作用；后者促进血管平滑肌收缩，从而升高血压，并有减少平滑肌收缩，从而升高血压，并有减少排尿作用，也称抗利尿激素，还参与记排尿作用，也称抗利尿激素，还参与记忆过程忆过程NH2-Gly- Leu -Pro-Cys-Asn-Gln- Ile -Tyr-CysS S催产素升压素升压素ArgPhe胰高血糖素胰高血糖素：29肽，可调节控制肝糖原肽，可调节控制肝糖原降解产生葡萄糖，以维持血糖水平，还降解产生葡萄糖，以维持血糖水平，还能引起血管舒张，抑制肠的蠕动和分泌。能引起血管舒张，抑制肠的蠕动和分泌。而胰岛素功能正相反而胰岛素功能正相反H2N-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-

31、Ser-Asp-Tyr- Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln- Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COO-作业画出肽键平面画出肽键平面2-4 蛋白质的共价结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构指指Pr分子中分子中AA的种类、连接方式和排列的种类、连接方式和排列顺序。顺序。各各AA的不同侧链对维持的不同侧链对维持Pr分子的立体结分子的立体结构和行使构和行使Pr的功能起着重要作用的功能起着重要作用除肽键外还有二硫键除肽键外还有二硫键连接肽链内或肽链间的主要桥键连接肽链内或肽链间的主要桥键稳定空间结构，与生物活力有关稳定

32、空间结构，与生物活力有关生物体内起保护作用的皮、角、生物体内起保护作用的皮、角、毛、发的毛、发的Pr中二硫键最多中二硫键最多蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定N-末端和末端和C末端分析末端分析二硫桥的断裂二硫桥的断裂氨基酸组成的分析氨基酸组成的分析多肽链的部分水解多肽链的部分水解各肽段的氨基酸序列的测定和完整肽链各肽段的氨基酸序列的测定和完整肽链的氨基酸顺序的确定的氨基酸顺序的确定二硫桥位置的确定二硫桥位置的确定N-末端：末端：DNFB法、法、PITC法、法、DNS法、氨肽酶法法、氨肽酶法C末端：肼解法、还原法末端：肼解法、还原法（BHLi）、羧肽酶法）、羧肽酶法H2O2+HCOOH氧化

33、氧化过量过量- -巯基乙醇还原（加巯基乙醇还原（加碘乙酸保护碘乙酸保护-SH-SH）酶裂解法酶裂解法化学裂解法化学裂解法RnPro则抑制水解或不水解溴化氰切割溴化氰切割Met-肽键，专一性强，肽键，专一性强，产率高产率高羟胺切割羟胺切割Asn-Gly/Lue/Ala肽键肽键胃蛋白酶水解胃蛋白酶水解-对角线电泳对角线电泳-含磺基丙氨酸肽段序列分析含磺基丙氨酸肽段序列分析-确定二硫键位置确定二硫键位置补充：关于胰蛋白酶的水解位点补充：关于胰蛋白酶的水解位点Lys-、Arg-肽键肽键-Pro肽键可抑制水解肽键可抑制水解减少作用位点：马来酸酐（顺丁烯二酸酐）减少作用位点：马来酸酐（顺丁烯二酸酐）保护保

34、护Lys侧链上的侧链上的-NH2，使，使酶酶只能断裂只能断裂Arg；用；用1,2-环己二己二酮修修饰Arg胍基，胍基，则只能水解只能水解Lys增加增加作用位点：作用位点：Cys残基侧链被氮丙啶修饰成残基侧链被氮丙啶修饰成类似类似Lys侧链的侧链的-NH2，便可水解，便可水解Cys-肽键例题：已知一七肽的组成为：例题：已知一七肽的组成为：Gly、Phe(2)、Tyr、Met、Asp、Arg。用胰。用胰凝乳蛋白酶水解后可得一个三肽和一个凝乳蛋白酶水解后可得一个三肽和一个四肽，三肽组成为四肽，三肽组成为Phe、Tyr、Asp。此。此七肽经溴化氰处理后再经阳离子交换树七肽经溴化氰处理后再经阳离子交换树

35、脂层析并洗脱得一个组成为脂层析并洗脱得一个组成为Arg、Phe、Gly的三肽。此七肽经胰蛋白酶水解可得的三肽。此七肽经胰蛋白酶水解可得Phe，用，用FDNB反应后再水解测得反应后再水解测得DNP-Tyr，请确定该七肽的氨基酸顺序，并写，请确定该七肽的氨基酸顺序，并写出推导理由。出推导理由。蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系保守序列决定空间结构保守序列决定空间结构不同蛋白质之间的比较：相似结构相似不同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、不同结构不同功能功能、不同结构不同功能同一蛋白质不同状态的比较：一级结构同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间结构决定空间结构分子病和结构的

36、关系分子病和结构的关系保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不变，功能不变保守氨基酸不变，功能不变前胰岛素原前胰岛素原胰岛素原胰岛素原胰岛素胰岛素形成氢键的性能差异很大，引起形成氢键的性能差异很大，引起空间结构显著变化，水溶性明显空间结构显著变化，水溶性明显降低，血液粘性增大，产生贫血降低，血液粘性增大，产生贫血2-5 蛋白质的空间结构天然活性天然活性Pr都具有特征而稳定的三维结都具有特征而稳定的三维结构；一旦遭到破坏，生物功能完全丧失构；一旦遭到破坏，生物功能完全丧失是是Pr区别于普通有机分子最显著的特征区别于普通有机分子最显著的特征可分为二级结构

37、、三级结构和四级结构可分为二级结构、三级结构和四级结构X射线衍射法，高分辨核磁共振技术射线衍射法，高分辨核磁共振技术一级结构基础上形成，预测它的高级结一级结构基础上形成，预测它的高级结构；一级结构改变也将影响到高级结构构；一级结构改变也将影响到高级结构蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构指主链的空间排列，只涉及主链的构象指主链的空间排列，只涉及主链的构象及链内或链间形成的氢键及链内或链间形成的氢键两个相邻的肽键通过一个共同的两个相邻的肽键通过一个共同的碳原碳原子相子相连接，接，CN和和CC键可自由旋可自由旋转，可保持可保持肽键平面平面结构不构不变的条件下，形的条件下，形成不同的空成不同的空间结构构

38、氢键维持主持主链空空间排列排列主要有主要有螺旋、螺旋、折叠、折叠、转角及转角及无规则卷曲无规则卷曲螺旋螺旋结构构最常最常见，右手螺旋，相，右手螺旋，相邻螺圈之螺圈之间形成形成链内内氢键，氢键取向几乎与螺旋中心取向几乎与螺旋中心轴平行平行AA残基的残基的R基基团比比较小，不小，不带电荷，荷，则有利于形成和有利于形成和稳定；而脯定；而脯AA则使其中断使其中断折叠折叠两条或多条几乎完全伸展的两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排平行排列，通列，通过链间氢键交交联而成而成侧链垂直于折叠平面，交替分布于上下垂直于折叠平面，交替分布于上下两两侧几乎所有的几乎所有的肽键都参与了都参与了链间氢键交交联，比比较牢固

39、牢固有平行式和反平行式有平行式和反平行式110转角角非重复性非重复性结构，由四个氨基酸残基构，由四个氨基酸残基组成，成，形成一个不很形成一个不很稳定的定的环状状结构构主要存在于球状蛋白中，并位于分子表主要存在于球状蛋白中，并位于分子表面面无规则卷曲无规则卷曲无规律的松散肽链构象无规律的松散肽链构象明确而稳定；有序的非重复性结构明确而稳定；有序的非重复性结构常出现于酶活性部位或蛋白质特异功能常出现于酶活性部位或蛋白质特异功能部位部位超二级结构和结构域超二级结构和结构域超二级结构：若干相邻的二级结构单元超二级结构：若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规组合在一起，彼此相互作用，形

40、成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合体则、在空间上能辨认的二级结构组合体结构域：多肽链在二级结构或超二级结结构域：多肽链在二级结构或超二级结构基础上形成三级结构的局部折叠区，构基础上形成三级结构的局部折叠区，是相对独立、紧密、近似球状的实体，是相对独立、紧密、近似球状的实体，各自具有部分生物功能的结构各自具有部分生物功能的结构结构域之间有一段柔性肽链相连结构域之间有一段柔性肽链相连蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构肽链在空间进一步盘绕折叠形成的包括肽链在空间进一步盘绕折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构，主链和侧链构象在内的特征三维结构，不涉及肽链间的相互作用不涉及肽链间的相互作用多

41、是球状蛋白，形成亲水外壳和致密疏多是球状蛋白，形成亲水外壳和致密疏水核水核维系三维结构的力主要有维系三维结构的力主要有疏水键疏水键、离子、离子键、氢键和范德华力等键、氢键和范德华力等蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构具有三级结构的多肽链通过非共价键缔具有三级结构的多肽链通过非共价键缔合在一起形成的大分子合在一起形成的大分子亚基单独存在时常无活性，一般呈对称亚基单独存在时常无活性，一般呈对称性排列性排列精细有序结构，通过分子中的各种价键精细有序结构，通过分子中的各种价键来维持来维持蛋白质分子与某种物质结合或受到其它蛋白质分子与某种物质结合或受到其它理化因素影响，高级结构发生变化，其理化因素影响，高

42、级结构发生变化，其性质及生物功能也将随之发生变化性质及生物功能也将随之发生变化aabcccdef蛋白质的空间结构与功能的关系蛋白质的空间结构与功能的关系特定区域体现生物活性特定区域体现生物活性体现生物特异性体现生物特异性变构现象变构现象体现生物活性的可调节特性体现生物活性的可调节特性并非生物活性的唯一影响因素并非生物活性的唯一影响因素蛋白构象疾病：蛋白构象疾病：如：低温下酶活性低，如：低温下酶活性低，但并不影响构象；盐析但并不影响构象；盐析时沉淀的酶无活性，但时沉淀的酶无活性，但构象不变构象不变错误构象相互聚集，形成抗蛋白错误构象相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生水解酶的淀粉样纤

43、维沉淀，产生毒性而致病：如老年痴呆病、疯毒性而致病：如老年痴呆病、疯牛病、亨汀顿舞蹈病牛病、亨汀顿舞蹈病2-6 蛋白质的性质具有多肽的一切性质具有多肽的一切性质蛋白质的两性解离和等电点蛋白质的两性解离和等电点蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质蛋白质的变性与沉淀蛋白质的变性与沉淀蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应分子大小属于胶体质点范围分子大小属于胶体质点范围分子表面亲水基团形成水化层，阻碍聚集分子表面亲水基团形成水化层，阻碍聚集分子表面解离基团电荷相斥，阻碍聚集分子表面解离基团电荷相斥，阻碍聚集实质：天然构象解体实质：天然构象解体现象：活性丧失、基团暴露、现象：活性丧失、基团暴露、理化及生化性质改

44、变理化及生化性质改变温和变性的可逆反应温和变性的可逆反应复性复性可逆沉淀：温和条件下沉淀分离，如等电点沉可逆沉淀：温和条件下沉淀分离，如等电点沉 淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等不可逆沉淀：强烈条件破坏结构和性质而沉淀。不可逆沉淀：强烈条件破坏结构和性质而沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金 属盐沉淀、生物碱沉淀等属盐沉淀、生物碱沉淀等抗体抗原沉淀：互相识别结合而发生沉淀，抗体抗原沉淀：互相识别结合而发生沉淀， 是生物体免疫功能的基础是生物体免疫功能的基础变性蛋白不一定沉淀，变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性沉淀蛋白也不一定变性反应

45、反应颜色颜色反应物反应物双缩脲反应双缩脲反应紫红色紫红色肽键与硫酸铜肽键与硫酸铜米伦反应米伦反应白色沉淀加热变红白色沉淀加热变红酚羟基与硝酸汞等酚羟基与硝酸汞等米伦试剂米伦试剂黄色反应黄色反应白色沉淀加热变黄，白色沉淀加热变黄，加碱呈橙黄色加碱呈橙黄色苯环与硝酸苯环与硝酸乙醛酸反应乙醛酸反应紫色环紫色环吲哚基与乙醛酸和吲哚基与乙醛酸和浓硫酸反应浓硫酸反应坂口反应坂口反应红色红色胍基与次氯酸钠及胍基与次氯酸钠及-萘酚反应萘酚反应福林试剂反应福林试剂反应蓝色蓝色酚羟基与磷钼酸和酚羟基与磷钼酸和磷钨酸反应磷钨酸反应补充：几种重要的蛋白质类型纤维状蛋白：动物体支架和外保护成分纤维状蛋白：动物体支架和外

46、保护成分角蛋白角蛋白丝蛋白丝蛋白球状蛋白球状蛋白血红蛋白血红蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白血浆糖蛋白，脾肝淋巴等处合成，免疫反应产物血浆糖蛋白，脾肝淋巴等处合成，免疫反应产物抗原：外来的大分子物质侵入机体引起抗体产生抗原：外来的大分子物质侵入机体引起抗体产生半抗原：小分子与大分子结合后诱导抗体产生半抗原：小分子与大分子结合后诱导抗体产生抗体即免疫球蛋白抗体即免疫球蛋白特点：高度的特异性和多样性特点：高度的特异性和多样性Rh-RhRh进入胎盘进入胎盘生产、流产生产、流产新生儿溶血症新生儿溶血症2-7 蛋白质分离纯化的常用方法材料的预处理及细胞破碎材料的预处理及细胞破碎机械破碎、渗透破碎、反复冻融、超声

47、机械破碎、渗透破碎、反复冻融、超声波、酶波、酶蛋白质的抽提蛋白质的抽提缓冲液的缓冲液的pH、离子强度、成分、离子强度、成分蛋白质粗分离分级蛋白质粗分离分级透析和超滤、等电点沉淀法、盐析法、透析和超滤、等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法样品的细分离分级样品的细分离分级利用透析袋把大分子蛋白质与利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法小分子化合物分开的方法应用正压或离心力使蛋白质应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的溶液的目的电泳电泳凝胶过滤层析凝胶过滤层析离子交换层析离子交换层析亲

48、和层析亲和层析根据性质：蛋白质的两性解离根据性质：蛋白质的两性解离作用机理：异性电荷互相吸引作用机理：异性电荷互相吸引影响因素：电荷种类及数量、分子大影响因素：电荷种类及数量、分子大小及形状、溶液离子强度及小及形状、溶液离子强度及pH等等一种高效分离纯化一种高效分离纯化Pr的方法的方法不同的不同的Pr分子对于固定在载体上的特分子对于固定在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力殊配基具有不同的识别和结合能力配基有抗体、抗原、激素或受体配基有抗体、抗原、激素或受体Pr等等作业：总结本章的主要内容总结本章的主要内容某七肽某七肽AA组成：组成：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和和Ser。该肽与。该肽与DNFB反应不反应不能给出任何可采用的信息，除非首先与能给出任何可采用的信息，除非首先与胰凝乳蛋白酶反应，可产生胰凝乳蛋白酶反应，可产生DNP-Ser和和DNP-Lys，它们分别从属于，它们分别从属于Pro、Tyr、Ser以及以及Ala、Phe、Lys、Arg两个肽。两个肽。用胰蛋白酶处理可产生用胰蛋白酶处理可产生Arg、Ala以及以及Phe、Tyr、Lyr、Ser、Pro两个肽。请两个肽。请分析并确定该肽的分析并确定该肽的AA顺序。顺序。